Métodos optogenéticos para registrar la actividad celular

La optogenética comenzó con métodos para alterar la actividad neuronal con luz, utilizando, por ejemplo, canalrodopsinas . En un sentido más amplio, los enfoques optogenéticos también incluyen el uso de biosensores codificados genéticamente para monitorear la actividad de las neuronas u otros tipos de células midiendo la fluorescencia o la bioluminiscencia . Los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI) se utilizan con frecuencia para monitorear la actividad neuronal, pero también se pueden registrar ópticamente otros parámetros celulares como el voltaje de la membrana o la actividad del segundo mensajero. El uso de sensores optogenéticos no se limita a la neurociencia , sino que desempeña papeles cada vez más importantes en la inmunología , la cardiología y la investigación del cáncer .

Los primeros experimentos para medir los niveles intracelulares de calcio a través de la expresión de proteínas se basaron en aequorina , una proteína bioluminiscente de la medusa Aequorea . Sin embargo, para producir luz, esta enzima necesita el compuesto "combustible" coelenteracina , que debe agregarse a la preparación. Esto no es práctico en animales intactos y, además, la resolución temporal de las imágenes de bioluminiscencia es relativamente pobre (segundos-minutos). El primer indicador de calcio fluorescente codificado genéticamente (GECI) que se utilizó para obtener imágenes de la actividad en un animal fue cameleon , diseñado por Atsushi Miyawaki, Roger Tsien y colaboradores en 1997. ^[1] Cameleon fue utilizado por primera vez con éxito en un animal por Rex Kerr, William Schafer y colaboradores para registrar neuronas y células musculares del nematodo C. elegans . ^[2] Cameleon se utilizó posteriormente para registrar la actividad neuronal en moscas ^[3] y pez cebra. ^[4] En mamíferos, el primer GECI que se utilizó in vivo fue GCaMP , ^[5] desarrollado por primera vez por Junichi Nakai y colaboradores en 2001. ^[6] GCaMP ha experimentado numerosas mejoras, en particular por un equipo de científicos del Janelia Farm Research Campus (proyecto GENIE, HHMI ), y GCaMP6 ^[7] en particular se ha utilizado ampliamente en neurociencia. Muy recientemente, se han aprovechado los receptores acoplados a proteína G para generar una serie de indicadores altamente específicos para varios neurotransmisores . ^{[8] [9]}

Los sensores codificados genéticamente son proteínas de fusión que consisten en un dominio de unión de ligando (sensor) y una proteína fluorescente , unidos por un enlace corto (péptido flexible). Cuando el dominio sensor se une al ligando correcto, cambia de conformación. Este movimiento se transfiere a la proteína fluorescente y la deformación resultante conduce a un cambio en la fluorescencia. La eficiencia de este proceso depende críticamente de la longitud de la región del enlace, que debe optimizarse en un proceso laborioso. La proteína fluorescente a menudo se permuta circularmente, es decir, se crean nuevos extremos C-terminales y N-terminales . Los sensores de longitud de onda única son fáciles de usar para mediciones cualitativas, pero difíciles de calibrar para mediciones cuantitativas de la concentración de ligando.

Una segunda clase de sensores se basa en la transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) entre dos proteínas fluorescentes (FP) de diferente color. La FP de longitud de onda más corta (donante) se excita con luz azul de un láser o LED. Si la segunda FP (aceptor) está muy cerca, la energía se transfiere al aceptor, lo que da como resultado una fluorescencia amarilla o roja. Cuando la FP aceptora se aleja, el donante emite fluorescencia verde. El dominio del sensor generalmente se empalma entre las dos FP, lo que da como resultado un movimiento de tipo bisagra al unirse el ligando que cambia la distancia entre el donante y el aceptor. El procedimiento de obtención de imágenes es más complejo para los sensores FRET, pero la relación de fluorescencia se puede calibrar para medir la concentración absoluta de un ligando. También es posible la lectura mediante imágenes de tiempo de vida de fluorescencia (FLIM) de la fluorescencia del donante, ya que el proceso FRET acelera la descomposición de la fluorescencia.

• Se puede orientar a clases específicas de células (por ejemplo, astrocitos o células piramidales ). Esto permite una lectura óptica sin resolución espacial, por ejemplo, fotometría de fibra de áreas profundas del cerebro. ^[10]
• Se puede dirigir a compartimentos subcelulares (por ejemplo, sinapsis, orgánulos , núcleo) fusionando la proteína indicadora con dominios de anclaje específicos, señales de retención o intracuerpos .
• Trabajar en una variedad de especies ( nematodos , insectos, peces, mamíferos) y en sistemas de cultivo celular ( ensayo FLIPR )
• Puede administrarse mediante vectores virales (por ejemplo, rAAV ).
• Se puede utilizar para registrar la actividad de miles de neuronas al mismo tiempo ^[11]

• amortiguará el ion o la proteína medidos, lo que podría interferir con la señalización celular
• Están sujetos a fotoblanqueo , lo que compromete las mediciones a largo plazo.
• Puede ser tóxico cuando se expresa en concentraciones muy altas.
• Requieren cámaras de alta sensibilidad o microscopios de escaneo láser
• Algunos sensores basados ​​en GPCR son sensibles a la polarización ^[12]
• La mayoría de los indicadores son fluorescentes verdes, lo que dificulta la medición simultánea de varios parámetros celulares ( multiplexación ).

Se han diseñado indicadores para medir concentraciones de iones, potencial de membrana, neurotransmisores y diversas moléculas de señalización intracelular. La siguiente lista proporciona solo ejemplos de cada clase; se han publicado muchos más.

• Indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI): una amplia clase de herramientas basadas en proteínas de unión al calcio naturales ( calmodulina , troponina ). Disponibles con distintas afinidades, cinéticas y colores (verde, rojo). Lectura por intensidad de fluorescencia (indicadores de longitud de onda única), FRET o BRET . Se han dirigido a varios orgánulos. Versión actual: JGCaMP8 ^[13]
• Indicadores de cloruro codificados genéticamente : Clomeleon ^[14]
• Indicadores de potasio codificados genéticamente : GINKO2 ^[15]
• Indicadores genéticamente codificados para el pH intracelular (GEPhI): CypHer ^[16]
• Indicadores de voltaje codificados genéticamente (GEVI): ArcLight ^[17]
• Sensores de fusión de vesículas codificados genéticamente: sinapto-pHluorina , sinaptofisina-pHluorina ^[18]
• Sensores de AMPc codificados genéticamente: EPAC ^[19]
• Sensores de ATP codificados genéticamente : QUEEN-37C ^[20]
• Sensores de actividad de quinasas codificados genéticamente : CaMui, ^[21] SmURFP
• Sensores de proteína G pequeña codificados genéticamente: FRas ^[22]

• Sensores de glutamato codificados genéticamente: GluSnFR ^[23]
• Sensores GABA codificados genéticamente : iGABASnFR ^[24]
• Sensores de dopamina codificados genéticamente : dLight1, ^[25] GRAB-DA ^[26]
• Sensores de serotonina codificados genéticamente : GRAB _5-HT , ^[27] sDarken, ^[28] iSeroSnFR ^[29]
• Sensores de noradrenalina codificados genéticamente : GRAB _NE ^[30]
• Sensor codificado genéticamente para la actividad endocannabinoide : GRAB _eCB2.0 ^[31]
• Sensor codificado genéticamente para neuropéptidos orexina/hipocretina : OxLight1 ^[32]
• Sensor codificado genéticamente para lactato : eLACCO1.1 ^[33]

Una revisión reciente de indicadores fluorescentes codificados genéticamente basados ​​en GPCR para neuromoduladores ^[9]

• Base de datos de biosensores fluorescentes, una lista de búsqueda bastante completa de sensores publicados y sus propiedades básicas, mantenida por el laboratorio de Jin Zhang en la UCSD. ^[34]
• Biosensores fluorescentes disponibles en Addgene , un repositorio de plásmidos sin fines de lucro.