Reacción en cadena de la polimerasa multiplex
La reacción en cadena de la polimerasa multiplex ( PCR multiplex ) se refiere al uso de la reacción en cadena de la polimerasa para amplificar varias secuencias de ADN diferentes simultáneamente (como si se realizaran muchas reacciones de PCR separadas todas juntas en una reacción). Este proceso amplifica el ADN en muestras utilizando múltiples cebadores y una ADN polimerasa mediada por temperatura en un termociclador . El diseño de cebadores para todos los pares de cebadores debe optimizarse para que todos los pares de cebadores puedan funcionar a la misma temperatura de hibridación durante la PCR.
La PCR multiplex se describió por primera vez en 1988 como un método para detectar deleciones en el gen de la distrofina . [1] También se ha utilizado con el gen de la esteroide sulfatasa . [2] En 2008, la PCR multiplex se utilizó para el análisis de microsatélites y SNP . [3] En 2020, se diseñaron ensayos multiplex de RT-PCR que combinaban múltiples dianas genéticas del Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades en una sola reacción para aumentar la accesibilidad y el rendimiento de las pruebas moleculares para el diagnóstico del SARS-CoV-2 . [4]
La PCR multiplex consiste en múltiples conjuntos de cebadores dentro de una única mezcla de PCR para producir amplicones de distintos tamaños que son específicos de diferentes secuencias de ADN. Al dirigirse a múltiples secuencias a la vez, se puede obtener información adicional de una única ejecución de prueba que, de lo contrario, requeriría varias veces más reactivos y más tiempo para realizarla. Las temperaturas de hibridación para cada uno de los conjuntos de cebadores deben optimizarse para que funcionen correctamente dentro de una única reacción, y los tamaños de los amplicones, es decir, la longitud de sus pares de bases, deben ser lo suficientemente diferentes como para formar bandas distintas cuando se visualizan mediante electroforesis en gel . Alternativamente, si los tamaños de los amplicones se superponen, los diferentes amplicones pueden diferenciarse y visualizarse utilizando cebadores que se han teñido con tintes fluorescentes de diferentes colores. Hay kits de multiplexación comerciales para PCR disponibles y utilizados por muchos laboratorios forenses para amplificar muestras de ADN degradado.
Aplicaciones
Algunas de las aplicaciones de la PCR multiplex incluyen:
- Identificación de patógenos [5]
- Genotipado de SNP de alto rendimiento [6]
- Análisis de mutaciones [7]
- Análisis de deleción de genes [8]
- Cuantificación de plantillas [9]
- Análisis de vínculos [10]
- Detección de ARN [11]
- Estudios forenses [12]
- Análisis de la dieta [13]
Referencias
- ^ Chamberlain JS, Gibbs RA, Ranier JE, Nguyen PN, Caskey CT (1988). "Detección de deleciones del locus de distrofia muscular de Duchenne mediante amplificación de ADN multiplex". Nucleic Acids Research . 16 (23): 11141–11156. doi :10.1093/nar/16.23.11141. PMC 339001 . PMID 3205741.
- ^ Ballabio A, Ranier JE, Chamberlain JS, Zollo M, Caskey CT (1990). "Detección de deleciones del gen de la esteroide sulfatasa (STS) mediante amplificación de ADN multiplex" (PDF) . Human Genetics . 84 (6): 571–573. doi :10.1007/BF00210812. hdl : 2027.42/47626 . PMID 2338343. S2CID 18579745.
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