Edición del genoma
Tipo de ingeniería genética
Las diferentes generaciones de nucleasas utilizadas para la edición del genoma y las vías de reparación del ADN utilizadas para modificar el ADN objetivo.

La edición genómica , o ingeniería genómica , o edición de genes , es un tipo de ingeniería genética en la que se inserta, elimina, modifica o reemplaza ADN en el genoma de un organismo vivo. A diferencia de las primeras técnicas de ingeniería genética que insertan aleatoriamente material genético en un genoma huésped, la edición genómica dirige las inserciones a ubicaciones específicas del sitio. El mecanismo básico involucrado en las manipulaciones genéticas a través de nucleasas programables es el reconocimiento de loci genómicos objetivo y la unión del dominio de unión al ADN efector (DBD), las roturas de doble cadena (DSB) en el ADN objetivo por las endonucleasas de restricción ( FokI y Cas ) y la reparación de las DSB a través de la recombinación dirigida por homología (HDR) o la unión de extremos no homólogos (NHEJ). [1] [2]

Historia

La edición genómica fue una actividad pionera en la década de 1990, [3] antes de la aparición de las plataformas de edición genética basadas en nucleasas, pero su uso se vio limitado por la baja eficiencia de la edición. La edición genómica con nucleasas modificadas, es decir, las tres clases principales de estas enzimas (nucleasas con dedos de cinc [ZFN], nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción [TALEN] y meganucleasas modificadas) fue seleccionada por Nature Methods como el método del año 2011. [4] El sistema CRISPR-Cas fue seleccionado por Science como el avance del año 2015. [5]

A partir de 2015, [actualizar]se utilizaron cuatro familias de nucleasas diseñadas: meganucleasas , nucleasas de dedo de zinc (ZFN), nucleasas basadas en efectores similares a activadores de transcripción (TALEN) y el sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas ( CRISPR / Cas9 ). [6] [7] [8] [9] En 2017, había nueve editores de genomas disponibles [actualizar]. [10]

En 2018, los métodos comunes para dicha edición utilizaban nucleasas diseñadas , o "tijeras moleculares". Estas nucleasas crean roturas de doble cadena específicas del sitio (DSB) en las ubicaciones deseadas en el genoma. Las roturas de doble cadena inducidas se reparan mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ) o recombinación homóloga (HR), lo que da como resultado mutaciones dirigidas ("ediciones").

En mayo de 2019, abogados en China informaron, a la luz de la supuesta creación por el científico chino He Jiankui de los primeros humanos editados genéticamente (ver la controversia de Lulu y Nana ), la redacción de regulaciones que establecen que cualquiera que manipule el genoma humano mediante técnicas de edición genética, como CRISPR , sería responsable de cualquier consecuencia adversa relacionada. [11] Recientemente se ha discutido una perspectiva cautelosa sobre los posibles puntos ciegos y riesgos de CRISPR y las biotecnologías relacionadas, [12] centrándose en la naturaleza estocástica de los procesos de control celular.

El Instituto Roslin de la Universidad de Edimburgo diseñó cerdos resistentes a un virus que causa el síndrome reproductivo y respiratorio porcino , que cuesta a los criadores de cerdos estadounidenses y europeos 2.600 millones de dólares anuales. [13]

En febrero de 2020, un ensayo estadounidense demostró que la edición genética CRISPR se había realizado de forma segura en tres pacientes con cáncer. [14] En 2020, se aprobó la venta en Japón de Sicilian Rouge High GABA, un tomate que produce más cantidad de un aminoácido que se dice que promueve la relajación. [13]

En 2021, Inglaterra (no el resto del Reino Unido) planeó eliminar las restricciones a las plantas y animales editados genéticamente, pasando de una regulación compatible con la Unión Europea a reglas más cercanas a las de los EE. UU. y algunos otros países. Un informe de la Comisión Europea de abril de 2021 encontró "fuertes indicios" de que el régimen regulatorio actual no era apropiado para la edición genética. [13] Más tarde en 2021, los investigadores anunciaron una alternativa a CRISPR, proteínas de actividad guiada por elementos móviles obligados (OMEGA) etiquetadas que incluyen IscB, IsrB y TnpB como endonucleasas que se encuentran en transposones y son guiadas por pequeños ωRNA. [15] [16]

Fondo

La ingeniería genética como método de introducción de nuevos elementos genéticos en los organismos ha existido desde la década de 1970. Un inconveniente de esta tecnología ha sido la naturaleza aleatoria con la que se inserta el ADN en el genoma del huésped , lo que puede dañar o alterar otros genes dentro del organismo. Sin embargo, se han descubierto varios métodos que dirigen los genes insertados a sitios específicos dentro del genoma de un organismo. [3] También ha permitido la edición de secuencias específicas dentro de un genoma, así como la reducción de los efectos fuera del objetivo. Esto podría usarse con fines de investigación, al dirigir mutaciones a genes específicos, y en terapia génica . Al insertar un gen funcional en un organismo y dirigirlo para reemplazar al defectuoso, podría ser posible curar ciertas enfermedades genéticas .

Orientación genética

Recombinación homóloga

Los primeros métodos para dirigir genes a ciertos sitios dentro de un genoma de un organismo (llamado orientación genética ) se basaban en la recombinación homóloga (HR). [17] Al crear construcciones de ADN que contienen una plantilla que coincide con la secuencia del genoma objetivo, es posible que los procesos de HR dentro de la célula inserten la construcción en la ubicación deseada. El uso de este método en células madre embrionarias condujo al desarrollo de ratones transgénicos con genes específicos eliminados . También ha sido posible introducir genes o alterar los patrones de expresión genética . [18] En reconocimiento a su descubrimiento de cómo se puede utilizar la recombinación homóloga para introducir modificaciones genéticas en ratones a través de células madre embrionarias, Mario Capecchi , Martin Evans y Oliver Smithies fueron galardonados con el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 2007. [19]

Orientación condicional

Si se elimina un gen vital, puede resultar letal para el organismo. Para estudiar la función de estos genes, se utilizaron recombinasas específicas de sitio (SSR). Los dos tipos más comunes son los sistemas Cre-LoxP y Flp-FRT . La recombinasa Cre es una enzima que elimina el ADN mediante recombinación homóloga entre secuencias de unión conocidas como sitios Lox-P. El sistema Flip-FRT funciona de manera similar, ya que la recombinasa Flip reconoce secuencias FRT. Al cruzar un organismo que contiene los sitios de recombinasa que flanquean el gen de interés con un organismo que expresa la SSR bajo el control de promotores específicos de tejido , es posible eliminar o activar genes solo en ciertas células. Estas técnicas también se utilizaron para eliminar genes marcadores de animales transgénicos. Otras modificaciones de estos sistemas permitieron a los investigadores inducir la recombinación solo en ciertas condiciones, lo que permite eliminar genes o expresarlos en momentos o etapas de desarrollo deseados . [18]

Proceso

Reparación de rotura de doble hebra

Vías de reparación de roturas de dsADN y edición genómica mediante nucleasas CRISPR-Cas

Una forma común de edición del genoma se basa en el concepto de mecanismos de reparación de roturas de doble cadena (DSB) del ADN. Existen dos vías principales que reparan las DSB: la unión de extremos no homólogos (NHEJ) y la reparación dirigida por homología (HDR). La NHEJ utiliza una variedad de enzimas para unir directamente los extremos del ADN, mientras que la HDR, más precisa, utiliza una secuencia homóloga como plantilla para la regeneración de las secuencias de ADN faltantes en el punto de rotura. Esto se puede aprovechar creando un vector con los elementos genéticos deseados dentro de una secuencia que sea homóloga a las secuencias flanqueantes de una DSB. Esto dará como resultado que el cambio deseado se inserte en el sitio de la DSB. Si bien la edición genética basada en HDR es similar a la selección de genes basada en recombinación homóloga, la tasa de recombinación aumenta al menos en tres órdenes de magnitud. [20]

Nucleasas diseñadas

Grupos de nucleasas modificadas. Los colores coincidentes indican patrones de reconocimiento de ADN.

La clave de la edición genómica es crear un DSB en un punto específico dentro del genoma. Las enzimas de restricción de uso común son eficaces para cortar el ADN, pero generalmente reconocen y cortan en múltiples sitios. Para superar este desafío y crear DSB en sitios específicos, hasta la fecha se han descubierto y bioingeniado tres clases distintas de nucleasas. Estas son las nucleasas de dedo de zinc ( ZFN ), las nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción ( TALEN ), las meganucleasas y el sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas ( CRISPR /Cas9).

Meganucleasas

Las meganucleasas , descubiertas a finales de los años 1980, son enzimas de la familia de las endonucleasas que se caracterizan por su capacidad de reconocer y cortar grandes secuencias de ADN (de 14 a 40 pares de bases). [21] Las meganucleasas más extendidas y conocidas son las proteínas de la familia LAGLIDADG, que deben su nombre a una secuencia de aminoácidos conservada .

Las meganucleasas, que se encuentran comúnmente en especies microbianas, tienen la propiedad única de tener secuencias de reconocimiento muy largas (>14 pb), lo que las hace naturalmente muy específicas. [22] [23] Sin embargo, prácticamente no hay posibilidad de encontrar la meganucleasa exacta requerida para actuar sobre una secuencia de ADN específica elegida. Para superar este desafío, se han utilizado métodos de mutagénesis y cribado de alto rendimiento para crear variantes de meganucleasas que reconocen secuencias únicas. [23] [24] Otros han podido fusionar varias meganucleasas y crear enzimas híbridas que reconocen una nueva secuencia. [25] [26] Otros han intentado alterar los aminoácidos que interactúan con el ADN de la meganucleasa para diseñar meganucleasas específicas de la secuencia en un método llamado meganucleasa diseñada racionalmente. [27] Otro enfoque implica el uso de modelos informáticos para intentar predecir con la mayor precisión posible la actividad de las meganucleasas modificadas y la especificidad de la secuencia nucleica reconocida. [28]

Se ha creado un gran banco que contiene varias decenas de miles de unidades proteínicas. Estas unidades pueden combinarse para obtener meganucleasas quiméricas que reconocen el sitio diana, proporcionando así herramientas de investigación y desarrollo que satisfacen una amplia gama de necesidades (investigación fundamental, salud, agricultura, industria, energía, etc.). Entre ellas, la producción a escala industrial de dos meganucleasas capaces de escindir el gen humano XPC; las mutaciones en este gen dan lugar al Xeroderma pigmentosum , un trastorno monogénico grave que predispone a los pacientes a cáncer de piel y quemaduras cuando su piel se expone a los rayos UV. [29]

Las meganucleasas tienen el beneficio de causar menos toxicidad en las células que métodos como la nucleasa de dedo de zinc (ZFN), probablemente debido a un reconocimiento de secuencia de ADN más estricto; [23] sin embargo, la construcción de enzimas específicas de secuencia para todas las secuencias posibles es costosa y requiere mucho tiempo, ya que uno no se beneficia de las posibilidades combinatorias que utilizan métodos como las ZFN y las fusiones basadas en TALEN.

Nucleasas de dedos de zinc

A diferencia de las meganucleasas, el concepto detrás de las ZFN y la tecnología TALEN se basa en un dominio catalítico de corte de ADN no específico, que luego se puede vincular a péptidos de reconocimiento de secuencias de ADN específicas, como dedos de zinc y efectores similares a activadores de la transcripción (TALE). [30] El primer paso para esto fue encontrar una endonucleasa cuyo sitio de reconocimiento de ADN y sitio de corte estuvieran separados entre sí, una situación que no es la más común entre las enzimas de restricción. [30] Una vez que se encontró esta enzima, su porción de corte podría separarse, lo que sería muy no específico ya que no tendría capacidad de reconocimiento. Esta porción podría luego vincularse a péptidos de reconocimiento de secuencias que podrían conducir a una especificidad muy alta.

Los motivos de dedos de cinc se encuentran en varios factores de transcripción . El ion cinc, presente en el 8% de todas las proteínas humanas, desempeña un papel importante en la organización de su estructura tridimensional. En los factores de transcripción, se encuentra con mayor frecuencia en los sitios de interacción proteína-ADN, donde estabiliza el motivo. La parte C-terminal de cada dedo es responsable del reconocimiento específico de la secuencia de ADN.

Las secuencias reconocidas son cortas, formadas por alrededor de 3 pares de bases, pero combinando de 6 a 8 dedos de zinc cuyos sitios de reconocimiento han sido caracterizados, es posible obtener proteínas específicas para secuencias de alrededor de 20 pares de bases. Por lo tanto, es posible controlar la expresión de un gen específico. Se ha demostrado que esta estrategia puede utilizarse para promover un proceso de angiogénesis en animales. [31] También es posible fusionar una proteína construida de esta manera con el dominio catalítico de una endonucleasa para inducir una rotura dirigida del ADN y, por lo tanto, utilizar estas proteínas como herramientas de ingeniería genómica. [32]

El método que se suele adoptar para ello consiste en asociar dos proteínas de unión al ADN (cada una de ellas con entre 3 y 6 dedos de cinc específicamente elegidos) con el dominio catalítico de la endonucleasa FokI , que necesita dimerizarse para escindir el ADN de doble cadena. Las dos proteínas reconocen dos secuencias de ADN que están separadas por unos pocos nucleótidos. La unión de las dos proteínas de dedos de cinc con sus respectivas secuencias acerca los dos dominios FokI. FokI requiere dimerización para tener actividad nucleasa, lo que significa que la especificidad aumenta drásticamente, ya que cada nucleasa asociada reconocería una secuencia de ADN única. Para mejorar este efecto, se han diseñado nucleasas FokI que solo pueden funcionar como heterodímeros. [33]

Se utilizan varios enfoques para diseñar nucleasas de dedo de zinc específicas para las secuencias elegidas. El más extendido implica la combinación de unidades de dedo de zinc con especificidades conocidas (ensamblaje modular). Se han desarrollado varias técnicas de selección, utilizando bacterias, levaduras o células de mamíferos para identificar las combinaciones que ofrecen la mejor especificidad y la mejor tolerancia celular. Aunque no se ha informado de la caracterización directa de la actividad de la nucleasa de dedo de zinc en todo el genoma, un ensayo que mide el número total de roturas de ADN de doble cadena en células encontró que solo una o dos de esas roturas ocurren por encima del fondo en células tratadas con nucleasas de dedo de zinc con un sitio de reconocimiento compuesto de 24 pb y dominios de nucleasa FokI heterodímeros obligados . [33]

Las nucleasas que funcionan como heterodímeros evitarían la posibilidad de una actividad no deseada de los homodímeros y, por lo tanto, aumentarían la especificidad del DSB. Aunque las porciones de nucleasa de las construcciones ZFN y TALEN tienen propiedades similares, la diferencia entre estas nucleasas diseñadas está en su péptido de reconocimiento de ADN. Las ZFN se basan en los dedos de zinc Cys2-His2 y las construcciones TALEN en los TALE. Ambos dominios de péptidos que reconocen ADN tienen la característica de que se encuentran naturalmente en combinaciones en sus proteínas. Los dedos de zinc Cys2-His2 suelen aparecer en repeticiones que están separadas por 3 pb y se encuentran en diversas combinaciones en una variedad de proteínas que interactúan con ácidos nucleicos, como los factores de transcripción . Cada dedo del dominio de dedos de zinc es completamente independiente y la capacidad de unión de un dedo se ve afectada por su vecino. Por otro lado, los TALE se encuentran en repeticiones con una relación de reconocimiento de uno a uno entre los aminoácidos y los pares de nucleótidos reconocidos. Debido a que tanto los dedos de zinc como los TALE ocurren en patrones repetidos, se pueden probar diferentes combinaciones para crear una amplia variedad de especificidades de secuencia. [22] Los dedos de zinc se han establecido más en estos términos y se han utilizado enfoques como el ensamblaje modular (donde los dedos de zinc correlacionados con una secuencia de tripletes se unen en una fila para cubrir la secuencia requerida), OPEN (selección de baja rigurosidad de dominios peptídicos frente a nucleótidos de tripletes seguido de selecciones de alta rigurosidad de combinación de péptidos frente al objetivo final en sistemas bacterianos) y la detección bacteriana de un híbrido de bibliotecas de dedos de zinc, entre otros métodos, para crear nucleasas específicas del sitio.

Las nucleasas de dedo de cinc son herramientas de investigación y desarrollo que ya se han utilizado para modificar diversos genomas, en particular en los laboratorios del Consorcio Zinc Finger. La empresa estadounidense Sangamo BioSciences utiliza las nucleasas de dedo de cinc para llevar a cabo investigaciones sobre la ingeniería genética de células madre y la modificación de células inmunitarias con fines terapéuticos. [34] [35] Los linfocitos T modificados se encuentran actualmente en fase I de ensayos clínicos para tratar un tipo de tumor cerebral ( glioblastoma ) y en la lucha contra el sida. [33]

TALEN

Visión general del proceso TALEN

Las nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción (TALEN) son proteínas de unión al ADN específicas que presentan una matriz de repeticiones de 33 o 34 aminoácidos. Las TALEN son enzimas de restricción artificiales diseñadas fusionando el dominio de corte de ADN de una nucleasa con dominios TALE, que pueden adaptarse para reconocer específicamente una secuencia de ADN única. Estas proteínas de fusión sirven como "tijeras de ADN" fácilmente dirigibles para aplicaciones de edición genética que permiten realizar modificaciones genómicas específicas, como inserción, eliminación, reparación y reemplazo de secuencias en células vivas. [36] Los dominios de unión al ADN, que pueden diseñarse para unirse a cualquier secuencia de ADN deseada, provienen de los efectores TAL , proteínas de unión al ADN excretadas por la aplicación Xanthomanos patógena de plantas. Los efectores TAL consisten en dominios repetidos, cada uno de los cuales contiene una secuencia altamente conservada de 34 aminoácidos, y reconocen un solo nucleótido de ADN dentro del sitio objetivo. La nucleasa puede crear roturas de doble cadena en el sitio diana que pueden repararse mediante la unión de extremos no homólogos propensos a errores (NHEJ), lo que da lugar a alteraciones genéticas mediante la introducción de pequeñas inserciones o deleciones. Cada repetición se conserva, con la excepción de los denominados residuos variables de repetición (RVD) en las posiciones de aminoácidos 12 y 13. Los RVD determinan la secuencia de ADN a la que se unirá el TALE. Esta simple correspondencia uno a uno entre las repeticiones de TALE y la secuencia de ADN correspondiente hace que el proceso de ensamblaje de matrices de repeticiones para reconocer nuevas secuencias de ADN sea sencillo. Estos TALE se pueden fusionar al dominio catalítico de una nucleasa de ADN, FokI, para generar una nucleasa efectora similar a un activador de la transcripción (TALEN). Las construcciones TALEN resultantes combinan especificidad y actividad, generando de manera eficaz nucleasas específicas de secuencia diseñadas que se unen y cortan secuencias de ADN solo en sitios preseleccionados. El sistema de reconocimiento de dianas TALEN se basa en un código fácil de predecir. Las nucleasas TAL son específicas de su diana debido en parte a la longitud de su sitio de unión de más de 30 pares de bases. La TALEN se puede realizar dentro de un rango de 6 pares de bases de cualquier nucleótido individual en todo el genoma. [37]

Las construcciones TALEN se utilizan de manera similar a las nucleasas de dedo de zinc diseñadas y tienen tres ventajas en la mutagénesis dirigida: (1) la especificidad de unión al ADN es mayor, (2) los efectos fuera del objetivo son menores y (3) la construcción de dominios de unión al ADN es más fácil.

Crispr

Las CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas) son elementos genéticos que las bacterias utilizan como una especie de inmunidad adquirida para protegerse contra los virus. Consisten en secuencias cortas que se originan a partir de genomas virales y se han incorporado al genoma bacteriano. Las Cas (proteínas asociadas a CRISPR) procesan estas secuencias y cortan las secuencias de ADN viral coincidentes. Al introducir plásmidos que contienen genes Cas y CRISPR específicamente construidos en células eucariotas, el genoma eucariota se puede cortar en cualquier posición deseada. [38]

Edición por modificación de nucleobases (Edición de bases)

Uno de los primeros métodos de edición eficiente de ácidos nucleicos emplea enzimas modificadoras de nucleobases dirigidas por secuencias guía de ácidos nucleicos. Se describió por primera vez en la década de 1990 y ha resurgido más recientemente. [3] [39] [40] [41] Este método tiene la ventaja de que no requiere romper las cadenas de ADN genómico y, por lo tanto, evita la inserción y las eliminaciones aleatorias asociadas con la rotura de cadenas de ADN. Solo es apropiado para la edición precisa que requiere cambios de un solo nucleótido y se ha demostrado que es muy eficiente para este tipo de edición. [41] [42]

Arco

ARCUT significa cortador artificial de ADN de restricción, es una técnica desarrollada por Komiyama. Este método utiliza ácido nucleico peptídico pseudocomplementario (pcPNA), para identificar el sitio de corte dentro del cromosoma. Una vez que el pcPNA especifica el sitio, se realiza la escisión con cerio (CE) y EDTA (mezcla química), que realiza la función de corte y empalme. [43]

Precisión y eficiencia de las nucleasas diseñadas

El método de edición genética con meganucleasas es el menos eficiente de los métodos mencionados anteriormente. Debido a la naturaleza de su elemento de unión al ADN y del elemento de escisión, está limitado a reconocer un objetivo potencial cada 1000 nucleótidos. [9] La ZFN se desarrolló para superar las limitaciones de las meganucleasas. El número de objetivos posibles que puede reconocer la ZFN se incrementó a uno cada 140 nucleótidos. [9] Sin embargo, ambos métodos son impredecibles debido a que sus elementos de unión al ADN se afectan entre sí. Como resultado, se requieren altos grados de experiencia y procesos de validación largos y costosos.

Las nucleasas TALE son el método más preciso y específico y ofrecen una mayor eficiencia que los dos métodos anteriores. Esta eficiencia se logra porque el elemento de unión al ADN consiste en una serie de subunidades TALE, cada una de las cuales tiene la capacidad de reconocer una cadena de nucleótidos de ADN específica independientemente de las demás, lo que da como resultado un mayor número de sitios objetivo con alta precisión. La creación de nuevas nucleasas TALE requiere aproximadamente una semana y unos pocos cientos de dólares, y se requiere experiencia específica en biología molecular e ingeniería de proteínas. [9]

Las nucleasas CRISPR tienen una precisión ligeramente inferior en comparación con las nucleasas TALE. Esto se debe a la necesidad de tener un nucleótido específico en un extremo para producir el ARN guía que CRISPR utiliza para reparar la rotura de doble cadena que induce. Se ha demostrado que es el método más rápido y económico, ya que cuesta menos de doscientos dólares y unos pocos días. [9] CRISPR también requiere la menor cantidad de experiencia en biología molecular, ya que el diseño se basa en el ARN guía en lugar de las proteínas. Una de las principales ventajas que CRISPR tiene sobre los métodos ZFN y TALEN es que puede dirigirse para apuntar a diferentes secuencias de ADN utilizando sus sgRNA CRISPR de ~80 nt, mientras que tanto el método ZFN como el TALEN requerían la construcción y prueba de las proteínas creadas para apuntar a cada secuencia de ADN. [44]

Debido a que la actividad fuera del objetivo de una nucleasa activa tendría consecuencias potencialmente peligrosas a nivel genético y de organismo, la precisión de las meganucleasas, las ZFN, las CRISPR y las fusiones basadas en TALEN ha sido un área activa de investigación. Si bien se han informado cifras variables, las ZFN tienden a tener más citotoxicidad que los métodos TALEN o las nucleasas guiadas por ARN, mientras que los enfoques TALEN y guiados por ARN tienden a tener la mayor eficiencia y menos efectos fuera del objetivo. [45] Con base en la distancia teórica máxima entre la unión del ADN y la actividad de la nucleasa, los enfoques TALEN dan como resultado la mayor precisión. [9]

Ingeniería genómica automatizada multiplex (MAGE)

El ADN sintético se introduce repetidamente en múltiples áreas específicas del cromosoma y/o loci y luego se replica produciendo células con/sin mutaciones.

Los métodos que utilizaban los científicos e investigadores para estudiar la diversidad genómica y todos los fenotipos asociados posibles eran muy lentos, costosos e ineficientes. Antes de esta nueva revolución, los investigadores tenían que hacer manipulaciones de un solo gen y modificar el genoma una pequeña sección a la vez, observar el fenotipo y comenzar el proceso de nuevo con una manipulación de un solo gen diferente. [46] Por lo tanto, los investigadores del Instituto Wyss de la Universidad de Harvard diseñaron MAGE, una poderosa tecnología que mejora el proceso de edición genómica in vivo. Permite manipulaciones rápidas y eficientes de un genoma, todo ello en una máquina lo suficientemente pequeña como para colocarla sobre una mesa de cocina pequeña. Esas mutaciones se combinan con la variación que se produce naturalmente durante la mitosis celular creando miles de millones de mutaciones celulares.

El ADN monocatenario sintético (ssDNA) combinado químicamente y un grupo de oligonucleótidos se introducen en áreas específicas de la célula, creando así modificaciones genéticas. El proceso cíclico implica la transformación del ssDNA (por electroporación ) seguida de la excrecencia, durante la cual las proteínas de recombinación homóloga de bacteriófagos median la hibridación de los ssDNA con sus objetivos genómicos. Los experimentos dirigidos a marcadores fenotípicos selectivos se examinan e identifican colocando las células en medios diferenciales. Cada ciclo finalmente tarda 2,5 horas en procesarse, con tiempo adicional necesario para hacer crecer cultivos isogénicos y caracterizar las mutaciones. Al introducir iterativamente bibliotecas de ssDNA mutagénicos dirigidos a múltiples sitios, MAGE puede generar diversidad genética combinatoria en una población celular. Puede haber hasta 50 ediciones del genoma, desde pares de bases de un solo nucleótido hasta genoma completo o redes de genes simultáneamente con resultados en cuestión de días. [46]

Los experimentos MAGE se pueden dividir en tres clases, caracterizadas por distintos grados de escala y complejidad: (i) muchos sitios objetivo, mutaciones genéticas únicas; (ii) sitio objetivo único, muchas mutaciones genéticas; y (iii) muchos sitios objetivo, muchas mutaciones genéticas. [46] Un ejemplo de la clase tres se reflejó en 2009, donde Church y sus colegas pudieron programar Escherichia coli para producir cinco veces la cantidad normal de licopeno, un antioxidante que normalmente se encuentra en las semillas de tomate y está vinculado a propiedades anticancerígenas. Aplicaron MAGE para optimizar la vía metabólica de la 1-desoxi- D -xilulosa 5-fosfato (DXP) en Escherichia coli para sobreproducir licopeno isoprenoide. Les llevó alrededor de 3 días y poco más de $1,000 en materiales. La facilidad, velocidad y eficiencia de costos en que MAGE puede alterar los genomas puede transformar la forma en que las industrias abordan la fabricación y producción de compuestos importantes en las industrias de bioingeniería, bioenergía, ingeniería biomédica, biología sintética, farmacéutica, agrícola y química.

Aplicaciones

Plantas, animales y genes humanos que se han identificado con éxito mediante ZFN, lo que demuestra la generalidad de este enfoque

A partir de 2012, se había desarrollado una edición genómica eficiente para una amplia gama de sistemas experimentales que iban desde plantas hasta animales, a menudo más allá del interés clínico, y se estaba convirtiendo en una estrategia experimental estándar en los laboratorios de investigación. [47] La ​​reciente generación de mutantes mediados por ZFN en ratas, peces cebra , maíz y tabaco y las mejoras en los enfoques basados ​​en TALEN dan testimonio de la importancia de los métodos, y la lista se está expandiendo rápidamente. La edición genómica con nucleasas diseñadas probablemente contribuirá a muchos campos de las ciencias de la vida, desde el estudio de las funciones genéticas en plantas y animales hasta la terapia génica en humanos. Por ejemplo, es probable que el campo de la biología sintética que tiene como objetivo diseñar células y organismos para realizar funciones novedosas, se beneficie de la capacidad de la nucleasa diseñada para agregar o eliminar elementos genómicos y, por lo tanto, crear sistemas complejos. [47] Además, las funciones genéticas se pueden estudiar utilizando células madre con nucleasas diseñadas.

A continuación se enumeran algunas tareas específicas que este método puede llevar a cabo:

Modificación genética dirigida en animales

La combinación de los recientes descubrimientos en ingeniería genética, en particular la edición de genes, y las últimas mejoras en las tecnologías de reproducción bovina (por ejemplo, el cultivo de embriones in vitro ) permite la edición genómica directamente en ovocitos fertilizados utilizando endonucleasas sintéticas altamente específicas. Las endonucleasas guiadas por ARN: repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas asociadas a Cas9 (CRISPR/Cas9) son una nueva herramienta que aumenta aún más la gama de métodos disponibles . En particular, las endonucleasas diseñadas con CRISPR/Cas9 permiten el uso de múltiples ARN guía para knockouts simultáneos (KO) en un solo paso mediante inyección directa citoplasmática (CDI) en cigotos de mamíferos. [48]

Además, la edición genética puede aplicarse a ciertos tipos de peces en la acuicultura, como el salmón del Atlántico. La edición genética en peces es actualmente experimental, pero las posibilidades incluyen el crecimiento, la resistencia a las enfermedades, la esterilidad, la reproducción controlada y el color. La selección de estos rasgos puede permitir un entorno más sostenible y un mayor bienestar para los peces. [49]

El salmón AquAdvantage es un salmón del Atlántico modificado genéticamente desarrollado por AquaBounty Technologies. El gen regulador de la hormona del crecimiento del salmón del Atlántico se reemplaza por el gen regulador de la hormona del crecimiento del salmón Chinook del Pacífico y una secuencia promotora de la faneca oceánica [50].

Gracias al desarrollo paralelo de la transcriptómica unicelular, la edición genómica y los nuevos modelos de células madre, estamos entrando en un período científicamente apasionante en el que la genética funcional ya no se limita a los modelos animales, sino que se puede realizar directamente en muestras humanas. El análisis de la expresión génica de células unicelulares ha resuelto una hoja de ruta transcripcional del desarrollo humano a partir de la cual se están identificando genes candidatos clave para estudios funcionales. Utilizando datos transcriptómicos globales para guiar la experimentación, la herramienta de edición genómica basada en CRISPR ha hecho posible alterar o eliminar genes clave para dilucidar la función en un entorno humano. [51]

Modificación genética dirigida en plantas

Descripción general del flujo de trabajo y las posibilidades de edición de GEEN

La edición del genoma mediante meganucleasas , [52] ZFN y TALEN proporciona una nueva estrategia para la manipulación genética en plantas y es probable que ayude en la ingeniería de rasgos deseados de las plantas modificando genes endógenos. Por ejemplo, la adición de genes específicos del sitio en las principales especies de cultivos se puede utilizar para el "apilamiento de rasgos", mediante el cual varios rasgos deseados se vinculan físicamente para asegurar su cosegregación durante los procesos de mejoramiento. [33] Recientemente se ha informado de avances en estos casos en Arabidopsis thaliana [53] [54] [55] y Zea mays . En Arabidopsis thaliana , utilizando la orientación genética asistida por ZFN, se introdujeron dos genes resistentes a herbicidas (acetolactato sintasa de tabaco SuRA y SuRB) en loci SuR con hasta un 2% de células transformadas con mutaciones. [53] En Zea mays, la interrupción del locus objetivo se logró mediante DSB inducidos por ZFN y el NHEJ resultante. En este caso, también se utilizó ZFN para introducir el casete de expresión génica de tolerancia a herbicidas (PAT) en el locus endógeno objetivo IPK1. [56] Se ha demostrado que dicha modificación del genoma observada en las plantas regeneradas es hereditaria y se transmitió a la siguiente generación. [56] Un ejemplo potencialmente exitoso de la aplicación de técnicas de edición genómica en la mejora de cultivos se puede encontrar en el banano, donde los científicos utilizaron la edición CRISPR/Cas9 para inactivar el virus endógeno del rayado del banano en el genoma B del banano ( Musa spp. ) para superar un importante desafío en el mejoramiento del banano. [57]

Además, la ingeniería genómica basada en TALEN se ha probado y optimizado ampliamente para su uso en plantas. [58] Las fusiones de TALEN también han sido utilizadas por una empresa estadounidense de ingredientes alimentarios, Calyxt, [59] para mejorar la calidad de los productos de aceite de soja [60] y para aumentar el potencial de almacenamiento de las patatas [61].

Es necesario realizar varias optimizaciones para mejorar la edición de genomas de plantas mediante la focalización mediada por ZFN. [62] Es necesario un diseño confiable y una prueba posterior de las nucleasas, la ausencia de toxicidad de las nucleasas, la elección apropiada del tejido vegetal para la focalización, las rutas de inducción de la actividad enzimática, la falta de mutagénesis fuera del objetivo y una detección confiable de casos mutados. [62]

Un método común de administración de CRISPR/Cas9 en plantas es la transformación basada en Agrobacterium . [63] El T-ADN se introduce directamente en el genoma de la planta mediante un mecanismo T4SS. Los casetes de expresión basados ​​en Cas9 y gRNA se convierten en plásmidos Ti , que se transforman en Agrobacterium para su aplicación en plantas. [63] Para mejorar la administración de Cas9 en plantas vivas, se están utilizando virus para una administración de transgenes más eficaz. [63]

Parte de una serie de artículos sobre
Biología sintética
Circuitos biológicos sintéticos
Edición del genoma
Células artificiales
Xenobiología
Otros temas

Investigación

Terapia génica

La práctica ideal de terapia génica es aquella que reemplaza el gen defectuoso con un alelo normal en su ubicación natural. Esto es ventajoso con respecto a un gen administrado por virus, ya que no es necesario incluir las secuencias codificantes y reguladoras completas cuando solo es necesario alterar una pequeña proporción del gen, como suele ser el caso. [64] [65] La expresión de los genes parcialmente reemplazados también es más coherente con la biología celular normal que los genes completos que son transportados por vectores virales.

El primer uso clínico de la edición genómica basada en TALEN fue en el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda CD19+ en un niño de 11 meses en 2015. Se diseñaron células T de donantes modificadas para atacar a las células leucémicas, para que fueran resistentes al alemtuzumab y para evadir la detección por parte del sistema inmunológico del huésped después de la introducción. [66] [67]

Se han realizado investigaciones exhaustivas en células y animales utilizando CRISPR-Cas9 para intentar corregir mutaciones genéticas que causan enfermedades genéticas como el síndrome de Down, la espina bífida, la anencefalia y los síndromes de Turner y Klinefelter. [68]

En febrero de 2019, los científicos médicos que trabajan con Sangamo Therapeutics , con sede en Richmond, California , anunciaron la primera terapia de edición genética humana "en el cuerpo" para alterar permanentemente el ADN , en un paciente con síndrome de Hunter . [69] Los ensayos clínicos de Sangamo que involucran la edición genética utilizando Zinc Finger Nuclease (ZFN) están en curso. [70]

Erradicar enfermedades

Los investigadores han utilizado impulsores genéticos CRISPR-Cas9 para modificar genes asociados con la esterilidad en A. gambiae , el vector de la malaria. [71] Esta técnica tiene más implicaciones en la erradicación de otras enfermedades transmitidas por vectores como la fiebre amarilla, el dengue y el Zika. [72]

El sistema CRISPR-Cas9 puede programarse para modular la población de cualquier especie bacteriana al actuar sobre genotipos clínicos o aislados epidemiológicos. Puede habilitar selectivamente las especies bacterianas beneficiosas en lugar de las dañinas al eliminar patógenos, lo que le da una ventaja sobre los antibióticos de amplio espectro. [46]

Las aplicaciones antivirales para terapias dirigidas a virus humanos como el VIH, el herpes y el virus de la hepatitis B están bajo investigación. CRISPR se puede utilizar para dirigirse al virus o al huésped para alterar los genes que codifican las proteínas receptoras de la superficie celular del virus. [44] En noviembre de 2018, He Jiankui anunció que había editado dos embriones humanos, para intentar desactivar el gen para CCR5 , que codifica un receptor que el VIH usa para ingresar a las células. Dijo que las niñas gemelas, Lulu y Nana , habían nacido unas semanas antes. Dijo que las niñas todavía tenían copias funcionales de CCR5 junto con CCR5 desactivado ( mosaicismo ) y aún eran vulnerables al VIH. El trabajo fue ampliamente condenado como poco ético, peligroso y prematuro. [73]

En enero de 2019, científicos en China informaron sobre la creación de cinco monos idénticos clonados mediante edición genética, utilizando la misma técnica de clonación que se utilizó con Zhong Zhong y Hua Hua (los primeros monos clonados) y la oveja Dolly , y la misma técnica de edición genética Crispr - Cas9 supuestamente utilizada por He Jiankui para crear a los primeros bebés humanos modificados genéticamente, Lulu y Nana . Los clones de monos se crearon para estudiar varias enfermedades médicas. [74] [75]

Perspectivas y limitaciones

En el futuro, un objetivo importante de la investigación sobre edición genómica con nucleasas modificadas genéticamente debe ser la mejora de la seguridad y especificidad de la acción de las nucleasas. [76] Por ejemplo, mejorar la capacidad de detectar eventos fuera del objetivo puede mejorar nuestra capacidad de aprender sobre formas de prevenirlos. Además, los dedos de zinc utilizados en las ZFN rara vez son completamente específicos y algunos pueden causar una reacción tóxica. Sin embargo, se ha informado que la toxicidad se reduce mediante modificaciones realizadas en el dominio de escisión de la ZFN. [65]

Además, las investigaciones de Dana Carroll sobre la modificación del genoma con nucleasas modificadas genéticamente han demostrado la necesidad de comprender mejor la maquinaria básica de recombinación y reparación del ADN. En el futuro, un posible método para identificar dianas secundarias sería capturar los extremos rotos de las células que expresan las ZFN y secuenciar el ADN flanqueante mediante una secuenciación de alto rendimiento. [65]

Debido a la facilidad de uso y la relación costo-beneficio de CRISPR, actualmente se están realizando investigaciones exhaustivas al respecto. Actualmente, existen más publicaciones sobre CRISPR que sobre ZFN y TALEN a pesar de lo reciente que es el descubrimiento de CRISPR. [44] Tanto CRISPR como TALEN son las opciones preferidas para implementarse en producciones a gran escala debido a su precisión y eficiencia.

La edición genómica también se produce como un proceso natural sin ingeniería genética artificial. Los agentes capaces de editar los códigos genéticos son los virus o los agentes ARN subvirales.

Aunque GEEN tiene una mayor eficiencia que muchos otros métodos en genética inversa, todavía no es muy eficiente; en muchos casos, menos de la mitad de las poblaciones tratadas obtienen los cambios deseados. [53] Por ejemplo, cuando uno planea usar el NHEJ de la célula para crear una mutación, los sistemas HDR de la célula también estarán trabajando corrigiendo el DSB con tasas de mutación más bajas.

Tradicionalmente, los ratones han sido la opción más común para los investigadores como hospedadores de un modelo de enfermedad. CRISPR puede ayudar a cerrar la brecha entre este modelo y los ensayos clínicos en humanos mediante la creación de modelos de enfermedades transgénicas en animales más grandes, como cerdos, perros y primates no humanos. [77] [78] Utilizando el sistema CRISPR-Cas9, la proteína Cas9 programada y el sgRNA pueden introducirse directamente en cigotos fertilizados para lograr las modificaciones genéticas deseadas al crear modelos transgénicos en roedores. Esto permite omitir la etapa habitual de selección de células para generar líneas transgénicas y, como resultado, reduce el tiempo de generación en un 90%. [78]

Un potencial que aporta la CRISPR con su eficacia es la aplicación de xenotrasplantes. En ensayos de investigación anteriores, la CRISPR demostró la capacidad de atacar y eliminar retrovirus endógenos, lo que reduce el riesgo de transmisión de enfermedades y reduce las barreras inmunológicas. [44] La eliminación de estos problemas mejora la función del órgano donado, lo que acerca esta aplicación a una realidad.

En el caso de las plantas, la edición genómica se considera una solución viable para la conservación de la biodiversidad. Los impulsores genéticos son una herramienta potencial para alterar la tasa reproductiva de las especies invasoras , aunque conllevan riesgos significativos. [79]

Mejora humana

Muchos transhumanistas ven la edición genómica como una herramienta potencial para la mejora humana . [80] [81] [82] El biólogo australiano y profesor de genética David Andrew Sinclair señala que "las nuevas tecnologías con edición genómica permitirán que se utilice en individuos (...) para tener (...) hijos más sanos" - bebés de diseño . [83] Según un informe de septiembre de 2016 del Consejo Nuffield de Bioética en el futuro puede ser posible mejorar a las personas con genes de otros organismos o genes totalmente sintéticos para, por ejemplo, mejorar la visión nocturna y el sentido del olfato . [84] [85] George Church ha compilado una lista de posibles modificaciones genéticas para rasgos posiblemente ventajosos como una menor necesidad de dormir , cambios relacionados con la cognición que protegen contra la enfermedad de Alzheimer, resistencias a las enfermedades y capacidades de aprendizaje mejoradas junto con algunos de los estudios asociados y posibles efectos negativos. [86] [87]

En febrero de 2017, la Academia Nacional de Ciencias y la Academia Nacional de Medicina de Estados Unidos emitieron un informe en el que respaldaban con reservas la edición del genoma humano. [88] Recomendaron que algún día se permitieran los ensayos clínicos de edición del genoma una vez que se hayan encontrado respuestas a los problemas de seguridad y eficiencia, "pero solo para enfermedades graves bajo una estricta supervisión". [89]

Riesgos

En la declaración de 2016 de la Comunidad de Inteligencia de Estados Unidos sobre la Evaluación de Amenazas Mundiales , el Director de Inteligencia Nacional de Estados Unidos, James R. Clapper , nombró la edición genómica como un arma potencial de destrucción masiva , afirmando que la edición genómica realizada por países con estándares regulatorios o éticos "diferentes a los de los países occidentales" probablemente aumenta el riesgo de creación de agentes o productos biológicos dañinos. Según la declaración, la amplia distribución, el bajo costo y el ritmo acelerado de desarrollo de esta tecnología, su mal uso deliberado o no intencional podría llevar a implicaciones económicas y de seguridad nacional de gran alcance. [90] [91] [92] Por ejemplo, tecnologías como CRISPR podrían usarse para crear "mosquitos asesinos" que causen plagas que arrasen con los cultivos básicos. [92]

Según un informe de septiembre de 2016 del Consejo Nuffield de Bioética , la simplicidad y el bajo coste de las herramientas para editar el código genético permitirán a los aficionados –o “ biohackers ”– realizar sus propios experimentos, lo que plantea un riesgo potencial por la liberación de microbios genéticamente modificados. El estudio también concluyó que los riesgos y beneficios de modificar el genoma de una persona –y que esos cambios se transmitan a las generaciones futuras– son tan complejos que exigen un escrutinio ético urgente. Esas modificaciones podrían tener consecuencias no deseadas que podrían dañar no solo al niño, sino también a sus futuros hijos, ya que el gen alterado estaría en su esperma o en sus óvulos. [84] [85] En 2001, los investigadores australianos Ronald Jackson e Ian Ramshaw fueron criticados por publicar un artículo en el Journal of Virology que exploraba el posible control de los ratones, una plaga importante en Australia, al infectarlos con un virus de la viruela del ratón alterado que causaría infertilidad, ya que la información confidencial proporcionada podría conducir a la fabricación de armas biológicas por parte de bioterroristas potenciales que podrían usar el conocimiento para crear cepas resistentes a las vacunas de otros virus de la viruela, como la viruela , que podrían afectar a los humanos. [85] [93] Además, existen preocupaciones adicionales sobre los riesgos ecológicos de liberar impulsores genéticos en poblaciones silvestres. [85] [94] [95]

Premio Nobel

En 2007, el Premio Nobel de Fisiología o Medicina fue otorgado a Mario Capecchi, Martin Evans y Oliver Smithies "por sus descubrimientos de principios para introducir modificaciones genéticas específicas en ratones mediante el uso de células madre embrionarias". [19]

En 2020, el Premio Nobel de Química fue otorgado a Emmanuelle Charpentier y Jennifer Doudna por "el desarrollo de un método de edición del genoma". [96]

Véase también

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