Electrofisiología

La electrofisiología (del griego ἥλεκτ , ēlektron , «ámbar» [véase la etimología de «electrón» ]; φύσις , physis , «naturaleza, origen»; y -λογία , -logia ) es la rama de la fisiología que estudia las propiedades eléctricas de las células y tejidos biológicos. Implica mediciones de cambios de voltaje o corriente eléctrica o manipulaciones en una amplia variedad de escalas, desde proteínas de un solo canal iónico hasta órganos completos como el corazón . En neurociencia , incluye mediciones de la actividad eléctrica de las neuronas y, en particular, la actividad del potencial de acción . Los registros de señales eléctricas a gran escala del sistema nervioso , como la electroencefalografía , también pueden denominarse registros electrofisiológicos. ^[1] Son útiles para el electrodiagnóstico y la monitorización .

La electrofisiología es la rama de la fisiología que estudia en términos generales el flujo de iones ( corriente iónica ) en los tejidos biológicos y, en particular, las técnicas de registro eléctrico que permiten medir este flujo. Las técnicas clásicas de electrofisiología implican la colocación de electrodos en diversas preparaciones de tejido biológico. Los principales tipos de electrodos son:

1. Conductores sólidos simples, como discos y agujas (individuales o en matriz, a menudo aislados excepto por la punta),
2. Trazados sobre circuitos impresos o polímeros flexibles, también aislados excepto la punta, y
3. Tubos huecos, a menudo alargados o "estirados", llenos de un electrolito, como pipetas de vidrio llenas de solución de cloruro de potasio u otra solución electrolítica.

Los principales preparativos incluyen:

1. organismos vivos (por ejemplo, insectos),
2. tejido extirpado (agudo o cultivado),
3. células disociadas de tejido extirpado (agudo o cultivado),
4. células o tejidos cultivados artificialmente, o
5. Híbridos de los anteriores.

La electrofisiología neuronal es el estudio de las propiedades eléctricas de las células y tejidos biológicos dentro del sistema nervioso. Con la electrofisiología neuronal, los médicos y especialistas pueden determinar cómo se producen los trastornos neuronales al observar la actividad cerebral del individuo. Actividad como qué partes del cerebro se iluminan durante las situaciones que se presentan. Si un electrodo tiene un diámetro lo suficientemente pequeño (micrómetros), entonces el electrofisiólogo puede optar por insertar la punta en una sola célula. Esta configuración permite la observación directa y el registro intracelular de la actividad eléctrica intracelular de una sola célula. Sin embargo, esta configuración invasiva reduce la vida de la célula y provoca una fuga de sustancias a través de la membrana celular.

La actividad intracelular también puede observarse utilizando una pipeta de vidrio especialmente formada (hueca) que contiene un electrolito. En esta técnica, la punta de la pipeta microscópica se presiona contra la membrana celular, a la que se adhiere firmemente mediante una interacción entre el vidrio y los lípidos de la membrana celular. El electrolito dentro de la pipeta puede llevarse a una continuidad fluida con el citoplasma mediante la aplicación de un pulso de presión negativa a la pipeta para romper el pequeño parche de membrana rodeado por el borde de la pipeta ( registro de célula completa ). Alternativamente, la continuidad iónica puede establecerse "perforando" el parche permitiendo que los agentes formadores de poros exógenos dentro del electrolito se inserten en el parche de membrana ( registro de parche perforado ). Finalmente, el parche puede dejarse intacto ( registro de parche ).

El electrofisiólogo puede optar por no insertar la punta en una sola célula. En su lugar, la punta del electrodo puede dejarse en continuidad con el espacio extracelular. Si la punta es lo suficientemente pequeña, esta configuración puede permitir la observación indirecta y el registro de potenciales de acción de una sola célula, lo que se denomina registro de una sola unidad . Según la preparación y la colocación precisa, una configuración extracelular puede captar la actividad de varias células cercanas simultáneamente, lo que se denomina registro de múltiples unidades .

A medida que aumenta el tamaño del electrodo, disminuye el poder de resolución. Los electrodos más grandes son sensibles solo a la actividad neta de muchas células, denominadas potenciales de campo local . Los electrodos aún más grandes, como las agujas sin aislamiento y los electrodos de superficie utilizados por los neurofisiólogos clínicos y quirúrgicos, son sensibles solo a ciertos tipos de actividad sincrónica dentro de poblaciones de células que se cuentan por millones.

Otras técnicas electrofisiológicas clásicas incluyen el registro de un solo canal y la amperometría .

El registro electrofisiológico en general se denomina a veces electrografía (de electro- + -grafía , "registro eléctrico"), y el registro así producido es un electrograma. Sin embargo, la palabra electrografía tiene otros sentidos (incluida la electrofotografía ), y los tipos específicos de registro electrofisiológico suelen denominarse por nombres específicos, construidos sobre el patrón de electro- + [ forma de combinación de parte del cuerpo ] + -grafía (abreviatura ExG). En relación con esto, la palabra electrograma (al no ser necesaria para esos otros sentidos ) a menudo conlleva el significado específico de electrograma intracardíaco, que es como un electrocardiograma pero con algunas derivaciones invasivas (dentro del corazón) en lugar de solo derivaciones no invasivas (en la piel). El registro electrofisiológico con fines de diagnóstico clínico se incluye dentro de la categoría de pruebas de electrodiagnóstico . Los diversos modos "ExG" son los siguientes:

Las técnicas electrofisiológicas ópticas fueron creadas por científicos e ingenieros para superar una de las principales limitaciones de las técnicas clásicas. Las técnicas clásicas permiten la observación de la actividad eléctrica en aproximadamente un único punto dentro de un volumen de tejido. Las técnicas clásicas singularizan un fenómeno distribuido. El interés en la distribución espacial de la actividad bioeléctrica impulsó el desarrollo de moléculas capaces de emitir luz en respuesta a su entorno eléctrico o químico. Algunos ejemplos son los colorantes sensibles al voltaje y las proteínas fluorescentes. Después de introducir uno o más de estos compuestos en el tejido mediante perfusión, inyección o expresión génica, se puede observar y registrar la distribución unidimensional o bidimensional de la actividad eléctrica. ^{[ cita requerida ]}

El registro intracelular consiste en medir el voltaje y/o la corriente a través de la membrana de una célula. Para realizar un registro intracelular, se debe insertar la punta de un microelectrodo fino (afilado) dentro de la célula, de modo que se pueda medir el potencial de membrana . Normalmente, el potencial de membrana en reposo de una célula sana será de -60 a -80 mV, y durante un potencial de acción el potencial de membrana puede alcanzar +40 mV. En 1963, Alan Lloyd Hodgkin y Andrew Fielding Huxley ganaron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina por su contribución a la comprensión de los mecanismos subyacentes a la generación de potenciales de acción en las neuronas. Sus experimentos implicaron registros intracelulares del axón gigante del calamar del Atlántico ( Loligo pealei ), y estuvieron entre las primeras aplicaciones de la técnica de "pinza de voltaje". ^[3]

En la actualidad, la mayoría de los microelectrodos utilizados para el registro intracelular son micropipetas de vidrio, con un diámetro de punta de < 1 micrómetro y una resistencia de varios megaohmios. Las micropipetas se llenan con una solución que tiene una composición iónica similar al fluido intracelular de la célula. Un cable de plata clorada insertado en la pipeta conecta eléctricamente el electrolito al amplificador y al circuito de procesamiento de señales. El voltaje medido por el electrodo se compara con el voltaje de un electrodo de referencia, generalmente un cable de plata recubierto de cloruro de plata en contacto con el fluido extracelular alrededor de la célula. En general, cuanto más pequeña sea la punta del electrodo, mayor será su resistencia eléctrica . Por lo tanto, un electrodo es un compromiso entre tamaño (lo suficientemente pequeño para penetrar una sola célula con un daño mínimo a la célula) y resistencia (lo suficientemente baja para que se puedan discernir pequeñas señales neuronales del ruido térmico en la punta del electrodo).

Mantener cortes cerebrales sanos es fundamental para obtener registros electrofisiológicos exitosos. La preparación de estos cortes se logra comúnmente con herramientas como el vibratomo Compresstome, lo que garantiza condiciones óptimas para registros precisos y confiables. ^[4] Sin embargo, incluso con los estándares más altos de manipulación de tejidos, la preparación de cortes induce cambios fenotípicos rápidos y robustos de las principales células inmunes del cerebro, la microglia , que deben tenerse en cuenta al usar este modelo. ^[5]

La técnica de fijación de voltaje permite al experimentador "fijar" el potencial celular en un valor elegido. Esto hace posible medir cuánta corriente iónica atraviesa la membrana de una célula a un voltaje determinado. Esto es importante porque muchos de los canales iónicos en la membrana de una neurona son canales iónicos dependientes del voltaje , que se abren solo cuando el voltaje de la membrana está dentro de un rango determinado. Las mediciones de corriente mediante fijación de voltaje son posibles gracias a la sustracción digital casi simultánea de corrientes capacitivas transitorias que pasan a medida que el electrodo de registro y la membrana celular se cargan para alterar el potencial de la célula. ^{[ cita requerida ]}

La técnica de pinza de corriente registra el potencial de membrana inyectando corriente en una célula a través del electrodo de registro. A diferencia del modo de pinza de voltaje, donde el potencial de membrana se mantiene a un nivel determinado por el experimentador, en el modo de "pinza de corriente" el potencial de membrana es libre de variar y el amplificador registra cualquier voltaje que la célula genere por sí sola o como resultado de la estimulación. Esta técnica se utiliza para estudiar cómo responde una célula cuando entra corriente eléctrica en ella; esto es importante, por ejemplo, para comprender cómo responden las neuronas a los neurotransmisores que actúan abriendo los canales iónicos de la membrana . ^{[ cita requerida ]}

La mayoría de los amplificadores de pinza amperimétrica proporcionan poca o ninguna amplificación de los cambios de voltaje registrados desde la celda. El "amplificador" es en realidad un electrómetro , a veces denominado "amplificador de ganancia unitaria"; su propósito principal es reducir la carga eléctrica en las pequeñas señales (en el rango de mV) producidas por las celdas para que puedan ser registradas con precisión por la electrónica de baja impedancia . El amplificador aumenta la corriente detrás de la señal mientras disminuye la resistencia sobre la que pasa esa corriente. Considere este ejemplo basado en la ley de Ohm: Se genera un voltaje de 10 mV al pasar 10 nanoamperios de corriente a través de 1 MΩ de resistencia. El electrómetro cambia esta "señal de alta impedancia" a una "señal de baja impedancia" utilizando un circuito seguidor de voltaje . Un seguidor de voltaje lee el voltaje en la entrada (causado por una pequeña corriente a través de una gran resistencia ). Luego, instruye a un circuito paralelo que tiene una gran fuente de corriente detrás de él (la red eléctrica) y ajusta la resistencia de ese circuito paralelo para brindar el mismo voltaje de salida, pero a través de una resistencia menor.

Esta técnica fue desarrollada por Erwin Neher y Bert Sakmann , quienes recibieron el Premio Nobel en 1991. ^[6] El registro intracelular convencional implica atravesar una célula con un electrodo fino; el registro con fijación de parche adopta un enfoque diferente. Un microelectrodo con fijación de parche es una micropipeta con un diámetro de punta relativamente grande. El microelectrodo se coloca junto a una célula y se aplica una succión suave a través del microelectrodo para extraer un trozo de la membrana celular (el "parche") hacia la punta del microelectrodo; la punta de vidrio forma un "sello" de alta resistencia con la membrana celular. Esta configuración es el modo "adherido a la célula" y se puede utilizar para estudiar la actividad de los canales iónicos que están presentes en el parche de membrana. Si ahora se aplica más succión, el pequeño parche de membrana en la punta del electrodo se puede desplazar, dejando el electrodo sellado al resto de la célula. Este modo de "célula completa" permite un registro intracelular muy estable. Una desventaja (en comparación con el registro intracelular convencional con electrodos afilados) es que el fluido intracelular de la célula se mezcla con la solución dentro del electrodo de registro, por lo que algunos componentes importantes del fluido intracelular pueden diluirse. Una variante de esta técnica, la técnica del "parche perforado", intenta minimizar estos problemas. En lugar de aplicar succión para desplazar el parche de membrana de la punta del electrodo, también es posible hacer pequeños agujeros en el parche con agentes formadores de poros para que las moléculas grandes, como las proteínas, puedan permanecer dentro de la célula y los iones puedan pasar a través de los agujeros libremente. Además, el parche de membrana puede separarse del resto de la célula. Este enfoque permite analizar farmacológicamente las propiedades de la membrana del parche. El método patch-clamp también puede combinarse con la secuenciación de ARN en una técnica conocida como patch-seq , extrayendo el contenido celular después del registro para caracterizar la relación de las propiedades electrofisiológicas con la expresión génica y el tipo de célula.

En situaciones en las que se desea registrar el potencial dentro de la membrana celular con un efecto mínimo en la constitución iónica del fluido intracelular, se puede utilizar un electrodo afilado. Estas micropipetas (electrodos) son como las que se utilizan para el método de fijación de parches y se sacan de los capilares de vidrio, pero el poro es mucho más pequeño, de modo que hay muy poco intercambio iónico entre el fluido intracelular y el electrolito en la pipeta. La resistencia eléctrica del electrodo de la micropipeta se reduce al llenarlo con KCl 2-4 M, en lugar de una concentración de sal que imita las concentraciones iónicas intracelulares que se utilizan en el método de fijación de parches. ^[7] A menudo, la punta del electrodo se llena con varios tipos de tintes, como el amarillo Lucifer , para llenar las células registradas y confirmar posteriormente su morfología con un microscopio. Los tintes se inyectan aplicando un voltaje positivo o negativo, de CC o pulsado, a los electrodos, según la polaridad del tinte.

Un electrodo introducido en el cerebro de un animal vivo detectará la actividad eléctrica generada por las neuronas adyacentes a la punta del electrodo. Si el electrodo es un microelectrodo, con un tamaño de punta de aproximadamente 1 micrómetro, el electrodo generalmente detectará la actividad de una neurona como máximo. El registro de esta manera se denomina en general registro de "unidad única". Los potenciales de acción registrados son muy similares a los potenciales de acción que se registran intracelularmente, pero las señales son mucho más pequeñas (normalmente alrededor de 1 mV). La mayoría de los registros de la actividad de neuronas individuales en animales anestesiados y conscientes se realizan de esta manera. Los registros de neuronas individuales en animales vivos han proporcionado información importante sobre cómo el cerebro procesa la información. Por ejemplo, David Hubel y Torsten Wiesel registraron la actividad de neuronas individuales en la corteza visual primaria del gato anestesiado y mostraron cómo las neuronas individuales en esta área responden a características muy específicas de un estímulo visual. ^[8] Hubel y Wiesel recibieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1981. ^[9]

Para preparar el cerebro para la inserción de los electrodos, se suelen emplear dispositivos de corte delicados, como el vibratomo compresstome, el vibratomo Leica o el micrótomo. Estos instrumentos ayudan a obtener secciones cerebrales precisas y delgadas, necesarias para la colocación de los electrodos, lo que permite a los neurocientíficos apuntar a regiones cerebrales específicas para registrarlas. ^[10]

Si la punta del electrodo es ligeramente más grande, el electrodo puede registrar la actividad generada por varias neuronas. Este tipo de registro se denomina a menudo "registro de unidades múltiples" y se utiliza a menudo en animales conscientes para registrar cambios en la actividad de una zona cerebral discreta durante la actividad normal. Los registros de uno o más electrodos de este tipo que están muy espaciados se pueden utilizar para identificar el número de células que lo rodean, así como qué picos proceden de qué célula. Este proceso se denomina clasificación de picos y es adecuado en áreas en las que se han identificado tipos de células con características de pico bien definidas. Si la punta del electrodo es aún más grande, en general no se puede distinguir la actividad de neuronas individuales, pero el electrodo podrá registrar un potencial de campo generado por la actividad de muchas células.

Los potenciales de campo extracelulares son sumideros o fuentes de corriente locales que se generan por la actividad colectiva de muchas células. Por lo general, un potencial de campo se genera por la activación simultánea de muchas neuronas mediante transmisión sináptica . El diagrama de la derecha muestra los potenciales de campo sináptico del hipocampo. A la derecha, el trazo inferior muestra una onda negativa que corresponde a un sumidero de corriente causado por cargas positivas que ingresan a las células a través de los receptores de glutamato postsinápticos , mientras que el trazo superior muestra una onda positiva que se genera por la corriente que sale de la célula (en el cuerpo celular) para completar el circuito. Para obtener más información, consulte potencial de campo local .

La amperometría utiliza un electrodo de carbono para registrar los cambios en la composición química de los componentes oxidados de una solución biológica. La oxidación y la reducción se logran modificando el voltaje en la superficie activa del electrodo de registro en un proceso conocido como "escaneo". Debido a que ciertas sustancias químicas del cerebro pierden o ganan electrones a voltajes característicos, se pueden identificar especies individuales. La amperometría se ha utilizado para estudiar la exocitosis en los sistemas nervioso y endocrino. Muchos neurotransmisores monoamínicos , por ejemplo, la norepinefrina (noradrenalina), la dopamina y la serotonina (5-HT), son oxidables. El método también se puede utilizar con células que no secretan neurotransmisores oxidables "cargándolas" con 5-HT o dopamina.

La fijación de parche planar es un método novedoso desarrollado para la electrofisiología de alto rendimiento. ^[11] En lugar de colocar una pipeta sobre una célula adherente, se pipetea una suspensión celular sobre un chip que contiene una abertura microestructurada. Luego, se coloca una sola célula sobre el orificio mediante succión y se forma una conexión hermética (Gigaseal). La geometría planar ofrece una variedad de ventajas en comparación con el experimento clásico:

• Permite la integración de microfluidos , lo que posibilita la aplicación automática de compuestos para la detección de canales iónicos .
• El sistema es accesible para técnicas de sonda óptica o de escaneo .
• Se puede realizar perfusión del lado intracelular .

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  Dibujo esquemático de la configuración clásica de la pipeta de parche. La pipeta de parche se mueve hacia la célula utilizando un micromanipulador bajo control óptico. Deben evitarse los movimientos relativos entre la pipeta y la célula para mantener intacta la conexión entre la célula y la pipeta.
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  Imagen de microscopio electrónico de barrido de una pipeta de parche.
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  En la configuración de parche plano, la celda se posiciona por succión. Los movimientos relativos entre la celda y la abertura se pueden excluir después del sellado. No es necesaria una mesa antivibración.
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  Imagen de microscopio electrónico de barrido de un chip de fijación de parche planar. Tanto la pipeta como el chip están hechos de vidrio de borosilicato .

Con este enfoque electrofisiológico, los liposomas proteicos, las vesículas de membrana o los fragmentos de membrana que contienen el canal o transportador de interés se adsorben a una monocapa lipídica pintada sobre un electrodo funcionalizado. Este electrodo consta de un soporte de vidrio, una capa de cromo , una capa de oro y una monocapa de octadecil mercaptano . Debido a que la membrana pintada está sostenida por el electrodo, se denomina membrana con soporte sólido. Las perturbaciones mecánicas, que generalmente destruyen una membrana lipídica biológica, no influyen en la vida útil de una SSM. El electrodo capacitivo (compuesto por la SSM y las vesículas absorbidas) es tan estable mecánicamente que las soluciones pueden intercambiarse rápidamente en su superficie. Esta propiedad permite la aplicación de saltos rápidos de concentración de sustrato/ligando para investigar la actividad electrogénica de la proteína de interés, medida a través del acoplamiento capacitivo entre las vesículas y el electrodo. ^[12]

El ensayo de reconocimiento bioeléctrico (BERA) es un nuevo método para la determinación de varias moléculas químicas y biológicas midiendo los cambios en el potencial de membrana de las células inmovilizadas en una matriz de gel. Aparte de la mayor estabilidad de la interfaz electrodo-célula, la inmovilización preserva la viabilidad y las funciones fisiológicas de las células. BERA se utiliza principalmente en aplicaciones de biosensores para ensayar analitos que pueden interactuar con las células inmovilizadas cambiando el potencial de membrana celular. De esta manera, cuando se añade una muestra positiva al sensor, se produce un cambio característico, "similar a una firma", en el potencial eléctrico. BERA es la tecnología central detrás del proyecto paneuropeo FOODSCAN lanzado recientemente, sobre la evaluación de riesgos de pesticidas y alimentos en Europa. ^[13] BERA se ha utilizado para la detección de virus humanos ( virus de la hepatitis B y C y virus del herpes ), ^[14] agentes patógenos veterinarios ( virus de la fiebre aftosa , priones y virus de la lengua azul ) y virus vegetales (virus del tabaco y del pepino) ^[15] de una manera específica, rápida (1-2 minutos), reproducible y rentable. El método también se ha utilizado para la detección de toxinas ambientales, como pesticidas ^{[16] [17] [18]} y micotoxinas ^[19] en alimentos, y 2,4,6-tricloroanisol en corcho y vino, ^{[20] [21]} así como la determinación de concentraciones muy bajas del anión superóxido en muestras clínicas. ^{[22] [23]}

Un sensor BERA tiene dos partes:

• Los elementos consumibles de biorreconocimiento
• El dispositivo de lectura electrónica con inteligencia artificial incorporada . ^[24]

Un avance reciente es el desarrollo de una técnica llamada identificación molecular mediante ingeniería de membranas (MIME, por sus siglas en inglés). Esta técnica permite construir células con una especificidad definida para prácticamente cualquier molécula de interés, mediante la incorporación de miles de receptores artificiales en la membrana celular. ^[25]

Aunque no constituyen estrictamente una medición experimental, se han desarrollado métodos para examinar las propiedades conductoras de las proteínas y biomembranas in silico . Se trata principalmente de simulaciones de dinámica molecular en las que un sistema modelo como una bicapa lipídica se somete a un voltaje aplicado externamente. Los estudios que utilizan estas configuraciones han permitido estudiar fenómenos dinámicos como la electroporación de membranas ^[26] y la translocación de iones por canales. ^[27]

La ventaja de estos métodos es el alto nivel de detalle del mecanismo de conducción activa, dado por la inherentemente alta resolución y densidad de datos que ofrece la simulación atomística. Existen desventajas significativas, dadas por la incertidumbre de la legitimidad del modelo y el costo computacional de modelar sistemas que sean lo suficientemente grandes y en suficientes escalas de tiempo como para ser considerados como reproducciones de las propiedades macroscópicas de los propios sistemas. Si bien las simulaciones atomísticas pueden acceder a escalas de tiempo cercanas o dentro del dominio de los microsegundos, esto sigue siendo varios órdenes de magnitud menor que incluso la resolución de métodos experimentales como el patch-clamping. ^{[ cita requerida ]}

La electrofisiología clínica es el estudio de cómo se pueden aplicar los principios y tecnologías electrofisiológicos a la salud humana. Por ejemplo, la electrofisiología cardíaca clínica es el estudio de las propiedades eléctricas que rigen el ritmo y la actividad del corazón. La electrofisiología cardíaca se puede utilizar para observar y tratar trastornos como la arritmia (latidos cardíacos irregulares). Por ejemplo, un médico puede insertar un catéter que contiene un electrodo en el corazón para registrar la actividad eléctrica del músculo cardíaco.

Otro ejemplo de electrofisiología clínica es la neurofisiología clínica . En esta especialidad médica, los médicos miden las propiedades eléctricas del cerebro , la médula espinal y los nervios . Se considera que científicos como Duchenne de Boulogne (1806-1875) y Nathaniel A. Buchwald (1924-2006) hicieron avanzar enormemente el campo de la neurofisiología , lo que permitió sus aplicaciones clínicas.

Las normas de información mínima (IM) o las directrices de presentación de informes especifican la cantidad mínima de metadatos (información) y datos necesarios para cumplir uno o varios objetivos específicos en un estudio clínico. La familia de documentos de directrices de presentación de informes "Información mínima sobre una investigación en neurociencia" (MINI) tiene como objetivo proporcionar un conjunto coherente de directrices para informar sobre un experimento de electrofisiología. En la práctica, un módulo MINI comprende una lista de verificación de información que debe proporcionarse (por ejemplo, sobre los protocolos empleados) cuando se describe un conjunto de datos para su publicación. ^[28]

• Capítulo de libro sobre Planar Patch Clamp Archivado el 31 de marzo de 2010 en Wayback Machine.