Nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción
Enzymes that cleave DNA in specific ways
Dibujo de relleno de espacio de la fusión dimérica TALE-FokI (azul: TALE; verde: FokI) unida al ADN ( PDB : 1FOK, 3UGM ), por David Goodsell
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Las nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción ( TALEN ) son enzimas de restricción que pueden diseñarse para cortar secuencias específicas de ADN. Se obtienen fusionando un dominio de unión al ADN del efector TAL con un dominio de escisión del ADN (una nucleasa que corta cadenas de ADN). Los efectores de tipo activador de la transcripción (TALE) pueden diseñarse para unirse a prácticamente cualquier secuencia de ADN deseada, por lo que cuando se combinan con una nucleasa, el ADN puede cortarse en ubicaciones específicas. [1] Las enzimas de restricción pueden introducirse en las células, para su uso en la edición genética o para la edición genómica in situ , una técnica conocida como edición genómica con nucleasas diseñadas . Junto con las nucleasas de dedo de zinc y CRISPR/Cas9 , TALEN es una herramienta destacada en el campo de la edición genómica .

Dominio de unión al ADN de TALE

Los efectores TAL son proteínas secretadas por las bacterias Xanthomonas a través de su sistema de secreción de tipo III cuando infectan plantas . [2] El dominio de unión al ADN contiene una secuencia repetida altamente conservada de 33-34 aminoácidos con aminoácidos 12 y 13 divergentes. Estas dos posiciones, conocidas como residuo variable repetido (RVD), son altamente variables y muestran una fuerte correlación con el reconocimiento de nucleótidos específicos . [3] [4] Esta relación directa entre la secuencia de aminoácidos y el reconocimiento del ADN ha permitido la ingeniería de dominios de unión al ADN específicos mediante la selección de una combinación de segmentos repetidos que contienen los RVD apropiados. [1] En particular, los cambios leves en el RVD y la incorporación de secuencias de RVD "no convencionales" pueden mejorar la especificidad de la orientación. [5]

Dominio de escisión del ADN

El dominio de escisión de ADN no específico del extremo de la endonucleasa FokI se puede utilizar para construir nucleasas híbridas que son activas en un ensayo de levadura. [6] [7] Estos reactivos también son activos en células vegetales [8] [9] y en células animales. [9] [10] [11] [12] Los estudios TALEN iniciales utilizaron el dominio de escisión FokI de tipo salvaje, pero algunos estudios TALEN posteriores [11] [13] [14] también utilizaron variantes del dominio de escisión FokI con mutaciones diseñadas para mejorar la especificidad de escisión [15] [16] y la actividad de escisión. [17] El dominio FokI funciona como un dímero, requiriendo dos construcciones con dominios de unión de ADN únicos para sitios en el genoma objetivo con la orientación y el espaciado adecuados. Tanto el número de residuos de aminoácidos entre el dominio de unión del ADN de TALE y el dominio de escisión de FokI como el número de bases entre los dos sitios de unión individuales de TALEN parecen ser parámetros importantes para lograr altos niveles de actividad. [10] [18]

Ingeniería de construcciones TALEN

La simple relación entre la secuencia de aminoácidos y el reconocimiento de ADN del dominio de unión de TALE permite la ingeniería eficiente de proteínas. En este caso, la síntesis artificial de genes es problemática debido a la hibridación incorrecta de la secuencia repetitiva encontrada en el dominio de unión de TALE. [19] Una solución a esto es usar un programa de software disponible públicamente (DNAWorks [20] ) para calcular oligonucleótidos adecuados para el ensamblaje en un ensamblaje de oligonucleótidos de PCR de dos pasos seguido de la amplificación del gen completo. También se han informado varios esquemas de ensamblaje modular para generar construcciones TALE diseñadas. [9] [19] [21] [22] [23] [24] Ambos métodos ofrecen un enfoque sistemático para la ingeniería de dominios de unión de ADN que es conceptualmente similar al método de ensamblaje modular para generar dominios de reconocimiento de ADN de dedo de zinc .

Flujo de trabajo de edición genómica de Your Favorite Gene (YFG) utilizando TALEN. Se identifica la secuencia objetivo, se diseña una secuencia TALEN correspondiente y se inserta en un plásmido. El plásmido se inserta en la célula objetivo, donde se traduce para producir el TALEN funcional, que ingresa al núcleo y se une y corta la secuencia objetivo. Dependiendo de la aplicación, esto se puede utilizar para introducir un error (para eliminar un gen objetivo) o para introducir una nueva secuencia de ADN en el gen objetivo.

Transfección

Una vez que se han ensamblado los constructos de TALEN, se insertan en plásmidos ; luego, las células diana se transfectan con los plásmidos y los productos génicos se expresan y entran en el núcleo para acceder al genoma. Alternativamente, los constructos de TALEN se pueden administrar a las células como ARNm, lo que elimina la posibilidad de integración genómica de la proteína que expresa TALEN. El uso de un vector de ARNm también puede aumentar drásticamente el nivel de reparación dirigida por homología (HDR) y el éxito de la introgresión durante la edición genética.

Edición del genoma

Mecanismos

TALEN se puede utilizar para editar genomas induciendo roturas de doble cadena (DSB), a las que las células responden con mecanismos de reparación.

La unión de extremos no homólogos (NHEJ) liga directamente el ADN de ambos lados de una rotura de doble cadena donde hay muy poca o ninguna superposición de secuencias para la hibridación. Este mecanismo de reparación induce errores en el genoma a través de indels (inserción o deleción) o reordenamiento cromosómico; cualquiera de estos errores puede hacer que los productos génicos codificados en esa ubicación no sean funcionales. [10] Debido a que esta actividad puede variar según la especie, el tipo de célula, el gen diana y la nucleasa utilizada, debe controlarse al diseñar nuevos sistemas. Se puede ejecutar un ensayo de escisión de heterodúplex simple que detecta cualquier diferencia entre dos alelos amplificados por PCR. Los productos de escisión se pueden visualizar en geles de agarosa simples o sistemas de gel en placa.

Alternativamente, el ADN se puede introducir en un genoma a través de NHEJ en presencia de fragmentos de ADN bicatenario exógeno. [10]

La reparación dirigida por homología también puede introducir ADN extraño en la DSB, ya que las secuencias bicatenarias transfectadas se utilizan como plantillas para las enzimas de reparación. [10]

Aplicaciones

TALEN se ha utilizado para modificar de manera eficiente genomas de plantas, [25] creando cultivos alimentarios económicamente importantes con cualidades nutricionales favorables. [26] También se han aprovechado para desarrollar herramientas para la producción de biocombustibles . [27] Además, se ha utilizado para diseñar clones de células madre embrionarias humanas modificadas de manera estable y células madre pluripotentes inducidas (IPSC) y líneas celulares eritroides humanas, [11] [28] para generar C. elegans knockout , [12] ratas knockout , [13] ratones knockout, [29] y pez cebra knockout . [14] [30] Además, el método se puede utilizar para generar organismos knockin. Wu et al. obtuvieron un ganado knockin Sp110 usando nickasas de Talen para inducir una mayor resistencia a la tuberculosis. [31] Este enfoque también se ha utilizado para generar ratas knockin mediante microinyección de ARNm de TALEN en embriones unicelulares. [32]

TALEN también se ha utilizado experimentalmente para corregir los errores genéticos que subyacen a la enfermedad. [33] Por ejemplo, se ha utilizado in vitro para corregir los defectos genéticos que causan trastornos como la anemia de células falciformes , [28] [34] xeroderma pigmentosum , [35] y epidermólisis ampollosa . [36] Recientemente, se ha demostrado que TALEN se puede utilizar como herramienta para aprovechar el sistema inmunológico para combatir los cánceres; la focalización mediada por TALEN puede generar células T que son resistentes a los fármacos quimioterapéuticos y muestran actividad antitumoral. [37] [38]

En teoría, la especificidad de todo el genoma de las fusiones de TALEN diseñadas permite la corrección de errores en loci genéticos individuales a través de una reparación dirigida por homología a partir de una plantilla exógena correcta. [33] En realidad, sin embargo, la aplicación in situ de TALEN está actualmente limitada por la falta de un mecanismo de administración eficiente, factores inmunogénicos desconocidos e incertidumbre en la especificidad de la unión de TALEN. [33]

Otra aplicación emergente de TALEN es su capacidad de combinarse con otras herramientas de ingeniería genómica, como las meganucleasas . La región de unión al ADN de un efector TAL se puede combinar con el dominio de escisión de una meganucleasa para crear una arquitectura híbrida que combina la facilidad de ingeniería y la actividad de unión al ADN altamente específica de un efector TAL con la baja frecuencia de sitios y especificidad de una meganucleasa. [39]

En comparación con otras técnicas de edición genómica, TALEN se sitúa en el medio en términos de dificultad y coste. A diferencia de las ZFN , TALEN reconoce nucleótidos individuales. Es mucho más sencillo diseñar interacciones entre los dominios de unión al ADN de TALEN y sus nucleótidos diana que crear interacciones con las ZFN y sus tripletes de nucleótidos diana. [40] Por otro lado, CRISPR se basa en la formación de complejos de ribonucleótidos en lugar del reconocimiento de proteína/ADN. Los gRNA [ definición necesaria ] tienen ocasionalmente limitaciones en cuanto a viabilidad debido a la falta de sitios PAM [ definición necesaria ] en la secuencia diana y aunque se pueden producir de forma económica, el desarrollo actual ha llevado a una notable disminución del coste de las TALEN, de modo que se encuentran en un rango de precio y tiempo similar al de la edición genómica basada en CRISPR [ aclaración necesaria ] .

Precisión de la nucleasa efectora TAL

La actividad fuera del objetivo de una nucleasa activa puede provocar roturas no deseadas de la doble cadena y, en consecuencia, producir reordenamientos cromosómicos o muerte celular. Se han realizado estudios para comparar la toxicidad relativa asociada a la nucleasa de las tecnologías disponibles. Con base en estos estudios [18] y la distancia teórica máxima entre la unión del ADN y la actividad de la nucleasa, se cree que las construcciones TALEN tienen la mayor precisión de las tecnologías disponibles actualmente. [41]

Véase también

Referencias

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