Crispr
Familia de secuencias de ADN encontradas en organismos procariotas

Cascade (complejo asociado a CRISPR para defensa antiviral)
Proteína en cascada CRISPR (cian) unida al ARN CRISPR (verde) y al ADN del fago (rojo) [1]
Identificadores
OrganismoEscherichia coli
SímboloCrispr
Entre947229
AP4QYZ
Secuencia de referencia (protección)NP_417241.1
Protección unificadaP38036
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EstructurasModelo suizo
DominiosInterprofesional
Parte de una serie sobre
Crispr
 
Edición del genoma : CRISPR-Cas

variantes:

Anti-CRISPR - CIRTS - CRISPeY
CRISPR-Cas10 - CRISPR-Cas13 - CRISPR-BEST
CRISPR-Disp - CRISPR-Gold - CRISPRa - CRISPRi
Easi-CRISPR - CARA
Enzyme
Cas9 - FokI - EcoRI - PstI - SmaI
HaeIII - Cas12a (Cpf1) - xCas9
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CAMERA - ICE - Genética dirigida
other Genome editing method:
Prime editing - Pro-AG - RESCUE - TALEN - ZFN - LEAPER
Part of a series on
Genetic engineering
 
Genetically modified organisms
History and regulation
Process
Applications
Controversies

CRISPR ( / ˈkrɪspər / ) (un acrónimo de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas ) es una familia de secuencias de ADN que se encuentran en los genomas de organismos procariotas como bacterias y arqueas . [ 2 ] Estas secuencias se derivan de fragmentos de ADN de bacteriófagos que previamente habían infectado al procariota. Se utilizan para detectar y destruir ADN de bacteriófagos similares durante infecciones posteriores. Por lo tanto, estas secuencias juegan un papel clave en el sistema de defensa antiviral (es decir, antifago ) de los procariotas y proporcionan una forma de inmunidad adquirida . [2] [3] [4] [5] CRISPR se encuentra en aproximadamente el 50% de los genomas bacterianos secuenciados y casi el 90% de las arqueas secuenciadas. [6]

Diagrama del mecanismo de defensa antiviral procariota CRISPR [7]

Cas9 (o "proteína 9 asociada a CRISPR") es una enzima que utiliza secuencias CRISPR como guía para reconocer y abrir cadenas específicas de ADN que son complementarias a la secuencia CRISPR. Las enzimas Cas9 junto con las secuencias CRISPR forman la base de una tecnología conocida como CRISPR-Cas9 que se puede utilizar para editar genes dentro de organismos vivos. [8] [9] Este proceso de edición tiene una amplia variedad de aplicaciones que incluyen investigación biológica básica, desarrollo de productos biotecnológicos y tratamiento de enfermedades. [10] [11] El desarrollo de la técnica de edición genómica CRISPR-Cas9 fue reconocido con el Premio Nobel de Química en 2020 otorgado a Emmanuelle Charpentier y Jennifer Doudna . [12] [13]

Historia

Secuencias repetidas

El descubrimiento de las repeticiones agrupadas de ADN se produjo de forma independiente en tres partes del mundo. La primera descripción de lo que más tarde se llamaría CRISPR es del investigador de la Universidad de Osaka Yoshizumi Ishino y sus colegas en 1987. Clonaron accidentalmente parte de una secuencia CRISPR junto con el gen "iap" (conversión de isoenzima de la fosfatasa alcalina) del genoma de Escherichia coli [14] [15] que era su objetivo. La organización de las repeticiones era inusual. Las secuencias repetidas suelen estar dispuestas consecutivamente, sin intercalar secuencias diferentes. [11] [15] No conocían la función de las repeticiones agrupadas interrumpidas.

En 1993, investigadores de Mycobacterium tuberculosis en los Países Bajos publicaron dos artículos sobre un grupo de repeticiones directas interrumpidas (DR) en esa bacteria. Reconocieron la diversidad de las secuencias que intervenían en las repeticiones directas entre diferentes cepas de M. tuberculosis [16] y utilizaron esta propiedad para diseñar un método de tipificación llamado spoligotyping , que todavía se utiliza en la actualidad. [17] [18]

Francisco Mojica, de la Universidad de Alicante (España), estudió la función de las repeticiones en las especies arqueales Haloferax y Haloarcula . El supervisor de Mojica supuso que las repeticiones agrupadas tenían un papel en la segregación correcta del ADN replicado en las células hijas durante la división celular, porque los plásmidos y los cromosomas con matrices de repeticiones idénticas no podían coexistir en Haloferax volcanii . También se observó por primera vez la transcripción de las repeticiones interrumpidas; esta fue la primera caracterización completa de CRISPR. [18] [19] En 2000, Mojica y sus estudiantes, después de una búsqueda automatizada de genomas publicados, identificaron repeticiones interrumpidas en 20 especies de microbios como pertenecientes a la misma familia. [20] Debido a que esas secuencias estaban interespaciadas, Mojica inicialmente las llamó "repeticiones cortas regularmente espaciadas" (SRSR). [21] En 2001, Mojica y Ruud Jansen, que buscaban repeticiones interrumpidas adicionales, propusieron el acrónimo CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) para unificar los numerosos acrónimos utilizados para describir estas secuencias. [19] [22] En 2002, Tang et al. mostraron evidencia de que las regiones de repetición CRISPR del genoma de Archaeoglobus fulgidus se transcribieron en moléculas de ARN largas que posteriormente se procesaron en ARN pequeños de longitud unitaria, además de algunas formas más largas de 2, 3 o más unidades de repetición espaciadora. [23] [24]

En 2005, el investigador de yogur Rodolphe Barrangou descubrió que Streptococcus thermophilus , después de desafíos iterativos de infección con fagos, desarrolla una mayor resistencia a los fagos debido a la incorporación de secuencias espaciadoras CRISPR adicionales. [25] El empleador de Barrangou, la empresa de alimentos danesa Danisco, desarrolló entonces cepas de S. thermophilus resistentes a los fagos para la producción de yogur. Danisco fue comprada más tarde por DuPont , que posee alrededor del 50 por ciento del mercado mundial de cultivos lácteos, y la tecnología se difundió ampliamente. [26]

Sistemas asociados a CRISPR

Un avance importante en la comprensión de CRISPR se produjo con la observación de Jansen de que el grupo de repeticiones procariotas estaba acompañado por cuatro genes homólogos que conforman los sistemas asociados a CRISPR, cas 1-4. Las proteínas Cas mostraron motivos de helicasa y nucleasa , lo que sugiere un papel en la estructura dinámica de los loci CRISPR. [27] En esta publicación, se utilizó el acrónimo CRISPR como el nombre universal de este patrón, pero su función siguió siendo enigmática.

Diagrama simplificado de un locus CRISPR. Se muestran los tres componentes principales de un locus CRISPR: genes cas , una secuencia líder y una matriz de repeticiones y espaciadores. Las repeticiones se muestran como cuadros grises y los espaciadores son barras de colores. La disposición de los tres componentes no siempre es la que se muestra. [28] [29] Además, pueden estar presentes varios CRISPR con secuencias similares en un solo genoma, de los cuales solo uno está asociado con genes cas . [30]

En 2005, tres grupos de investigación independientes demostraron que algunos espaciadores CRISPR se derivan del ADN de fagos y del ADN extracromosómico , como los plásmidos . [31] [32] [33] En efecto, los espaciadores son fragmentos de ADN obtenidos de virus que previamente atacaron la célula. La fuente de los espaciadores fue una señal de que el sistema CRISPR- cas podría tener un papel en la inmunidad adaptativa en bacterias . [28] [34] Los tres estudios que proponían esta idea fueron inicialmente rechazados por revistas de alto perfil, pero finalmente aparecieron en otras revistas. [35]

La primera publicación [32] que propone un papel de CRISPR-Cas en la inmunidad microbiana, de Mojica y colaboradores de la Universidad de Alicante , predijo un papel para la transcripción de ARN de los espaciadores en el reconocimiento de dianas en un mecanismo que podría ser análogo al sistema de interferencia de ARN utilizado por las células eucariotas. Koonin y colegas extendieron esta hipótesis de interferencia de ARN proponiendo mecanismos de acción para los diferentes subtipos de CRISPR-Cas según la función predicha de sus proteínas. [36]

El trabajo experimental de varios grupos reveló los mecanismos básicos de la inmunidad CRISPR-Cas. En 2007, se publicó la primera evidencia experimental de que CRISPR era un sistema inmunológico adaptativo. [4] [11] Una región CRISPR en Streptococcus thermophilus adquirió espaciadores del ADN de un bacteriófago infectante . Los investigadores manipularon la resistencia de S. thermophilus a diferentes tipos de fagos agregando y eliminando espaciadores cuya secuencia coincidía con las encontradas en los fagos probados. [37] [38] En 2008, Brouns y Van der Oost identificaron un complejo de proteínas Cas llamado Cascade, que en E. coli corta el precursor de ARN CRISPR dentro de las repeticiones en moléculas de ARN maduras que contienen espaciadores llamadas ARN CRISPR (crRNA), que permanecieron unidas al complejo proteico. [39] Además, se encontró que Cascade, crRNA y una helicasa/nucleasa ( Cas3 ) eran necesarios para proporcionar a un huésped bacteriano inmunidad contra la infección por un virus de ADN . Al diseñar un CRISPR antivirus, demostraron que dos orientaciones del crRNA (sentido/antisentido) proporcionaban inmunidad, lo que indicaba que las guías de crRNA apuntaban al dsADN . Ese año, Marraffini y Sontheimer confirmaron que una secuencia CRISPR de S. epidermidis apuntaba al ADN y no al ARN para evitar la conjugación . Este hallazgo estaba en desacuerdo con el mecanismo propuesto similar a la interferencia del ARN de la inmunidad CRISPR-Cas, aunque más tarde se encontró un sistema CRISPR-Cas que apunta al ARN extraño en Pyrococcus furiosus . [11] [38] Un estudio de 2010 mostró que CRISPR-Cas corta cadenas de ADN tanto de fagos como de plásmidos en S. thermophilus . [40]

Cas9

Un sistema CRISPR más simple de Streptococcus pyogenes se basa en la proteína Cas9 . La endonucleasa Cas9 es un sistema de cuatro componentes que incluye dos moléculas pequeñas: crRNA y ARN CRISPR transactivador (tracrRNA). [41] [42] En 2012, Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier rediseñaron la endonucleasa Cas9 en un sistema de dos componentes más manejable fusionando las dos moléculas de ARN en un " ARN guía único " que, cuando se combina con Cas9, podría encontrar y cortar el objetivo de ADN especificado por el ARN guía. [43] Esta contribución fue tan significativa que fue reconocida con el Premio Nobel de Química en 2020. Al manipular la secuencia de nucleótidos del ARN guía, el sistema artificial Cas9 podría programarse para apuntar a cualquier secuencia de ADN para su separación. [43] Otra colaboración que comprende a Virginijus Šikšnys , Gasiūnas, Barrangou y Horvath demostró que Cas9 del sistema CRISPR de S. thermophilus también puede reprogramarse para dirigirse a un sitio de su elección modificando la secuencia de su crRNA. Estos avances impulsaron los esfuerzos para editar genomas con el sistema CRISPR-Cas9 modificado. [18]

Los grupos liderados por Feng Zhang y George Church publicaron simultáneamente descripciones de la edición del genoma en cultivos de células humanas utilizando CRISPR-Cas9 por primera vez. [11] [44] [45] Desde entonces se ha utilizado en una amplia gama de organismos, incluyendo la levadura de panadería ( Saccharomyces cerevisiae ), [46] [47] [48] el patógeno oportunista Candida albicans , [49] [50] el pez cebra ( Danio rerio ), [51] las moscas de la fruta ( Drosophila melanogaster ), [52] [53] las hormigas ( Harpegnathos saltator [54] y Ooceraea biroi [55] ), los mosquitos ( Aedes aegypti [56] ), los nematodos ( Caenorhabditis elegans ), [57] las plantas, [58] los ratones ( Mus musculus domesticus ) , [59] [60] los monos [61] y los embriones humanos. [62]

Se ha modificado CRISPR para crear factores de transcripción programables que permiten la activación o el silenciamiento de genes específicos. [63]

Un diagrama de las nucleasas CRISPR Cas12a y Cas9 con la posición de escisión del ADN mostrada en relación con sus secuencias PAM en una ampliación.

Se ha demostrado que el sistema CRISPR-Cas9 realiza ediciones genéticas efectivas en cigotos tripronucleares humanos, como se describió por primera vez en un artículo de 2015 de los científicos chinos P. Liang e Y. Xu. El sistema realizó una escisión exitosa de la beta-hemoglobina mutante ( HBB ) en 28 de 54 embriones. Cuatro de los 28 embriones se recombinaron con éxito utilizando una plantilla donante. Los científicos demostraron que durante la recombinación de ADN de la cadena escindida, la secuencia endógena homóloga HBD compite con la plantilla donante exógena. La reparación del ADN en embriones humanos es mucho más complicada y particular que en células madre derivadas. [64]

Cas12a

En 2015, la nucleasa Cas12a (antes llamadaCpf1 [65] ) se caracterizó en el sistema CRISPR-Cpf1 de la bacteria Francisella novicida . [66] [67] Su nombre original, de una definición de la familia de proteínas TIGRFAMs construida en 2012, refleja la prevalencia de su subtipo CRISPR-Cas en los linajes Prevotella y Francisella . Cas12a mostró varias diferencias clave con Cas9, entre ellas: causar un corte "escalonado" en el ADN bicatenario en oposición al corte "romo" producido por Cas9, depender de un PAM "rico en T" (que proporciona sitios de orientación alternativos a Cas9) y requerir solo un ARN CRISPR (crRNA) para una orientación exitosa. Por el contrario, Cas9 requiere tanto crRNA como un crRNA transactivador (tracrRNA).

Estas diferencias pueden dar a Cas12a algunas ventajas sobre Cas9. Por ejemplo, los pequeños crRNA de Cas12a son ideales para la edición genómica multiplexada, ya que se pueden empaquetar más de ellos en un vector que los sgRNA de Cas9. Los salientes pegajosos 5' que deja Cas12a también se pueden usar para el ensamblaje de ADN que es mucho más específico del objetivo que la clonación con enzimas de restricción tradicional. [68] Finalmente, Cas12a corta el ADN 18-23 pares de bases aguas abajo del sitio PAM. Esto significa que no hay interrupción de la secuencia de reconocimiento después de la reparación, y por lo tanto Cas12a permite múltiples rondas de corte de ADN. Por el contrario, dado que Cas9 corta solo 3 pares de bases aguas arriba del sitio PAM, la vía NHEJ da como resultado mutaciones indel que destruyen la secuencia de reconocimiento, evitando así más rondas de corte. En teoría, las rondas repetidas de corte de ADN deberían causar una mayor oportunidad de que ocurra la edición genómica deseada. [69] Una característica distintiva de Cas12a, en comparación con Cas9, es que después de cortar su objetivo, Cas12a permanece unido al objetivo y luego corta otras moléculas de ssDNA de manera indiscriminada. [70] Esta propiedad se denomina actividad de "corte colateral" o "corte trans" y se ha explotado para el desarrollo de varias tecnologías de diagnóstico. [71] [72]

Cas13

En 2016, la nucleasaCas13a (anteriormente conocida comoSe caracterizó la enzima C2c2 de la bacteria Leptotrichia shahii . Cas13 es una endonucleasa de ARN guiada por ARN, lo que significa que no corta ADN, sino solo ARN monocatenario. Cas13 es guiada por su ARNcr hacia un objetivo de ARN monocatenario y se une y corta el objetivo. De manera similar a Cas12a, Cas13 permanece unida al objetivo y luego corta otras moléculas de ARN monocatenario de manera indiscriminada. [73] Esta propiedad de corte colateral se ha explotado para el desarrollo de varias tecnologías de diagnóstico. [74] [75] [76]

En 2021, el Dr. Hui Yang caracterizó nuevas variantes de la proteína Cas13 en miniatura (mCas13), Cas13X y Cas13Y. El uso de una pequeña porción de la secuencia del gen N del SARS-CoV-2 como objetivo en la caracterización de mCas13 reveló la sensibilidad y especificidad de mCas13 acoplado con RT-LAMP para la detección del SARS-CoV-2 tanto en muestras sintéticas como clínicas en comparación con otras pruebas estándar disponibles como RT-qPCR (1 copia/μL). [77]

Estructura del locus

Repeticiones y espaciadores

La matriz CRISPR está formada por una secuencia líder rica en AT seguida de repeticiones cortas que están separadas por espaciadores únicos. [78] Las repeticiones CRISPR suelen tener un tamaño de entre 28 y 37 pares de bases (pb), aunque puede haber tan solo 23 pb y hasta 55 pb. [79] Algunas muestran simetría diádica , lo que implica la formación de una estructura secundaria como un tallo-bucle ("horquilla") en el ARN, mientras que otras están diseñadas para no estar estructuradas. El tamaño de los espaciadores en diferentes matrices CRISPR es normalmente de 32 a 38 pb (rango de 21 a 72 pb). [79] Pueden aparecer nuevos espaciadores rápidamente como parte de la respuesta inmune a la infección por fagos. [80] Normalmente hay menos de 50 unidades de la secuencia de repetición-espaciador en una matriz CRISPR. [79]

Estructuras de ARN CRISPR

  • CRISPR-DR2: Estructura secundaria extraída de la base de datos Rfam. Familia RF01315.
    CRISPR-DR2: Estructura secundaria extraída de la base de datos Rfam. Familia RF01315.
  • CRISPR-DR5: Estructura secundaria extraída de la base de datos Rfam. Familia RF011318.
    CRISPR-DR5: Estructura secundaria extraída de la base de datos Rfam. Familia RF011318.
  • CRISPR-DR6: Estructura secundaria extraída de la base de datos Rfam. Familia RF01319.
    CRISPR-DR6: Estructura secundaria extraída de la base de datos Rfam. Familia RF01319.
  • CRISPR-DR8: Estructura secundaria extraída de la base de datos Rfam. Familia RF01321.
    CRISPR-DR8: Estructura secundaria extraída de la base de datos Rfam. Familia RF01321.
  • CRISPR-DR9: Estructura secundaria extraída de la base de datos Rfam. Familia RF01322.
    CRISPR-DR9: Estructura secundaria extraída de la base de datos Rfam. Familia RF01322.
  • CRISPR-DR19: Estructura secundaria extraída de la base de datos Rfam. Familia RF01332.
    CRISPR-DR19: Estructura secundaria extraída de la base de datos Rfam. Familia RF01332.
  • CRISPR-DR41: Estructura secundaria extraída de la base de datos Rfam. Familia RF01350.
    CRISPR-DR41: Estructura secundaria extraída de la base de datos Rfam. Familia RF01350.
  • CRISPR-DR52: Estructura secundaria extraída de la base de datos Rfam. Familia RF01365.
    CRISPR-DR52: Estructura secundaria extraída de la base de datos Rfam. Familia RF01365.
  • CRISPR-DR57: Estructura secundaria extraída de la base de datos Rfam. Familia RF01370.
    CRISPR-DR57: Estructura secundaria extraída de la base de datos Rfam. Familia RF01370.
  • CRISPR-DR65: Estructura secundaria extraída de la base de datos Rfam. Familia RF01378.
    CRISPR-DR65: Estructura secundaria extraída de la base de datos Rfam. Familia RF01378.

Genes Cas y subtipos CRISPR

Pequeños grupos de genes cas suelen estar ubicados junto a conjuntos de repeticiones-espaciadores CRISPR. En conjunto, los 93 genes cas se agrupan en 35 familias según la similitud de secuencia de las proteínas codificadas. 11 de las 35 familias forman el núcleo cas , que incluye las familias de proteínas Cas1 a Cas9. Un locus CRISPR-Cas completo tiene al menos un gen que pertenece al núcleo cas . [81]

Los sistemas CRISPR-Cas se dividen en dos clases. Los sistemas de clase 1 utilizan un complejo de múltiples proteínas Cas para degradar ácidos nucleicos extraños. Los sistemas de clase 2 utilizan una única proteína Cas grande para el mismo propósito. La clase 1 se divide en los tipos I, III y IV; la clase 2 se divide en los tipos II, V y VI. [82] Los 6 tipos de sistemas se dividen en 33 subtipos. [83] Cada tipo y la mayoría de los subtipos se caracterizan por un "gen característico" que se encuentra casi exclusivamente en la categoría. La clasificación también se basa en el complemento de genes cas que están presentes. La mayoría de los sistemas CRISPR-Cas tienen una proteína Cas1. La filogenia de las proteínas Cas1 generalmente concuerda con el sistema de clasificación, [84] pero existen excepciones debido a la mezcla de módulos. [81] Muchos organismos contienen múltiples sistemas CRISPR-Cas, lo que sugiere que son compatibles y pueden compartir componentes. [85] [86] La distribución esporádica de los subtipos CRISPR-Cas sugiere que el sistema CRISPR-Cas está sujeto a transferencia horizontal de genes durante la evolución microbiana .

Genes característicos y sus funciones putativas para los tipos CRISPR-cas mayores y menores
ClaseTipo de casSubtipo casProteína de firmaFunciónReferencia
1I—Cas3Nucleasa de ADN monocatenaria (dominio HD) y helicasa dependiente de ATP[87] [88]
IowaCas8a, Cas5Cas8 es una subunidad del módulo de interferencia que es importante para identificar el ADN invasor mediante el reconocimiento de la secuencia PAM . Cas5 es necesaria para el procesamiento y la estabilidad de los ARNcr.[84] [89]
IBCas8b
CIcas8c
IDENTIFICACIÓNCas10dContiene un dominio homólogo al dominio de palma de las polimerasas de ácidos nucleicos y ciclasas de nucleótidos.[90] [91]
ES DECIRCse1, Cse2
SICsy1, Csy2, Csy3El tipo IF-3 se ha implicado en los transposones asociados a CRISPR.[84]
IG [Nota 1]GSU0054[92]
III—Cas10Homólogo de Cas10d y Cse1. Se une al ARN diana de CRISPR y promueve la estabilidad del complejo de interferencia.[91] [93]
III-ACsm2No determinado[84]
III-BCmr5No determinado[84]
III-CCas10 o Csx11[84] [93]
III-DCsx10[84]
III-E[92]
III-F[92]
IV—CSF1[92]
IV-A[92]
IV-B[92]
IV-C[92]
2II—Cas9Las nucleasas RuvC y HNH producen juntas espaciadores de doble cadena y por separado pueden producir roturas de cadena sencilla. Asegura la adquisición de espaciadores funcionales durante la adaptación.[94] [95]
II-ACSN2Proteína de unión al ADN con forma de anillo. Participa en la adaptación en el sistema CRISPR tipo II.[96]
II-BCas4Endonucleasa que trabaja con cas1 y cas2 para generar secuencias espaciadoras[97]
II-CSe caracteriza por la ausencia de Csn2 o Cas4.[98]
V—Cas12Nucleasa RuvC. Carece de HNH.[82] [99]
VirginiaCas12a (Cpf1)Autoprocesamiento de la actividad pre-crRNA para la regulación múltiple de genes[92] [100]
VbCas12b (C2c1)[92]
VCCas12c (C2c3)[92]
enfermedad venéreaCas12d (CasY)[92]
VOYCas12e (CasX)[92]
VFCas12f (Cas14, C2c10)[92]
VGCas12g[92]
VH12 horas en efectivo[92]
VICas12i[92]
VK [Nota 2]Cas12k (C2c5)El tipo VK se ha implicado en los transposones asociados a CRISPR .[92]
VUC2c4, C2c8, C2c9[92]
VI—Cas13ARNasa guiada por ARN[82] [101]
A TRAVÉS DECas13a (C2c2)[92]
VI-BCas13b[92]
VI-CCas13c[92]
VI-DCas13d[92]
VI-XCas13x.1ARN polimerasa dependiente de ARN, inhibición profiláctica del virus ARN[102]
VI-Y[102]

Mecanismo

Las etapas de la inmunidad CRISPR para cada uno de los tres tipos principales de inmunidad adaptativa.
(1) La adquisición comienza con el reconocimiento del ADN invasor por Cas1 y Cas2 y la escisión de un protoespaciador.
(2) El protoespaciador se liga a la repetición directa adyacente a la secuencia líder y
(3) la extensión de cadena simple repara el CRISPR y duplica la repetición directa. Las etapas de procesamiento e interferencia del crRNA ocurren de manera diferente en cada uno de los tres sistemas CRISPR principales.
(4) La transcripción CRISPR primaria es escindida por genes cas para producir crRNA.
(5) En los sistemas de tipo I, Cas6e/Cas6f escinden en la unión del ssRNA y dsRNA formado por bucles de horquilla en la repetición directa. Los sistemas de tipo II utilizan un ARN transactivador (tracr) para formar dsRNA, que es escindido por Cas9 y RNasaIII. Los sistemas de tipo III utilizan un homólogo de Cas6 que no requiere bucles de horquilla en la repetición directa para la escisión.
(6) En los sistemas de tipo II y tipo III, el recorte secundario se realiza en el extremo 5' o 3' para producir crRNA maduros.
(7) Los crRNA maduros se asocian con proteínas Cas para formar complejos de interferencia.
(8) En los sistemas de tipo I y tipo II, se requieren interacciones entre la proteína y la secuencia PAM para la degradación del ADN invasor. Los sistemas de tipo III no requieren un PAM para una degradación exitosa y en los sistemas de tipo III-A el apareamiento de bases ocurre entre el crRNA y el mRNA en lugar del ADN, al que se dirigen los sistemas de tipo III-B.
El locus genético CRISPR proporciona a las bacterias un mecanismo de defensa para protegerlas de infecciones repetidas de fagos.
Transcripciones del locus genético CRISPR y maduración del pre-crRNA
Estructura 3D del complejo de interferencia CRISPR-Cas9
CRISPR-Cas9 como herramienta molecular introduce roturas específicas de ADN de doble cadena.
Las roturas de ADN de doble cadena introducidas por CRISPR-Cas9 permiten una mayor manipulación genética explotando los mecanismos endógenos de reparación del ADN.

La inmunidad CRISPR-Cas es un proceso natural de bacterias y arqueas. [103] CRISPR-Cas previene la infección, la conjugación y la transformación natural de bacteriófagos al degradar los ácidos nucleicos extraños que ingresan a la célula. [38]

Adquisición de espaciadores

Cuando un microbio es invadido por un bacteriófago , la primera etapa de la respuesta inmune es capturar el ADN del fago e insertarlo en un locus CRISPR en forma de espaciador. Cas1 y Cas2 se encuentran en ambos tipos de sistemas inmunes CRISPR-Cas, lo que indica que están involucrados en la adquisición del espaciador. Los estudios de mutación confirmaron esta hipótesis, mostrando que la eliminación de Cas1 o Cas2 detuvo la adquisición del espaciador, sin afectar la respuesta inmune CRISPR. [104] [105] [106] [107] [108]

Se han caracterizado múltiples proteínas Cas1 y se han resuelto sus estructuras. [109] [110] [111] Las proteínas Cas1 tienen secuencias de aminoácidos diversas. Sin embargo, sus estructuras cristalinas son similares y todas las proteínas Cas1 purificadas son nucleasas/ integrasas dependientes de metales que se unen al ADN de una manera independiente de la secuencia. [85] Se han caracterizado proteínas Cas2 representativas y poseen actividad endorribonucleasa específica de ssRNA- [112] (monocatenario) o dsDNA- [113] [114] (bicatenario) .

En el sistema IE de E. coli , Cas1 y Cas2 forman un complejo donde un dímero de Cas2 une dos dímeros de Cas1. [115] En este complejo, Cas2 desempeña una función de andamiaje no enzimático, [115] uniendo fragmentos bicatenarios de ADN invasor, mientras que Cas1 se une a los flancos monocatenarios del ADN y cataliza su integración en matrices CRISPR. [116] [117] [118] Los nuevos espaciadores generalmente se agregan al comienzo del CRISPR junto a la secuencia líder, creando un registro cronológico de infecciones virales. [119] En E. coli, una proteína similar a una histona llamada factor de integración del huésped ( IHF ), que se une a la secuencia líder, es responsable de la precisión de esta integración. [120] El IHF también mejora la eficiencia de la integración en el sistema tipo IF de Pectobacterium atrosepticum . [121] pero en otros sistemas, pueden requerirse diferentes factores del huésped [122]

Motivos adyacentes al protoespaciador (PAM)

El análisis bioinformático de regiones de genomas de fagos que fueron escindidas como espaciadores (denominados protoespaciadores) reveló que no fueron seleccionados al azar sino que se encontraron adyacentes a secuencias de ADN cortas (3-5 pb) denominadas motivos adyacentes a protoespaciadores (PAM). El análisis de sistemas CRISPR-Cas mostró que los PAM son importantes para los sistemas de tipo I y tipo II, pero no para los de tipo III durante la adquisición. [33] [123] [124] [125] [126] [127] En los sistemas de tipo I y tipo II, los protoespaciadores se escinden en posiciones adyacentes a una secuencia PAM, y el otro extremo del espaciador se corta utilizando un mecanismo de regla, manteniendo así la regularidad del tamaño del espaciador en la matriz CRISPR. [128] [129] La conservación de la secuencia PAM difiere entre los sistemas CRISPR-Cas y parece estar vinculada evolutivamente a Cas1 y la secuencia líder . [127] [130]

Los nuevos espaciadores se añaden a una matriz CRISPR de manera direccional, [31] apareciendo preferentemente, [80] [123] [124] [131] [132] pero no exclusivamente, adyacentes [126] [129] a la secuencia líder. El análisis del sistema de tipo IE de E. coli demostró que se copia la primera repetición directa adyacente a la secuencia líder, con el espaciador recién adquirido insertado entre la primera y la segunda repetición directa. [107] [128]

La secuencia PAM parece ser importante durante la inserción del espaciador en sistemas de tipo IE. Esa secuencia contiene un nucleótido final (nt) fuertemente conservado adyacente al primer nt del protoespaciador. Este nt se convierte en la base final en la primera repetición directa. [108] [133] [134] Esto sugiere que la maquinaria de adquisición del espaciador genera salientes monocatenarios en la segunda posición a la última de la repetición directa y en el PAM durante la inserción del espaciador. Sin embargo, no todos los sistemas CRISPR-Cas parecen compartir este mecanismo ya que los PAM en otros organismos no muestran el mismo nivel de conservación en la posición final. [130] Es probable que en esos sistemas, se genere un extremo romo en el extremo mismo de la repetición directa y el protoespaciador durante la adquisición.

Variantes de inserción

El análisis de los CRISPR de Sulfolobus solfataricus reveló complejidades adicionales para el modelo canónico de inserción de espaciadores, ya que uno de sus seis loci CRISPR insertó nuevos espaciadores aleatoriamente a lo largo de su matriz CRISPR, en lugar de insertarlos más cerca de la secuencia líder. [129]

Múltiples CRISPR contienen muchos espaciadores para el mismo fago. El mecanismo que causa este fenómeno fue descubierto en el sistema tipo IE de E. coli . Se detectó una mejora significativa en la adquisición de espaciadores donde los espaciadores ya se dirigen al fago, incluso cuando no coinciden con el protoespaciador. Esta "preparación" requiere que las proteínas Cas involucradas tanto en la adquisición como en la interferencia interactúen entre sí. Los espaciadores recién adquiridos que resultan del mecanismo de preparación siempre se encuentran en la misma cadena que el espaciador de preparación. [108] [133] [134] Esta observación condujo a la hipótesis de que la maquinaria de adquisición se desliza a lo largo del ADN extraño después de la preparación para encontrar un nuevo protoespaciador. [134]

Biogénesis

El ARN-CRISPR (ARNcr), que posteriormente guía a la nucleasa Cas hasta el objetivo durante el paso de interferencia, debe generarse a partir de la secuencia CRISPR. El ARNcr se transcribe inicialmente como parte de una única transcripción larga que abarca gran parte de la matriz CRISPR. [29] Esta transcripción es luego escindida por las proteínas Cas para formar ARNcr. El mecanismo para producir ARNcr difiere entre los sistemas CRISPR-Cas. En los sistemas de tipo IE y tipo IF, las proteínas Cas6e y Cas6f respectivamente, reconocen bucles de tallo [135] [136] [137] creados por el apareamiento de repeticiones idénticas que flanquean el ARNcr. [138] Estas proteínas Cas escinden la transcripción más larga en el borde de la región emparejada, dejando un único ARNcr junto con un pequeño remanente de la región de repetición emparejada.

Los sistemas de tipo III también utilizan Cas6, pero sus repeticiones no producen bucles de tallo. La escisión se produce cuando el transcrito más largo envuelve el Cas6 para permitir la escisión justo antes de la secuencia repetida. [139] [140] [141]

Los sistemas de tipo II carecen del gen Cas6 y, en su lugar, utilizan la ARNasa III para la escisión. Los sistemas de tipo II funcionales codifican un ARN extra pequeño que es complementario a la secuencia repetida, conocido como ARNcr transactivador (ARNtracr). [41] La transcripción del ARNtracr y la transcripción CRISPR primaria da como resultado el apareamiento de bases y la formación de ARNbc en la secuencia repetida, que posteriormente es el objetivo de la ARNasa III para producir ARNcr. A diferencia de los otros dos sistemas, el ARNcr no contiene el espaciador completo, que en su lugar está truncado en un extremo. [94]

Los ARNcr se asocian con proteínas Cas para formar complejos de ribonucleótidos que reconocen ácidos nucleicos extraños. Los ARNcr no muestran preferencia entre las cadenas codificantes y no codificantes, lo que es indicativo de un sistema de orientación al ADN guiado por ARN. [5] [40] [104] [108] [142] [143] [144] El complejo de tipo IE (comúnmente conocido como Cascada) requiere cinco proteínas Cas unidas a un solo ARNcr. [145] [146]

Interferencia

Durante la etapa de interferencia en los sistemas de tipo I, la secuencia PAM se reconoce en la cadena complementaria del ARNcr y es necesaria junto con la hibridación del ARNcr. En los sistemas de tipo I, el apareamiento correcto de bases entre el ARNcr y el protoespaciador indica un cambio conformacional en Cascade que recluta a Cas3 para la degradación del ADN.

Los sistemas de tipo II dependen de una única proteína multifuncional, Cas9 , para el paso de interferencia. [94] Cas9 requiere tanto el crRNA como el tracrRNA para funcionar y escindir el ADN utilizando sus dominios de endonucleasa duales HNH y RuvC/RNaseH. El apareamiento de bases entre el PAM y el genoma del fago es necesario en los sistemas de tipo II. Sin embargo, el PAM se reconoce en la misma cadena que el crRNA (la cadena opuesta a los sistemas de tipo I).

Los sistemas de tipo III, como el tipo I, requieren de seis o siete proteínas Cas que se unan a los crRNA. [147] [148] Los sistemas de tipo III analizados de S. solfataricus y P. furiosus se dirigen al ARNm de los fagos en lugar del genoma de ADN del fago, [86] [148] lo que puede hacer que estos sistemas sean excepcionalmente capaces de dirigirse a los genomas de fagos basados ​​en ARN. [85] También se descubrió que los sistemas de tipo III se dirigen al ADN además del ARN utilizando una proteína Cas diferente en el complejo, Cas10. [149] Se demostró que la escisión del ADN depende de la transcripción. [150]

El mecanismo para distinguir el ADN propio del extraño durante la interferencia está integrado en los crRNA y, por lo tanto, es probable que sea común a los tres sistemas. A lo largo del proceso de maduración distintivo de cada tipo principal, todos los crRNA contienen una secuencia espaciadora y alguna porción de la repetición en uno o ambos extremos. Es la secuencia de repetición parcial la que evita que el sistema CRISPR-Cas se dirija al cromosoma, ya que el apareamiento de bases más allá de la secuencia espaciadora envía señales al propio ADN y evita la escisión del ADN. [ 151] Las enzimas CRISPR guiadas por ARN se clasifican como enzimas de restricción de tipo V.

Evolución

Proteína asociada a CRISPR Cas2 (ARNasa de adaptación)
Estructura cristalina de una proteína hipotética tt1823 de Thermus thermophilus
Identificadores
SímboloCRISPR_Cas2
PfamPF09827
InterprofesionalIPR019199
Diligenciamiento de conflictoscd09638
Estructuras de proteínas disponibles:
Pfam  estructuras / ECOD  
APPDB RCSB; PDBj
PDBsumaResumen de la estructura
Proteína asociada a CRISPR CasA/Cse1 (DNasa efectora tipo I)
Identificadores
SímboloCRISPR_Cse1
PfamPF09481
InterprofesionalIPR013381
Diligenciamiento de conflictoscd09729
Estructuras de proteínas disponibles:
Pfam  estructuras / ECOD  
APPDB RCSB; PDBj
PDBsumaResumen de la estructura
Proteína asociada a CRISPR CasC/Cse3/Cas6 (RNasa efectora tipo I)
Estructura cristalina de una proteína asociada a crispr de Thermus thermophilus
Identificadores
SímboloAsociación CRISPR
PfamPF08798
Clan PfamCL0362
InterprofesionalIPR010179
Diligenciamiento de conflictoscd09727
Estructuras de proteínas disponibles:
Pfam  estructuras / ECOD  
APPDB RCSB; PDBj
PDBsumaResumen de la estructura

Se cree que los genes cas en los módulos adaptador y efector del sistema CRISPR-Cas han evolucionado a partir de dos módulos ancestrales diferentes. Un elemento similar a un transposón llamado casposón que codifica la integrasa similar a Cas1 y potencialmente otros componentes del módulo de adaptación se insertó junto al módulo efector ancestral, que probablemente funcionó como un sistema inmunológico innato independiente. [152] Los genes cas1 y cas2 altamente conservados del módulo adaptador evolucionaron a partir del módulo ancestral, mientras que una variedad de genes cas efectores de clase 1 evolucionaron a partir del módulo efector ancestral. [153] La evolución de estos diversos genes cas del módulo efector de clase 1 fue guiada por varios mecanismos, como eventos de duplicación. [154] Por otro lado, cada tipo de módulo efector de clase 2 surgió de inserciones independientes posteriores de elementos genéticos móviles. [155] Estos elementos genéticos móviles tomaron el lugar de los módulos efectores de múltiples genes para crear módulos efectores de un solo gen que producen proteínas grandes que realizan todas las tareas necesarias del módulo efector. [155] Las regiones espaciadoras de los sistemas CRISPR-Cas se toman directamente de elementos genéticos móviles extraños y, por lo tanto, su evolución a largo plazo es difícil de rastrear. [156] Se ha descubierto que la evolución no aleatoria de estas regiones espaciadoras depende en gran medida del entorno y de los elementos genéticos móviles extraños particulares que contiene. [157]

CRISPR-Cas puede inmunizar a las bacterias contra ciertos fagos y, por lo tanto, detener la transmisión. Por esta razón, Koonin describió a CRISPR-Cas como un mecanismo de herencia lamarckiano . [158] Sin embargo, esto fue cuestionado por un crítico que señaló: "Deberíamos recordar [a Lamarck] por el bien que contribuyó a la ciencia, no por cosas que se parecen a su teoría solo superficialmente. De hecho, pensar en CRISPR y otros fenómenos como lamarckianos solo oscurece la forma simple y elegante en que realmente funciona la evolución". [159] Pero a medida que se han realizado estudios más recientes, se ha vuelto evidente que las regiones espaciadoras adquiridas de los sistemas CRISPR-Cas son de hecho una forma de evolución lamarckiana porque son mutaciones genéticas que se adquieren y luego se transmiten. [160] Por otro lado, la evolución de la maquinaria genética Cas que facilita el sistema evoluciona a través de la evolución darwiniana clásica. [160]

Coevolución

El análisis de las secuencias CRISPR reveló la coevolución de los genomas del huésped y del virus. [161]

El modelo básico de la evolución de CRISPR consiste en la incorporación de nuevos espaciadores que impulsan a los fagos a mutar sus genomas para evitar la respuesta inmunitaria bacteriana, lo que crea diversidad tanto en la población de fagos como en la de huéspedes. Para resistir una infección de fagos, la secuencia del espaciador CRISPR debe corresponder perfectamente a la secuencia del gen del fago diana. Los fagos pueden seguir infectando a sus huéspedes mediante mutaciones puntuales dadas en el espaciador. [151] Se requiere una rigurosidad similar en PAM o la cepa bacteriana sigue siendo sensible a los fagos. [124] [151]

Tarifas

Un estudio de 124 cepas de S. thermophilus mostró que el 26% de todos los espaciadores eran únicos y que los diferentes loci CRISPR mostraron diferentes tasas de adquisición de espaciadores. [123] Algunos loci CRISPR evolucionan más rápidamente que otros, lo que permitió determinar las relaciones filogenéticas de las cepas. Un análisis genómico comparativo mostró que E. coli y S. enterica evolucionan mucho más lentamente que S. thermophilus . Las cepas de esta última que divergieron hace 250.000 años todavía contenían el mismo complemento de espaciadores. [162]

El análisis metagenómico de dos biopelículas de drenaje ácido de minas mostró que una de las CRISPR analizadas contenía eliminaciones extensas y adiciones de espaciadores en comparación con la otra biopelícula, lo que sugiere una mayor actividad/prevalencia de fagos en una comunidad que en la otra. [80] En la cavidad oral, un estudio temporal determinó que entre el 7 y el 22 % de los espaciadores se compartieron durante 17 meses dentro de un individuo, mientras que menos del 2 % se compartieron entre individuos. [132]

A partir del mismo entorno, se realizó un seguimiento de una única cepa utilizando iniciadores de PCR específicos para su sistema CRISPR. Los resultados generales de presencia/ausencia de espaciadores mostraron una diversidad significativa. Sin embargo, este CRISPR agregó tres espaciadores durante 17 meses, [132] lo que sugiere que incluso en un entorno con una diversidad CRISPR significativa algunos loci evolucionan lentamente.

Los CRISPR se analizaron a partir de los metagenomas producidos para el Proyecto del Microbioma Humano . [163] Aunque la mayoría eran específicos de un sitio corporal, algunos dentro de un sitio corporal son ampliamente compartidos entre individuos. Uno de estos loci se originó a partir de especies de estreptococos y contenía aproximadamente 15 000 espaciadores, el 50 % de los cuales eran únicos. De manera similar a los estudios específicos de la cavidad oral, algunos mostraron poca evolución a lo largo del tiempo. [163]

Se estudió la evolución de CRISPR en quimiostatos utilizando S. thermophilus para examinar directamente las tasas de adquisición de espaciadores. En una semana, las cepas de S. thermophilus adquirieron hasta tres espaciadores cuando se las expuso a un solo fago. [164] Durante el mismo intervalo, el fago desarrolló polimorfismos de un solo nucleótido que se fijaron en la población, lo que sugiere que la selección de dianas había impedido la replicación del fago en ausencia de estas mutaciones. [164]

Otro experimento con S. thermophilus demostró que los fagos pueden infectar y replicarse en huéspedes que tienen solo un espaciador de destino. Otro más demostró que los huéspedes sensibles pueden existir en entornos con altos títulos de fagos. [165] Los estudios de observación y con quimiostato sugieren muchos matices en la (co)evolución de fagos y CRISPR.

Identificación

Los CRISPR están ampliamente distribuidos entre bacterias y arqueas [90] y muestran algunas similitudes de secuencia. [138] Su característica más notable es la repetición de espaciadores y repeticiones directas. Esta característica hace que los CRISPR sean fácilmente identificables en secuencias largas de ADN, ya que la cantidad de repeticiones disminuye la probabilidad de una coincidencia con un falso positivo. [166]

El análisis de los CRISPR en datos metagenómicos es más complicado, ya que los loci CRISPR no suelen ensamblarse, debido a su naturaleza repetitiva o a través de la variación de la cepa, lo que confunde los algoritmos de ensamblaje. Cuando hay muchos genomas de referencia disponibles, se puede utilizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar las matrices CRISPR y analizar el contenido de espaciadores. [123] [132] [167] [168] [169] [170] Sin embargo, este enfoque solo proporciona información para CRISPR específicamente dirigidos y para organismos con suficiente representación en bases de datos públicas para diseñar cebadores de PCR de polimerasa fiables. Se pueden utilizar cebadores específicos de repetición degenerados para amplificar espaciadores CRISPR directamente a partir de muestras ambientales; los amplicones que contienen dos o tres espaciadores se pueden ensamblar computacionalmente para reconstruir matrices CRISPR largas. [170]

La alternativa es extraer y reconstruir matrices CRISPR a partir de datos metagenómicos shotgun. Esto es computacionalmente más difícil, particularmente con tecnologías de secuenciación de segunda generación (por ejemplo, 454, Illumina), ya que las longitudes de lectura cortas impiden que aparezcan más de dos o tres unidades repetidas en una sola lectura. La identificación CRISPR en lecturas sin procesar se ha logrado utilizando una identificación puramente de novo [171] o utilizando secuencias de repetición directa en matrices CRISPR parcialmente ensambladas a partir de contigs (segmentos de ADN superpuestos que juntos representan una región de consenso de ADN) [163] y secuencias de repetición directa de genomas publicados [172] como un gancho para identificar repeticiones directas en lecturas individuales.

Uso por fagos

Otra forma en que las bacterias se defienden contra la infección por fagos es mediante islas cromosómicas . Un subtipo de islas cromosómicas llamadas islas cromosómicas inducibles por fagos (PICI) se escinden de un cromosoma bacteriano tras la infección por fagos y pueden inhibir la replicación del fago. [173] Las PICI son inducidas, escindidas, replicadas y finalmente empaquetadas en pequeñas cápsides por ciertos fagos templados estafilocócicos. Las PICI utilizan varios mecanismos para bloquear la reproducción de los fagos. En el primer mecanismo, la Ppi codificada por PICI bloquea diferencialmente la maduración del fago uniéndose o interactuando específicamente con el fago TerS, bloqueando así la formación del complejo TerS/TerL del fago responsable del empaquetamiento del ADN del fago. En el segundo mecanismo, PICI CpmAB redirige la proteína morfogenética de la cápside del fago para que el 95 % de la cápside sea del tamaño de SaPI y el ADN del fago puede empaquetar solo 1/3 de su genoma en estas pequeñas cápsides y, por lo tanto, se convierte en un fago no viable. [174] El tercer mecanismo involucra dos proteínas, PtiA y PtiB, que se dirigen a LtrC, que es responsable de la producción de virión y proteínas de lisis. Este mecanismo de interferencia está modulado por una proteína moduladora, PtiM, que se une a una de las proteínas mediadoras de interferencia, PtiA, y, por lo tanto, logra el nivel requerido de interferencia. [175]

Un estudio mostró que el fago lítico ICP1, que se dirige específicamente al serogrupo O1 de Vibrio cholerae , ha adquirido un sistema CRISPR-Cas que se dirige a un elemento similar a PICI de V. cholera . El sistema tiene 2 loci CRISPR y 9 genes Cas. Parece ser homólogo al sistema IF encontrado en Yersinia pestis . Además, al igual que el sistema CRISPR-Cas bacteriano, el sistema CRISPR-Cas ICP1 puede adquirir nuevas secuencias, lo que permite que el fago y el huésped coevolucionen. [176] [177]

Se ha demostrado que ciertos virus arqueales portan mini matrices CRISPR que contienen uno o dos espaciadores. Se ha demostrado que los espaciadores dentro de las matrices CRISPR transmitidas por virus se dirigen a otros virus y plásmidos, lo que sugiere que las mini matrices CRISPR representan un mecanismo de exclusión de superinfección heterotípica y participan en conflictos intervirales. [170]

Aplicaciones

La edición genética mediante CRISPR es una tecnología revolucionaria que permite realizar modificaciones precisas y específicas del ADN de los organismos vivos. Desarrollado a partir de un mecanismo de defensa natural presente en las bacterias, CRISPR-Cas9 es el sistema más utilizado, que permite "cortar" el ADN en lugares específicos y eliminar, modificar o insertar material genético. Esta tecnología ha transformado campos como la genética, la medicina [178] [179] y la agricultura [180] [181], ofreciendo posibles tratamientos para trastornos genéticos, avances en la ingeniería de cultivos e investigación sobre el funcionamiento fundamental de la vida. Sin embargo, sus implicaciones éticas y sus posibles consecuencias no deseadas han suscitado un importante debate [182] [183] .

Véase también

Notas

  1. ^ El subtipo IG se conocía anteriormente como subtipo IU . [84]
  2. ^ El subtipo VK se conocía anteriormente como subtipo VU 5. [92]

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Wikimedia Commons tiene medios relacionados con CRISPR .
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  • "Edición avanzada de genes: CRISPR-Cas9" (PDF) . Servicio de Investigación del Congreso .
  • "Charla de Jennifer Doudna: Ingeniería genómica con CRISPR-Cas9: nacimiento de una tecnología revolucionaria". 10 de septiembre de 2022.
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  • Resumen de toda la información estructural disponible en el PDB para UniProt : P76632 (subunidad CasB en cascada del sistema CRISPR) en PDBe-KB .
  • Resumen de toda la información estructural disponible en el PDB para UniProt : Q46899 (subunidad CasC en cascada del sistema CRISPR) en PDBe-KB .
  • Resumen de toda la información estructural disponible en el PDB para UniProt : Q46898 (subunidad CasD de la cascada del sistema CRISPR) en el PDBe-KB .
  • Resumen de toda la información estructural disponible en el PDB para UniProt : Q46897 (CRISPR system Cascade subunit CasE) en PDBe-KB .
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