Lector de placas

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Los lectores de placas , también conocidos como lectores de microplacas o fotómetros de microplacas , son instrumentos que se utilizan para detectar eventos biológicos , químicos o físicos de muestras en placas de microtitulación . Se utilizan ampliamente en investigación, descubrimiento de fármacos , ^[1] validación de bioensayos, control de calidad y procesos de fabricación en la industria farmacéutica y biotecnológica y en organizaciones académicas. Las reacciones de las muestras se pueden analizar en placas de microtitulación con formato de 1 a 1536 pocillos. El formato de microplaca más común utilizado en laboratorios de investigación académica o laboratorios de diagnóstico clínico es el de 96 pocillos (matriz de 8 por 12) con un volumen de reacción típico entre 100 y 200 μL por pocillo. Las microplacas de mayor densidad (microplacas de 384 o 1536 pocillos) se utilizan normalmente para aplicaciones de cribado, cuando el rendimiento (número de muestras procesadas por día) y el coste del ensayo por muestra se convierten en parámetros críticos, con un volumen de ensayo típico entre 5 y 50 μL por pocillo. Los modos de detección comunes para ensayos de microplacas son absorbancia, intensidad de fluorescencia , luminiscencia , fluorescencia resuelta en el tiempo y polarización de fluorescencia .

La detección de absorbancia ha estado disponible en lectores de microplacas durante más de 3 décadas y se utiliza para ensayos como ensayos ELISA , cuantificación de proteínas y ácidos nucleicos o ensayos de actividad enzimática ^[2] (es decir, en el ensayo MTT para viabilidad celular). ^[3] Una fuente de luz ilumina la muestra utilizando una longitud de onda específica (seleccionada por un filtro óptico o un monocromador), y un detector de luz ubicado en el otro lado del pocillo mide qué cantidad de la luz inicial (100%) se transmite a través de la muestra: la cantidad de luz transmitida normalmente estará relacionada con la concentración de la molécula de interés. Varios análisis colorimétricos convencionales se han miniaturizado para funcionar cuantitativamente en un lector de placas, con un rendimiento adecuado para fines de investigación. Los ejemplos de análisis convertidos a métodos de lectores de placas incluyen varios para amonio , nitrato , nitrito , ^[4] urea , ^[5] hierro (II), ^[6] y ortofosfato . ^[7] Se han desarrollado químicas colorimétricas más recientes directamente para su uso en lectores de placas. ^[8]

La detección de la intensidad de fluorescencia se ha desarrollado de forma muy amplia en el formato de microplaca durante las dos últimas décadas. El rango de aplicaciones es mucho más amplio que cuando se utiliza la detección por absorbancia, pero la instrumentación suele ser más cara. En este tipo de instrumentación, un primer sistema óptico (sistema de excitación) ilumina la muestra utilizando una longitud de onda específica (seleccionada por un filtro óptico o un monocromador). Como resultado de la iluminación, la muestra emite luz (fluoresce) y un segundo sistema óptico (sistema de emisión) recoge la luz emitida, la separa de la luz de excitación (utilizando un sistema de filtro o monocromador) y mide la señal utilizando un detector de luz como un tubo fotomultiplicador (PMT). Las ventajas de la detección de fluorescencia sobre la detección por absorbancia son la sensibilidad, así como el rango de aplicación, dada la amplia selección de marcadores fluorescentes disponibles en la actualidad. Por ejemplo, una técnica conocida como imagen de calcio mide la intensidad de fluorescencia de los colorantes sensibles al calcio para evaluar los niveles de calcio intracelular. ^[9]

La luminiscencia es el resultado de una reacción química o bioquímica. La detección de la luminiscencia es más sencilla ópticamente que la detección de la fluorescencia porque la luminiscencia no requiere una fuente de luz para la excitación ni una óptica para seleccionar longitudes de onda de excitación discretas. Un sistema óptico de luminiscencia típico consta de una cámara de lectura hermética a la luz y un detector de fotones . Algunos lectores de placas utilizan un detector de fotones analógico, mientras que otros tienen un detector de fotones de conteo . El conteo de fotones es ampliamente aceptado como el medio más sensible para detectar la luminiscencia. Algunos lectores de placas ofrecen sistemas ópticos de rueda de filtros o monocromador de longitud de onda ajustable para seleccionar longitudes de onda luminiscentes específicas. La capacidad de seleccionar múltiples longitudes de onda, o incluso rangos de longitud de onda, permite la detección de ensayos que contienen múltiples enzimas indicadoras luminiscentes, el desarrollo de nuevos ensayos de luminiscencia, así como un medio para optimizar la relación señal/ruido. ^{[ cita requerida ]}

Las aplicaciones comunes incluyen ensayos de expresión genética basados ​​en luciferasa , así como ensayos de viabilidad celular, citotoxicidad y biorritmo basados ​​en la detección luminiscente de ATP . ^[10]

La medición de fluorescencia resuelta en el tiempo (TRF) es muy similar a la medición de intensidad de fluorescencia (FI). La única diferencia es el momento del proceso de excitación/medición. Al medir FI, los procesos de excitación y emisión son simultáneos: la luz emitida por la muestra se mide mientras se produce la excitación. Aunque los sistemas de emisión son muy eficientes a la hora de eliminar la luz de excitación antes de que llegue al detector, la cantidad de luz de excitación en comparación con la luz de emisión es tal que las mediciones de FI siempre muestran señales de fondo bastante elevadas. TRF ofrece una solución a este problema. Se basa en el uso de moléculas fluorescentes muy específicas, llamadas lantánidos , que tienen la propiedad inusual de emitir durante largos períodos de tiempo (medidos en milisegundos) después de la excitación, cuando la mayoría de los colorantes fluorescentes estándar (por ejemplo, la fluoresceína) emiten en unos pocos nanosegundos después de ser excitados. Como resultado, es posible excitar los lantánidos utilizando una fuente de luz pulsada (lámpara de destello de xenón o láser pulsado, por ejemplo) y medir después del pulso de excitación. Esto da como resultado unos fondos de medición más bajos que en los ensayos FI estándar. Las desventajas son que la instrumentación y los reactivos suelen ser más caros y que las aplicaciones tienen que ser compatibles con el uso de estos colorantes lantánidos muy específicos. El uso principal de TRF se encuentra en aplicaciones de detección de fármacos, bajo una forma llamada TR-FRET (transferencia de energía de fluorescencia resuelta en el tiempo). Los ensayos TR- FRET son muy robustos (sensibilidad limitada a varios tipos de interferencias del ensayo) y se miniaturizan fácilmente. La robustez, la capacidad de automatización y miniaturización son características que resultan muy atractivas en un laboratorio de detección. ^{[ cita requerida ]}

La medición de la polarización de la fluorescencia también está muy cerca de la detección de FI. La diferencia es que el sistema óptico incluye filtros polarizadores en la trayectoria de la luz: las muestras en la microplaca se excitan utilizando luz polarizada (en lugar de luz no polarizada en los modos FI y TRF). Dependiendo de la movilidad de las moléculas fluorescentes que se encuentran en los pocillos, la luz emitida será polarizada o no. Por ejemplo, las moléculas grandes (por ejemplo, las proteínas) en solución, que giran relativamente lentamente debido a su tamaño, emitirán luz polarizada cuando se exciten con luz polarizada. Por otro lado, la rotación rápida de moléculas más pequeñas dará como resultado una despolarización de la señal. El sistema de emisión del lector de placas utiliza filtros polarizadores para analizar la polaridad de la luz emitida. Un bajo nivel de polarización indica que las moléculas fluorescentes pequeñas se mueven libremente en la muestra. Un alto nivel de polarización indica que el fluorescente está unido a un complejo molecular más grande. Como resultado, una de las aplicaciones básicas de la detección de FP son los ensayos de unión molecular, ya que permiten detectar si una pequeña molécula fluorescente se une (o no) a una molécula más grande, no fluorescente: la unión da como resultado una velocidad de rotación más lenta de la molécula fluorescente y un aumento en la polarización de la señal. ^{[ cita requerida ]}

La dispersión de luz y la nefelometría son métodos para determinar la turbidez de una solución (es decir, partículas insolubles en una solución). Un haz de luz pasa a través de la muestra y la luz es dispersada por las partículas suspendidas. La luz dispersada hacia adelante medida indica la cantidad de partículas insolubles presentes en la solución. Las aplicaciones comunes de nefelometría/dispersión de luz incluyen la detección automatizada de la solubilidad de fármacos mediante HTS, la cinética del crecimiento microbiano a largo plazo, la floculación, la agregación y el monitoreo de la polimerización y la precipitación, incluida la inmunoprecipitación. ^{[ cita requerida ]}

Muchos de los modos de detección (absorbancia, intensidad de fluorescencia, luminiscencia, fluorescencia resuelta en el tiempo y polarización de fluorescencia) están disponibles de forma independiente en lectores de placas dedicados, pero hoy en día se encuentran muy a menudo combinados en un solo instrumento (lector de placas multimodo). También existen instrumentos para medir la luz dinámica o estática dispersada por las muestras en una microplaca. La gama de aplicaciones de los lectores de placas multimodo es extremadamente amplia. Algunos de los ensayos más comunes son:

• Pruebas ELISA
• Ensayos de crecimiento de proteínas y células .
• Interacción proteína-proteína
• Ensayos de reporteros
• Cuantificación de ácidos nucleicos
• Interacciones moleculares
• Actividad enzimática
• Toxicidad, proliferación y viabilidad celular.
• Cuantificación de ATP
• Inmunoensayos ^[11]
• Detección de alto rendimiento de compuestos y objetivos en el descubrimiento de fármacos (Labeled Alpha Screen en la mayoría de los instrumentos) ^[12]
• Ensayo de epítopos basado en perlas ^[13]
• Captación celular de nanopartículas ^[14]

Aunque el término "lector de placas" suele referirse a los dispositivos descritos anteriormente, existen muchas variantes disponibles. Algunos ejemplos de otros dispositivos que funcionan con el formato de microplacas son:

• Lectores de placas ELISPOT , utilizados para contar las manchas de color que se forman durante los ensayos ELISPOT.
• Generadores de imágenes de alto rendimiento que pueden medir todos los pocillos de una microplaca a la vez
• Sistemas de detección de alto contenido (HCS) que toman imágenes de cada pocillo con alta resolución para observar poblaciones de células.
• Instrumentos sin etiquetas que utilizan microplacas especializadas para medir eventos de unión sin el uso de marcadores químicos