GCaMP

GCaMP es un indicador de calcio codificado genéticamente (GECI) desarrollado inicialmente en 2001 por Junichi Nakai. ^[1] Es una fusión sintética de proteína fluorescente verde (GFP), calmodulina (CaM) y M13, una secuencia peptídica de la quinasa de la cadena ligera de miosina . ^[2] Cuando se une a Ca ²⁺ , GCaMP fluoresce en verde con una longitud de onda de excitación máxima de 480 nm y una longitud de onda de emisión máxima de 510 nm. ^[3] Se utiliza en investigación biológica para medir los niveles intracelulares de Ca ²⁺ tanto in vitro como in vivo utilizando líneas celulares y animales transfectadas viralmente o transgénicas . ^{[2] [4]} La secuencia genética que codifica GCaMP se puede insertar bajo el control de promotores exclusivos de ciertos tipos de células, lo que permite la expresión específica del tipo de célula de GCaMP. ^[5] Dado que el Ca ²⁺ es un segundo mensajero que contribuye a muchos mecanismos celulares y vías de señalización , GCaMP permite a los investigadores cuantificar la actividad de los mecanismos basados ​​en Ca ²⁺ y estudiar el papel de los iones Ca ²⁺ en procesos biológicos de interés.

GCaMP consta de tres dominios clave: un dominio M13 en el extremo N , un dominio de calmodulina (CaM) en el extremo C y un dominio GFP en el centro. El dominio GFP está permutado circularmente de modo que los extremos N y C nativos se fusionan mediante una secuencia de enlace de seis aminoácidos , y la secuencia GFP se divide en el medio, creando nuevos extremos N y C que se conectan a los dominios M13 y CaM. ^[6]

En ausencia de Ca ^{2+ , el} cromóforo GFP se expone al agua y existe en un estado protonado con una intensidad de fluorescencia mínima. Tras la unión de Ca ^{2+ , el dominio CaM sufre un cambio conformacional y se une firmemente a la} hélice alfa del dominio M13 , impidiendo que las moléculas de agua accedan al cromóforo. Como resultado, el cromóforo se desprotona rápidamente y se convierte en una forma aniónica que emite una fluorescencia brillante, similar a la GFP nativa. ^[7]

En 2001, Nakai et al. informaron sobre el desarrollo de GCaMP1 como una sonda de Ca ^{2+ con} una relación señal-ruido mejorada en comparación con las sondas de Ca ²⁺ fluorescentes desarrolladas previamente . ^[1] El primer ratón transgénico que expresaba GCaMP1 se informó en 2004. ^[5] Sin embargo, a 37 ˚C (temperatura fisiológica en mamíferos), GCaMP1 no se plegó de manera estable ni emitió fluorescencia, lo que limitó su uso potencial como indicador de calcio in vivo. ^{[1] [8]}

En 2006, Tallini et al. informaron posteriormente de la mejora de GCaMP1 a GCaMP2, que exhibió una fluorescencia más brillante que GCaMP1 y una mayor estabilidad a temperaturas corporales de mamíferos . Tallini et al. expresaron GCaMP2 en cardiomiocitos en embriones de ratón para realizar la primera obtención de imágenes in vivo de GCaMP de Ca ²⁺ en mamíferos. ^[8]

Se han desarrollado modificaciones adicionales de GCaMP, incluidas GCaMP3, GCaMP5, GCaMP6 y jGCaMP7, para mejorar progresivamente la señal, la sensibilidad y el rango dinámico de la detección de Ca ²⁺ , ^{[2] [9] [10] [11]} con versiones recientes que exhiben una fluorescencia similar a la GFP nativa. ^[11]

Tanto las variantes lentas (GCaMP6s, jGCaMP7s) como las variantes rápidas (GCaMP6f, jGCaMP7f) se utilizan en la investigación biológica y neurocientífica . Las variantes lentas son más brillantes y más sensibles a pequeños cambios en los niveles de Ca ²⁺ , como los potenciales de acción individuales ; por otro lado, las variantes rápidas son menos sensibles pero responden más rápidamente, lo que las hace útiles para rastrear cambios en los niveles de Ca ²⁺ en escalas de tiempo precisas. ^{[12] [13]} GCaMP6 también tiene una variante media, GCaMP6m, cuya cinética es intermedia entre GCaMP6s y GCaMP6f. ^[12] También se emplean otras variantes de jGCaMP7: jGCaMP7b exhibe fluorescencia basal brillante y se utiliza para obtener imágenes de dendritas y axones , mientras que jGCaMP7c exhibe un mayor contraste entre la fluorescencia máxima y basal y es ventajoso para obtener imágenes de grandes poblaciones de neuronas. ^[12]

En 2018, Yang et al. informaron sobre el desarrollo de GCaMP-X, generado mediante la adición de un motivo de unión a calmodulina. Dado que el dominio de calmodulina de GCaMP, cuando no está unido, altera la activación del canal de calcio de tipo L , el motivo de unión a calmodulina añadido evita que GCaMP-X interfiera con los mecanismos de señalización dependientes del calcio. ^[14]

En 2020, Zhang et al. informaron el desarrollo de jGCaMP8, incluidas las variantes sensibles, medias y rápidas, que exhiben una cinética más rápida y una mayor sensibilidad que las variantes jGCaMP7 correspondientes. ^[15]

También se han desarrollado indicadores fluorescentes rojos: jRCaMP1a y jRCaMP1b utilizan una permutación circular de la proteína fluorescente roja mRuby en lugar de GFP, mientras que jRGECO1a se basa en la proteína fluorescente roja mApple. ^{[12] [16]} Dado que la luz azul utilizada para excitar GCaMP se dispersa por el tejido y la luz verde emitida es absorbida por la sangre, los indicadores fluorescentes rojos proporcionan más penetración y profundidad de imagen in vivo que GCaMP. El uso de indicadores fluorescentes rojos también evita el fotodaño causado por la luz de excitación azul. ^[16] Además, los indicadores fluorescentes rojos permiten el uso simultáneo de optogenética , lo que es difícil con GCaMP porque las longitudes de onda de excitación de GCaMP se superponen con las de la canalrodopsina-2 (ChR2). ^{[16] [17] [18]} El uso simultáneo de GECI rojos y verdes puede proporcionar una visualización de dos colores de diferentes regiones subcelulares o poblaciones de células. ^{[16] [17] [19]}

En las neuronas, los potenciales de acción inducen la liberación de neurotransmisores en las terminales axónicas al abrir canales de Ca ²⁺ dependientes del voltaje , lo que permite la entrada de Ca ²⁺ . Como resultado, GCaMP se usa comúnmente para medir aumentos en Ca ²⁺ intracelular en neuronas como un indicador de la actividad neuronal en múltiples modelos animales, incluidos Caenorhabditis elegans , pez cebra , Drosophila y ratones . ^[20] Recientemente, se han desarrollado indicadores de voltaje codificados genéticamente (GEVI) junto con GECI para investigar más directamente la actividad neuronal a nivel celular en estos modelos animales. ^[21]

La GCaMP ha desempeñado un papel fundamental en el establecimiento de registros neuronales a gran escala en animales para investigar cómo los patrones de actividad en las redes neuronales influyen en el comportamiento. Por ejemplo, Nguyen et al. (2016) utilizaron GCaMP en imágenes de todo el cerebro durante el movimiento libre de C. elegans para identificar neuronas y grupos de neuronas cuya actividad se correlacionaba con comportamientos locomotrices específicos. ^[22]

Muto et al. (2003) expresaron GCaMP en embriones de pez cebra para medir y mapear la actividad coordinada de las neuronas motoras espinales en diferentes partes del cerebro durante el inicio, propagación y recuperación de las convulsiones inducidas por pentilentetrazol . ^[23] La expresión de GCaMP en cerebros de pez cebra también se ha utilizado para estudiar la activación de circuitos neuronales en procesos cognitivos como la captura de presas, el control de impulsos y la atención. ^{[24] [25]}

Además, los investigadores han utilizado GCaMP para observar la actividad neuronal en ratones expresándola bajo el control del promotor Thy1 , que se encuentra en las neuronas piramidales excitatorias . ^[26] Por ejemplo, la integración de neuronas en circuitos durante el aprendizaje motor se ha rastreado utilizando GCaMP para observar patrones de fluctuación sincronizados en los niveles de Ca ²⁺ . ^{[27] [28] [29]} GCaMP también se ha utilizado para observar la dinámica del Ca ^{2+ en compartimentos subcelulares de neuronas de ratón: Cichon y Gan (2015) utilizaron GCaMP para mostrar que las neuronas en la} corteza motora del ratón exhiben aumentos impulsados ​​por NMDA en Ca ²⁺ que son independientes para cada espina dendrítica , mostrando así que las espinas dendríticas individuales regulan la plasticidad sináptica . ^[30] Finalmente, GCaMP se ha utilizado para identificar patrones de actividad en regiones específicas del cerebro del ratón. Por ejemplo, Jones et al. (2018) utilizaron GCaMP6 en ratones para medir la actividad neuronal en el núcleo supraquiasmático (SCN), el marcapasos circadiano de los mamíferos , y demostraron que las neuronas del SCN que producían péptido intestinal vasoactivo (VIP) exhibían ritmos de actividad diaria in vivo que se correlacionaban con la liberación de VIP. ^[31]

La GCaMP también se ha combinado con fotometría de fibra para medir cambios de Ca ²⁺ a nivel de población dentro de subpoblaciones de neuronas en animales que se mueven libremente. ^[32] Por ejemplo, Clarkson et al. (2017) utilizaron este método para demostrar que las neuronas en el núcleo arqueado del hipotálamo se sincronizan con aumentos de Ca ²⁺ inmediatamente antes de los pulsos de hormona luteinizante (LH). ^[33] Si bien la obtención de imágenes de GCaMP con fotometría de fibra no puede rastrear cambios en los niveles de Ca ²⁺ dentro de neuronas individuales, proporciona una mayor resolución temporal para cambios a gran escala. ^[34]

Las corrientes de Ca ^{2+ a través de} las uniones gap de los cardiomiocitos median la contracción sincronizada del tejido cardíaco. Como resultado, la expresión de GCaMP en cardiomiocitos, tanto in vitro como in vivo , se ha utilizado para estudiar la excitación y la contracción dependientes del influjo de Ca ^{2+ en peces cebra y ratones. [35]} Por ejemplo, Tallini et al. (2006) expresaron GCaMP2 en embriones de ratón para demostrar que, en el día embrionario 10,5, la conducción eléctrica era rápida en las aurículas y los ventrículos, pero lenta en el canal auriculoventricular . ^[8] Chi et al. (2008) utilizaron una línea de pez cebra transgénica GCaMP específica para el corazón para obtener imágenes de la activación de los cardiomiocitos a lo largo del ciclo cardíaco; a partir de sus resultados, caracterizaron cuatro etapas de desarrollo del sistema de conducción cardíaca del pez cebra e identificaron 17 mutaciones novedosas que afectan la conducción cardíaca. ^[36] Sin embargo, la expresión descontrolada de GCaMP conduce a hipertrofia cardíaca debido a la sobreexpresión del motivo calmodulina, que interfiere con la señalización intracelular del calcio. Como resultado, los experimentos que utilizan tejido cardíaco deben controlar cuidadosamente el nivel de expresión de GCaMP. ^[8]

Dado que el Ca ²⁺ es un segundo mensajero común, se ha utilizado GCaMP para controlar la activación de las vías de señalización. Por ejemplo, Bonder y McCarthy (2014) utilizaron GCaMP para demostrar que la señalización del receptor acoplado a proteína G (GPCR) astrocítico y la posterior liberación de Ca ²⁺ no eran responsables del acoplamiento neurovascular, el proceso por el cual los cambios en la actividad neuronal conducen a cambios en el flujo sanguíneo local. ^[37] De manera similar, Greer y Bear et al. (2016) utilizaron GCaMP para caracterizar la dinámica del influjo de Ca ^{2+ en la señalización de las neuronas} olfativas de collar , que utiliza proteínas transmembrana MS4A como quimiorreceptores . ^[38]

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