ADN fetal libre de células
ADN fetal en el torrente sanguíneo materno

El ADN fetal libre de células ( cffDNA ) es ADN fetal que circula libremente en la sangre materna . La sangre materna se obtiene mediante venopunción . El análisis de cffDNA es un método de diagnóstico prenatal no invasivo que se solicita con frecuencia en mujeres embarazadas de edad materna avanzada . Dos horas después del parto, el cffDNA ya no es detectable en la sangre materna.

Fondo

El ADN fetal libre de células se libera en la circulación sanguínea materna.

El cffDNA se origina a partir de los trofoblastos placentarios . [1] [2] El ADN fetal se fragmenta cuando las micropartículas placentarias se liberan en la circulación sanguínea materna . [3]

Los fragmentos de cffDNA tienen una longitud de aproximadamente 200 pares de bases (pb). Son significativamente más pequeños que los fragmentos de ADN materno . [4] La diferencia de tamaño permite distinguir el cffDNA de los fragmentos de ADN materno. [5] [6]

Aproximadamente entre el 11 y el 13,4 por ciento del ADN libre de células en la sangre materna es de origen fetal. La cantidad varía ampliamente de una mujer embarazada a otra. [7] El cffDNA está presente después de la quinta a séptima semana de gestación. La cantidad de cffDNA aumenta a medida que avanza el embarazo. [8] La cantidad de cffDNA en la sangre materna disminuye rápidamente después del parto. Dos horas después del parto, el cffDNA ya no es detectable en la sangre materna. [9]

El análisis de cffDNA puede proporcionar un diagnóstico más temprano de las afecciones fetales que las técnicas actuales. Como el cffDNA se encuentra en la sangre materna, la toma de muestras no conlleva ningún riesgo asociado de aborto espontáneo . [10] [11] [12] [13] [14] El análisis de cffDNA tiene los mismos problemas éticos y prácticos que otras técnicas como la amniocentesis y la toma de muestras de vellosidades coriónicas . [15]

Algunas desventajas del muestreo de cffDNA incluyen una baja concentración de cffDNA en la sangre materna; variación en la cantidad de cffDNA entre individuos; una alta concentración de ADN libre de células maternas en comparación con el cffDNA en la sangre materna. [16]

Nuevas evidencias muestran que la tasa de falla de la prueba cffDNA es mayor, la fracción fetal (proporción de ADN fetal versus materno en la muestra de sangre materna) es menor y el VPP para las trisomías 18, 13 y SCA disminuye en los embarazos de FIV en comparación con los concebidos espontáneamente. [ aclaración necesaria ] [17]

Métodos de laboratorio

Se han desarrollado varios métodos de laboratorio para la detección de defectos genéticos en el ADN fetal libre de células. Los principales son (1) la secuenciación masiva paralela (MPSS), (2) la secuenciación masiva paralela dirigida (t-MPS) y (3) el enfoque basado en polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). [18] [19] [20]

Se toma una muestra de sangre periférica materna mediante venesección aproximadamente a las diez semanas de gestación. [21]

Separación de cffDNA

El plasma sanguíneo se separa de la muestra de sangre materna utilizando una centrífuga de laboratorio . Luego se aísla y purifica el cffDNA. [22] Se redactó un protocolo estandarizado para realizar esto mediante una evaluación de la literatura científica . El mayor rendimiento en la extracción de cffDNA se obtuvo con el "QIAamp DSP Virus Kit". [23]

La adición de formaldehído a las muestras de sangre materna aumenta la producción de cffDNA. El formaldehído estabiliza las células intactas y, por lo tanto, inhibe la liberación posterior de ADN materno. Con la adición de formaldehído, el porcentaje de cffDNA recuperado de una muestra de sangre materna varía entre el 0,32 por ciento y el 40 por ciento, con una media del 7,7 por ciento. [24] Sin la adición de formaldehído, el porcentaje medio de cffDNA recuperado se ha medido en un 20,2 por ciento. Sin embargo, otras cifras varían entre el 5 y el 96 por ciento. [25] [26]

La recuperación de cffDNA puede estar relacionada con la longitud de los fragmentos de ADN. Otra forma de aumentar el ADN fetal se basa en la longitud física de los fragmentos de ADN. Los fragmentos más pequeños pueden representar hasta el setenta por ciento del ADN libre total de células en la muestra de sangre materna. [ cita requerida ]

Análisis de cffDNA

En la PCR en tiempo real, se utilizan sondas fluorescentes para controlar la acumulación de amplicones . La señal fluorescente del reportero es proporcional al número de amplicones generados. El protocolo de PCR en tiempo real más adecuado se diseña según la mutación o el genotipo particular que se desea detectar. Las mutaciones puntuales se analizan con PCR en tiempo real cualitativa con el uso de sondas específicas de alelos . Las inserciones y deleciones se analizan mediante mediciones de dosis utilizando PCR cuantitativa en tiempo real. [ cita requerida ]

El cffDNA se puede detectar encontrando secuencias de ADN heredadas paternamente mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). [27] [28]

PCR cuantitativa en tiempo real

Se analizaron mediante PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) el gen de la región determinante del sexo Y (SRY) y la repetición corta en tándem "DYS14" del cromosoma Y en cffDNA de 511 embarazos. En 401 de 403 embarazos en los que se extrajo sangre materna a las siete semanas de gestación o más, se encontraron ambos segmentos de ADN. [29]

PCR anidada

Se evaluó el uso de la reacción en cadena de la polimerasa anidada (PCR anidada) para determinar el sexo mediante la detección de una señal específica del cromosoma Y en el cffDNA del plasma materno. La PCR anidada detectó 53 de 55 fetos masculinos. El cffDNA del plasma de 3 de 25 mujeres con fetos femeninos contenía la señal específica del cromosoma Y. La sensibilidad de la PCR anidada en este experimento fue del 96 por ciento. La especificidad fue del 88 por ciento. [30]

PCR digital

Los dispositivos microfluídicos permiten la cuantificación de segmentos de cffDNA en plasma materno con una precisión superior a la de la PCR en tiempo real. Las mutaciones puntuales , la pérdida de heterocigosidad y la aneuploidía se pueden detectar en un solo paso de PCR. [31] [32] [33] La PCR digital puede diferenciar entre el plasma sanguíneo materno y el ADN fetal de forma multiplexada . [31]

Secuenciación de escopeta

La secuenciación shotgun de alto rendimiento con herramientas como Solexa o Illumina produce aproximadamente 5 millones de etiquetas de secuencia por muestra de suero materno. Los embarazos aneuploides, como la trisomía, se identificaron al realizar la prueba en la decimocuarta semana de gestación. El mapeo completo del genoma fetal mediante el análisis de haplotipos parentales se completó utilizando la secuenciación de cffDNA del suero materno. [13] Se estudiaron hembras embarazadas utilizando una secuenciación masiva paralela de ADN plasmático materno de 2 plex y se diagnosticó trisomía con una puntuación z superior a 3. [34] La secuenciación arrojó una sensibilidad del 100 por ciento, una especificidad del 97,9 por ciento, un valor predictivo positivo del 96,6 por ciento y un valor predictivo negativo del 100 por ciento. [ cita requerida ]

Espectrometría de masas

La espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción /ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS) combinada con la extensión de una sola base después de la PCR permite la detección de cffDNA con especificidad de una sola base y sensibilidad de una sola molécula de ADN. [35] El ADN se amplifica por PCR. Luego, la amplificación lineal con reacción de extensión de base (con un tercer cebador) está diseñada para annealing a la región corriente arriba del sitio de mutación . Una o dos bases se agregan al cebador de extensión para producir dos productos de extensión a partir de ADN de tipo salvaje y ADN mutante. La especificidad de una sola base proporciona ventajas sobre las técnicas basadas en hibridación que utilizan sondas de hidrólisis TaqMan . Al evaluar la técnica, no se encontraron falsos positivos o negativos al buscar cffDNA para determinar el sexo fetal en dieciséis muestras de plasma materno. [35] El sexo de noventa y un fetos masculinos se detectó correctamente utilizando la espectrometría de masas MALDI-TOF. La técnica tuvo precisión, sensibilidad y especificidad de más del 99 por ciento. [36]

Modificaciones epigenéticas

Las diferencias en la activación genética entre el ADN materno y fetal pueden ser explotadas. Las modificaciones epigenéticas (modificaciones hereditarias que cambian la función genética sin cambiar la secuencia del ADN) pueden ser utilizadas para detectar cffDNA. [37] [38] El promotor hipermetilado RASSF1A es un marcador fetal universal utilizado para confirmar la presencia de cffDNA. [39] Se describió una técnica en la que se extrajo cffDNA del plasma materno y luego se digirió con enzimas de restricción sensibles e insensibles a la metilación . Luego, se realizó un análisis de PCR en tiempo real de RASSF1A, SRY y DYS14. [39] El procedimiento detectó 79 de 90 (88 por ciento) muestras de sangre materna donde estaba presente RASSF1A hipermetilado. [ cita requerida ]

ARNm

Las transcripciones de ARNm de genes expresados ​​en la placenta son detectables en el plasma materno. [40] En este procedimiento, el plasma se centrifuga para que aparezca una capa acuosa. Esta capa se transfiere y de ella se extrae el ARN . La RT-PCR se utiliza para detectar una expresión seleccionada de ARN. Por ejemplo, el lactógeno placentario humano (hPL) y el ARNm de beta-hCG son estables en el plasma materno y se pueden detectar. (Ng et al. 2002). Esto puede ayudar a confirmar la presencia de cffDNA en el plasma materno. [16]

Aplicaciones

Discernimiento prenatal del sexo

El análisis de cffDNA de una muestra de plasma materno permite la determinación prenatal del sexo . Las aplicaciones de la determinación prenatal del sexo incluyen:

En comparación con la ecografía obstétrica , que no es confiable para la determinación del sexo en el primer trimestre, y la amniocentesis, que conlleva un pequeño riesgo de aborto espontáneo , la toma de muestras de plasma materno para el análisis de cffDNA no presenta ningún riesgo. [42] Los principales objetivos del análisis de cffDNA son el gen responsable de la proteína de la región determinante del sexo Y (SRY) en el cromosoma Y y la secuencia DYS14. [43] [44]

Hiperplasia suprarrenal congénita

En la hiperplasia suprarrenal congénita , la corteza suprarrenal carece de la síntesis apropiada de corticosteroides, lo que conduce a un exceso de andrógenos suprarrenales y afecta a los fetos femeninos. [45] Hay una masculinización externa de los genitales en los fetos femeninos. [46] A las madres de fetos en riesgo se les administra dexametasona a las 6 semanas de gestación para suprimir la liberación de andrógenos de la glándula pituitaria . [47]

Si el análisis de cffDNA obtenido de una muestra de plasma materno carece de marcadores genéticos que se encuentran únicamente en el cromosoma Y, esto es indicativo de un feto femenino. Sin embargo, también podría indicar un fallo del análisis en sí (un resultado falso negativo). Los polimorfismos genéticos paternos y los marcadores independientes del sexo pueden utilizarse para detectar cffDNA. Para esta aplicación, debe estar presente un alto grado de heterocigosidad de estos marcadores. [48]

Prueba de paternidad

La prueba de paternidad por ADN prenatal está disponible comercialmente. La prueba se puede realizar a las nueve semanas de gestación. [ cita requerida ]

Trastornos monogénicos

Los trastornos autosómicos dominantes y recesivos de un solo gen que se han diagnosticado prenatalmente mediante el análisis del ADN heredado paternalmente incluyen fibrosis quística , beta talasemia , anemia de células falciformes , atrofia muscular espinal y distrofia miotónica . [27] [43] El diagnóstico prenatal de trastornos de un solo gen que se deben a una mutación autosómica recesiva, una mutación autosómica dominante heredada de la madre o mutaciones de secuencia grande que incluyen duplicación, expansión o inserción de secuencias de ADN es más difícil. [49]

En el cffDNA, los fragmentos de 200 a 300 pb de longitud implicados en trastornos de un solo gen son más difíciles de detectar. [ cita requerida ]

Por ejemplo, la acondroplasia , una enfermedad autosómica dominante, es causada por la mutación puntual del gen FGFR3. [50] En dos embarazos con un feto con acondroplasia se encontró una mutación G1138A heredada paternamente del cffDNA de una muestra de plasma materno en uno y una mutación G1138A de novo en el otro. [50]

En estudios sobre la genética de la corea de Huntington mediante qRT-PCR de cffDNA de muestras de plasma materno, se han detectado repeticiones de CAG en niveles normales (17, 20 y 24). [51]

El cffDNA también se puede utilizar para diagnosticar trastornos de un solo gen . [15] Los avances en los procesos de laboratorio que utilizan cffDNA pueden permitir el diagnóstico prenatal de aneuploidías como la trisomía 21 (síndrome de Down) en el feto. [52] [32]

Enfermedad hemolítica del feto y del recién nacido

La incompatibilidad de los antígenos RhD fetales y maternos es la principal causa de la enfermedad hemolítica del recién nacido . [53] Aproximadamente el 15 por ciento de las mujeres caucásicas , entre el 3 y el 5 por ciento de las mujeres de África negra y menos del 3 por ciento de las mujeres asiáticas son RhD negativas. [54]

El diagnóstico prenatal preciso es importante porque la enfermedad puede ser fatal para el recién nacido y porque el tratamiento, que incluye inmunoglobulina intramuscular (Anti-D) o inmunoglobulina intravenosa , se puede administrar a madres en riesgo. [55]

La PCR para detectar los exones 5 y 7 del gen RHD (gen) a partir de cffDNA obtenido de plasma materno entre las 9 y 13 semanas de gestación proporciona un alto grado de especificidad, sensibilidad y precisión diagnóstica (>90 por ciento) en comparación con la determinación de RhD a partir del suero de sangre del cordón umbilical del recién nacido . [53] Se obtuvieron resultados similares al identificar los exones 7 y 10. [56] La PCR digital de gotas en la determinación de RhD fetal fue comparable a una técnica de PCR en tiempo real de rutina. [57]

La determinación rutinaria del estado RhD fetal a partir del cffDNA en suero materno permite el manejo temprano de embarazos de riesgo y al mismo tiempo reduce el uso innecesario de Anti-D en más del 25 por ciento. [58]

Aneuploidía

Cromosomas sexuales

El análisis del cffDNA del suero materno mediante secuenciación de alto rendimiento puede detectar aneuploidías comunes de los cromosomas sexuales fetales, como el síndrome de Turner , el síndrome de Klinefelter y el síndrome triple X , pero el valor predictivo positivo del procedimiento es bajo. [59]

Un ejemplo de un algoritmo para determinar la indicación de pruebas genéticas prenatales para la trisomía 21 ( síndrome de Down ), en donde la prueba de sangre genética (en el centro) se realiza detectando cffDNA en una muestra de sangre de la madre. [60]
Trisomía 21

La trisomía fetal del cromosoma 21 es la causa del síndrome de Down. Esta trisomía se puede detectar mediante el análisis del cffDNA de la sangre materna mediante secuenciación masiva paralela shotgun (MPSS). [61] Otra técnica es el análisis digital de regiones seleccionadas (DANSR). [61] Estas pruebas muestran una sensibilidad de alrededor del 99% y una especificidad de más del 99,9%. Por lo tanto, no se pueden considerar procedimientos de diagnóstico, pero se pueden utilizar para confirmar una prueba de detección materna positiva, como una prueba de detección del primer trimestre o marcadores ecográficos de la enfermedad. [61] [62]

Trisomía 13 y 18

Es posible realizar un análisis de cffDNA del plasma materno con MPSS en busca de trisomía 13 o 18 [63]

Los factores que limitan la sensibilidad y especificidad incluyen los niveles de cffDNA en el plasma materno; los cromosomas maternos pueden tener mosaicismo . [64]

Se pueden detectar varias moléculas de ácido nucleico fetal derivadas de cromosomas aneuploides, incluyendo el ARNm de SERPINEB2, clad B, SERPINB5 hipometilado del cromosoma 18, placenta-specific 4 (PLAC4), holocarboxilasa sintetasa hipermetilada (HLCS) y el ARNm c21orf105 del cromosoma 12. [65] Con la trisomía completa, los alelos de ARNm en el plasma materno no tienen la proporción normal de 1:1, sino que de hecho son 2:1. Las proporciones alélicas determinadas por marcadores epigenéticos también se pueden utilizar para detectar las trisomías completas. La secuenciación paralela masiva y la PCR digital para la detección de aneuploidía fetal se pueden utilizar sin restricción para las moléculas de ácido nucleico fetales específicas. Se estima que la secuenciación masiva paralela (MPSS) tiene una sensibilidad de entre el 96 y el 100% y una especificidad de entre el 94 y el 100% para detectar el síndrome de Down. Se puede realizar a las 10 semanas de edad gestacional . [66] Un estudio en los Estados Unidos estimó una tasa de falsos positivos del 0,3% y un valor predictivo positivo del 80% al utilizar cffDNA para detectar el síndrome de Down. [67]

Preeclampsia

La preeclampsia es una afección compleja del embarazo que cursa con hipertensión y proteinuria , generalmente después de las 20 semanas de gestación. [68] Se asocia con una invasión citotrofoblástica deficiente del miometrio . La aparición de la afección entre las 20 y 34 semanas de gestación se considera "temprana". [69] Las muestras de plasma materno en embarazos complicados por preeclampsia tienen niveles significativamente más altos de cffDNA que en embarazos normales. [70] [71] [72] Esto es válido para la preeclampsia de aparición temprana. [69]

Historia

En 1997, el Dr. Yuk Ming Dennis Lo , junto con su equipo, empleó por primera vez el ensayo Y-PCR para identificar secuencias del cromosoma Y fetal (porque las secuencias específicas del cromosoma Y son secuencias genéticas del feto que no están en el genoma materno [73] ) en muestras de plasma materno. [74] Por este trabajo innovador, fue honrado con el Premio de Investigación Médica Clínica Lasker DeBakey 2022. [75]

Perspectivas futuras

La secuenciación de nueva generación puede utilizarse para obtener una secuencia completa del genoma a partir de cffDNA. Esto plantea cuestiones éticas. [76] Sin embargo, la utilidad del procedimiento puede aumentar a medida que se descubran asociaciones claras entre variantes genéticas específicas y estados patológicos. [77] [78]

Véase también

Referencias

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