Meganucleasa

Las meganucleasas son endodesoxirribonucleasas que se caracterizan por un gran sitio de reconocimiento (secuencias de ADN bicatenario de 12 a 40 pares de bases); como resultado, este sitio generalmente aparece solo una vez en un genoma determinado . Por ejemplo, la secuencia de 18 pares de bases reconocida por la meganucleasa I-SceI requeriría en promedio un genoma veinte veces el tamaño del genoma humano para ser encontrada una vez por casualidad (aunque las secuencias con un solo desajuste ocurren aproximadamente tres veces por genoma de tamaño humano). Por lo tanto, se considera que las meganucleasas son las enzimas de restricción naturales más específicas .

Entre las meganucleasas, la familia LAGLIDADG de endonucleasas homing se ha convertido en los últimos quince años en una valiosa herramienta para el estudio de los genomas y la ingeniería genómica . Las meganucleasas son "tijeras moleculares de ADN " que se pueden utilizar para reemplazar, eliminar o modificar secuencias de forma muy específica. Al modificar su secuencia de reconocimiento mediante ingeniería de proteínas, se puede cambiar la secuencia deseada. Las meganucleasas se utilizan para modificar todos los tipos de genoma, ya sean bacterianos, vegetales o animales. Abren amplios caminos para la innovación, especialmente en el campo de la salud humana, por ejemplo, la eliminación de material genético viral o la "reparación" de genes dañados mediante terapia génica.

Dos familias principales

Las meganucleasas se encuentran en una gran cantidad de organismos: arqueas o arqueobacterias, bacterias, fagos , hongos, levaduras , algas y algunas plantas. Pueden expresarse en diferentes compartimentos de la célula: el núcleo , las mitocondrias o los cloroplastos . Se han identificado varios cientos de estas enzimas .

Las meganucleasas están representadas principalmente por dos familias de enzimas principales conocidas colectivamente como endonucleasas homing: endonucleasas de intrones y endonucleasas de inteína.

En la naturaleza, estas proteínas están codificadas por elementos genéticos móviles, intrones o inteínas . Los intrones se propagan interviniendo en un lugar preciso del ADN, donde la expresión de la meganucleasa produce una rotura en el alelo complementario libre de intrones o inteínas . En el caso de las inteínas y los intrones del grupo I, esta rotura conduce a la duplicación del intrón o inteína en el sitio de corte mediante la reparación por recombinación homóloga para roturas de ADN de doble cadena.

Sabemos relativamente poco sobre el propósito real de las meganucleasas. Se cree que el material genético que codifica las meganucleasas funciona como un elemento parásito que utiliza los mecanismos de reparación celular del ADN de doble cadena en su propio beneficio como un medio para multiplicarse y propagarse, sin dañar el material genético de su huésped.

Endonucleasas homing de la familia LAGLIDADG

Existen cinco familias o clases de endonucleasas homing. [1] La más extendida y conocida es la familia LAGLIDADG . Las endonucleasas de la familia LAGLIDADG se encuentran principalmente en las mitocondrias y los cloroplastos de los organismos unicelulares eucariotas.

El nombre de esta familia corresponde a una secuencia de aminoácidos (o motivo) que se encuentra, más o menos conservada, en todas las proteínas de esta familia. Estas pequeñas proteínas también son conocidas por sus estructuras tridimensionales compactas y muy juntas.

Las endonucleasas mejor caracterizadas y más ampliamente utilizadas en investigación e ingeniería genómica incluyen I-SceI (descubierta en las mitocondrias de la levadura de panadería Saccharomyces cerevisiae ), I-CreI (de los cloroplastos del alga verde Chlamydomonas reinhardtii ) e I-DmoI (de la arqueobacteria Desulfurococcus mobilis ).

Las endonucleasas LAGLIDADG más conocidas son homodímeros (por ejemplo, I-CreI, compuestos por dos copias del mismo dominio proteico) o monómeros simétricos internamente (I-SceI). El sitio de unión del ADN, que contiene el dominio catalítico , está compuesto por dos partes a cada lado del punto de corte. Los sitios de unión a medias pueden ser extremadamente similares y unirse a una secuencia de ADN palindrómica o semipalindrómica (I-CreI), o pueden ser no palindrómicos (I-SceI).

Como herramientas para la ingeniería genómica

La alta especificidad de las meganucleasas les otorga un alto grado de precisión y una toxicidad celular mucho menor que otras enzimas de restricción naturales. Las meganucleasas se identificaron en la década de 1990 y trabajos posteriores han demostrado que son herramientas particularmente prometedoras para la ingeniería genómica y la edición genética , ya que pueden inducir de manera eficiente la recombinación homóloga, [2] generar mutaciones, [3] y alterar los marcos de lectura. [4]

Sin embargo, las recombinaciones genéticas inducidas por meganucleasas que se podían realizar estaban limitadas por el repertorio de meganucleasas disponibles. A pesar de la existencia de cientos de meganucleasas en la naturaleza y del hecho de que cada una de ellas es capaz de tolerar pequeñas variaciones en su sitio de reconocimiento, la probabilidad de encontrar una meganucleasa capaz de cortar un gen determinado en el lugar deseado es extremadamente escasa. Varios grupos centraron su atención en la ingeniería de nuevas meganucleasas que se dirigieran a los sitios de reconocimiento deseados.

Las investigaciones y aplicaciones más avanzadas se refieren a las endonucleasas homing de la familia LAGLIDADG.

Para crear meganucleasas a medida, se han adoptado dos enfoques principales:

  • Modificar la especificidad de las meganucleasas existentes introduciendo una pequeña cantidad de variaciones en la secuencia de aminoácidos y luego seleccionando las proteínas funcionales en variaciones del sitio de reconocimiento natural. [5] [6] [7]
  • Una opción más radical ha sido explotar una propiedad que juega un papel importante en el alto grado natural de diversificación de las meganucleasas: la posibilidad de asociar o fusionar dominios proteicos de diferentes enzimas . [8] [9] Esta opción permite desarrollar meganucleasas quiméricas con un nuevo sitio de reconocimiento compuesto por un medio sitio de meganucleasa A y un medio sitio de proteína B. Mediante la fusión de los dominios proteicos de I-DmoI e I-CreI, se han creado dos meganucleasas quiméricas utilizando este método: E-Drel y DmoCre. [10]

Estos dos enfoques se pueden combinar para aumentar la posibilidad de crear nuevas enzimas, manteniendo al mismo tiempo un alto grado de eficacia y especificidad. Los científicos de Cellectis han estado trabajando en la edición genética desde 1999 y han desarrollado una colección de más de 20.000 dominios proteicos a partir de la meganucleasa homodímera I-CreI, así como de otras estructuras de meganucleasas. [11] Se pueden combinar para formar heterodímeros quiméricos funcionales hechos a medida para laboratorios de investigación y para fines industriales.

Precision Biosciences, otra empresa de biotecnología, ha desarrollado un proceso de diseño totalmente racional llamado Editor de Nucleasas Dirigidas (DNE, por sus siglas en inglés), que es capaz de crear meganucleasas diseñadas que apuntan y modifican una ubicación definida por el usuario en un genoma. [12] En 2012, los investigadores de Bayer CropScience utilizaron DNE para incorporar una secuencia genética en el ADN de las plantas de algodón, dirigiéndola con precisión a un sitio predeterminado. [13]

Aplicaciones adicionales

Un avance reciente en el uso de meganucleasas para la ingeniería genómica es la incorporación del dominio de unión al ADN de efectores tipo activador de la transcripción (TAL) en nucleasas híbridas. Estas "megaTAL" combinan la facilidad de ingeniería y la alta especificidad de unión al ADN de un efector TAL con la alta eficiencia de escisión de las meganucleasas. [14] Además, las meganucleasas se han fusionado con enzimas de procesamiento de extremos de ADN para promover la unión de extremos no homólogos propensos a errores [15] y para aumentar la frecuencia de eventos mutagénicos en un locus determinado. [16]

Probabilidades

Como se indica en el párrafo inicial, para encontrar una meganucleasa con una secuencia de 18 pares de bases se necesitaría, en promedio, un genoma veinte veces más grande que el genoma humano; el cálculo es 4 18 /3x10 9 = 22,9. Sin embargo, las secuencias muy similares son mucho más comunes y su frecuencia aumenta rápidamente cuanto más desajustes se permiten.

Por ejemplo, una secuencia que es idéntica en todos los pares de bases menos uno ocurriría por casualidad una vez cada 4 17 /18x3x10 9 = 0,32 equivalentes del genoma humano en promedio, o tres veces por genoma humano. Una secuencia que es idéntica en todos los pares de bases menos dos ocurriría por casualidad en promedio una vez cada 4 16 /(18C2)x3x10 9 = 0,0094 equivalentes del genoma humano, o 107 veces por genoma humano.

Esto es importante porque las enzimas no tienen una discriminación perfecta; una nucleasa aún tendrá alguna probabilidad de actuar incluso si la secuencia no coincide perfectamente. Por lo tanto, la actividad de la nucleasa en una secuencia con un desajuste es menor que en el caso en que no hay desajustes, y la actividad es aún menor para dos desajustes, pero aún no es cero. La exclusión de estas secuencias, que son muy similares pero no idénticas, sigue siendo un problema importante que debe superarse en la ingeniería genómica.

Otras consideraciones

La metilación del ADN y la estructura de la cromatina afectan la eficacia de la digestión con meganucleasas. [17] [18] Por lo tanto, es necesaria una consideración exhaustiva del contexto genético y epigenético de una secuencia objetivo para la aplicación práctica de estas enzimas.

En diciembre de 2014, la USPTO emitió la patente 8.921.332 que cubre la edición genómica basada en meganucleasas in vitro. [19] Esta patente fue licenciada exclusivamente a Cellectis. [20]

Véase también

Referencias

  1. ^ Stoddard, Barry L. (2006). "Estructura y función de la endonucleasa homing". Quarterly Reviews of Biophysics . 38 (1): 49–95. doi :10.1017/S0033583505004063. PMID  16336743. S2CID  27841011.
  2. ^ Epinat, Jean-Charles; Arnold, Sylvain; Chames, Patricio; Rochaix, Pascal; Desfontaines, Dominique; Puzin, Clémence; Patín, Amélie; Zanghellini, Alexandre; Pâques, Frédéric (1 de junio de 2003). "Una nueva meganucleasa diseñada induce recombinación homóloga en células de levadura y mamíferos". Investigación de ácidos nucleicos . 31 (11): 2952–2962. doi :10.1093/nar/gkg375. ISSN  1362-4962. PMC 156710 . PMID  12771221. 
  3. ^ Arnould, Sylvain; Perez, Christophe; Cabaniols, Jean-Pierre; Smith, Julianne; Gouble, Agnès; Grizot, Sylvestre; Epinat, Jean-Charles; Duclert, Aymeric; Duchateau, Philippe (3 de agosto de 2007). "Los derivados de I-CreI diseñados que escinden secuencias del gen XPC humano pueden inducir una corrección génica altamente eficiente en células de mamíferos". Journal of Molecular Biology . 371 (1): 49–65. doi :10.1016/j.jmb.2007.04.079. ISSN  0022-2836. PMID  17561112.
  4. ^ Chapdelaine, P.; Pichavant, C.; Rousseau, J.; Pâques, F.; Tremblay, JP (1 de julio de 2010). "Las meganucleasas pueden restaurar el marco de lectura de una distrofina mutada". Terapia génica . 17 (7): 846–858. doi : 10.1038/gt.2010.26 . ISSN  1476-5462. PMID  20393509.
  5. ^ Seligman, LM ; Chisholm, KM; Chevalier, BS; Chadsey, MS; Edwards, ST; Savage, JH; Veillet, AL (2002). "Mutaciones que alteran la especificidad de escisión de una endonucleasa homing". Nucleic Acids Research . 30 (17): 3870–9. doi :10.1093/nar/gkf495. PMC 137417 . PMID  12202772. 
  6. ^ Sussman, Django; Chadsey, Meg; Fauce, Steve; Engel, Alex; Bruett, Anna; Monnat, Ray; Stoddard, Barry L.; Seligman, Lenny M. (2004). "Aislamiento y caracterización de nuevas especificidades de endonucleasas de localización en posiciones individuales del sitio objetivo". Revista de biología molecular . 342 (1): 31–41. doi :10.1016/j.jmb.2004.07.031. PMID  15313605.
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  8. ^ Arnould, Sylvain; Chames, Patrick; Perez, Christophe; Lacroix, Emmanuel; Duclert, Aymeric; Epinat, Jean-Charles; Stricher, François; Petit, Anne-Sophie; Patin, Amélie (2006). "Ingeniería de un gran número de endonucleasas de localización altamente específicas que inducen la recombinación en nuevos objetivos de ADN". Revista de biología molecular . 355 (3): 443–58. doi :10.1016/j.jmb.2005.10.065. PMID  16310802.
  9. ^ Smith, J.; Grizot, S.; Arnould, S.; Duclert, A.; Epinat, J.-C.; Chames, P.; Prieto, J.; Redondo, P.; Blanco, FJ (2006). "Un enfoque combinatorio para crear endonucleasas homing artificiales que escindan secuencias elegidas". Nucleic Acids Research . 34 (22): e149. doi :10.1093/nar/gkl720. PMC 1702487 . PMID  17130168. 
  10. ^ Chevalier, Brett S.; Kortemme, Tanja ; Chadsey, Meggen S.; Baker, David; Monnat, Raymond J.; Stoddard, Barry L. (2002). "Diseño, actividad y estructura de una endonucleasa artificial altamente específica". Molecular Cell . 10 (4): 895–905. doi : 10.1016/S1097-2765(02)00690-1 . PMID  12419232.
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  20. ^ "Cellectis anuncia la emisión por parte de la USPTO de una patente que cubre un método de "edición genética" basado en nucleasa seminal | cellectis". www.cellectis.com . Archivado desde el original el 2016-03-02 . Consultado el 19 de febrero de 2016 .
  • Celectis
  • Biociencias de precisión
  • Vídeo explicativo sobre las meganucleasas, de Cellectis
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