Cascada bioquímica

Una cascada bioquímica , también conocida como cascada de señalización o vía de señalización , es una serie de reacciones químicas que ocurren dentro de una célula biológica cuando son iniciadas por un estímulo. Este estímulo, conocido como primer mensajero, actúa sobre un receptor que se transduce al interior de la célula a través de segundos mensajeros que amplifican la señal y la transfieren a moléculas efectoras, haciendo que la célula responda al estímulo inicial. ^[1] La mayoría de las cascadas bioquímicas son series de eventos, en los que un evento desencadena el siguiente, de manera lineal. En cada paso de la cascada de señalización, intervienen varios factores de control para regular las acciones celulares, con el fin de responder de manera efectiva a las señales sobre sus cambiantes entornos internos y externos. ^[1]

Un ejemplo sería la cascada de coagulación de la hemostasia secundaria que conduce a la formación de fibrina y, por lo tanto, al inicio de la coagulación sanguínea. Otro ejemplo, la vía de señalización de hedgehog sónico , es uno de los reguladores clave del desarrollo embrionario y está presente en todos los bilaterales . ^[2] Las proteínas de señalización proporcionan a las células información para que el embrión se desarrolle correctamente. Cuando la vía funciona mal, puede provocar enfermedades como el carcinoma basocelular . ^[3] Estudios recientes apuntan al papel de la señalización de hedgehog en la regulación de las células madre adultas implicadas en el mantenimiento y la regeneración de los tejidos adultos. La vía también se ha implicado en el desarrollo de algunos cánceres. Varias empresas farmacéuticas están desarrollando activamente medicamentos que se dirigen específicamente a la señalización de hedgehog para combatir enfermedades.

Las células requieren de una maquinaria celular completa y funcional para vivir. Cuando pertenecen a organismos multicelulares complejos, necesitan comunicarse entre sí y trabajar en simbiosis para dar vida al organismo. Estas comunicaciones entre células desencadenan cascadas de señalización intracelular, denominadas vías de transducción de señales , que regulan funciones celulares específicas. Cada transducción de señales se produce con un mensajero extracelular primario que se une a un receptor transmembrana o nuclear, iniciando señales intracelulares. El complejo formado produce o libera segundos mensajeros que integran y adaptan la señal, amplificándola, activando dianas moleculares, que a su vez desencadenan efectores que conducirán a la respuesta celular deseada. ^[4]

La transducción de señales se realiza mediante la activación de receptores específicos y la consiguiente producción/entrega de segundos mensajeros, como Ca ²⁺ o cAMP . Estas moléculas funcionan como transductores de señales, desencadenando cascadas intracelulares y a su vez amplificando la señal inicial. ^[4] Se han identificado dos mecanismos principales de transducción de señales, a través de receptores nucleares o a través de receptores transmembrana. En el primero, el primer mensajero atraviesa la membrana celular, uniéndose y activando receptores intracelulares localizados en el núcleo o citosol , que luego actúan como factores de transcripción que regulan directamente la expresión génica. Esto es posible debido a la naturaleza lipofílica de esos ligandos, principalmente hormonas. En la transducción de señales a través de receptores transmembrana, el primer mensajero se une al dominio extracelular del receptor transmembrana, activándolo. Estos receptores pueden tener actividad catalítica intrínseca o pueden estar acoplados a enzimas efectoras, o también pueden estar asociados a canales iónicos. Por lo tanto, existen cuatro tipos principales de receptores transmembrana: receptores acoplados a proteína G (GPCR), receptores de tirosina quinasa (RTK), receptores de serina/treonina quinasa (RSTK) y canales iónicos regulados por ligando (LGIC). ^{[1] [4]} Los segundos mensajeros se pueden clasificar en tres clases:

1. Hidrofílicas/citosólicas: son solubles en agua y se localizan en el citosol, incluyendo cAMP, cGMP , IP3 , Ca ²⁺ , cADPR y S1P . Sus principales objetivos son las proteínas quinasas como PKA y PKG , por lo que participan en respuestas mediadas por fosforilación. ^[4]
2. Hidrofóbicas/asociadas a la membrana: son insolubles en agua y están asociadas a la membrana, y se localizan en espacios intermembrana, donde pueden unirse a proteínas efectoras asociadas a la membrana. Ejemplos: PIP3 , DAG , ácido fosfatídico , ácido araquidónico y ceramida . Están involucradas en la regulación de quinasas y fosfatasas, factores asociados a la proteína G y factores transcripcionales. ^[4]
3. Gaseoso: puede propagarse por la membrana celular y el citosol, incluyendo el óxido nítrico y el monóxido de carbono . Ambos pueden activar el GMPc y, además de ser capaces de mediar actividades independientes, también pueden operar de modo coordinado. ^[4]

La respuesta celular en las cascadas de transducción de señales implica la alteración de la expresión de genes efectores o la activación/inhibición de proteínas diana. La regulación de la actividad de las proteínas implica principalmente eventos de fosforilación/desfosforilación, que conducen a su activación o inhibición. Esto es así en la gran mayoría de las respuestas como consecuencia de la unión de los mensajeros primarios a los receptores de membrana. Esta respuesta es rápida, ya que implica la regulación de moléculas que ya están presentes en la célula. Por otro lado, la inducción o represión de la expresión de genes requiere la unión de factores transcripcionales a las secuencias reguladoras de estos genes. Los factores transcripcionales son activados por los mensajeros primarios, en la mayoría de los casos, debido a su función como receptores nucleares para estos mensajeros. Los mensajeros secundarios como DAG o Ca ²⁺ también podrían inducir o reprimir la expresión génica, a través de factores transcripcionales. Esta respuesta es más lenta que la primera porque implica más pasos, como la transcripción de genes y luego el efecto de las proteínas recién formadas en un objetivo específico. El objetivo podría ser una proteína u otro gen. ^{[1] [4] [5]}

En bioquímica , varias cascadas enzimáticas importantes y cascadas de transducción de señales participan en vías metabólicas o redes de señalización, en las que las enzimas suelen estar implicadas para catalizar las reacciones. Por ejemplo, la vía del factor tisular en la cascada de coagulación de la hemostasia secundaria es la vía principal que conduce a la formación de fibrina y, por tanto, al inicio de la coagulación sanguínea. Las vías son una serie de reacciones, en las que un zimógeno (precursor enzimático inactivo) de una serina proteasa y sus cofactores de glucoproteína se activan para convertirse en componentes activos que luego catalizan la siguiente reacción en la cascada, lo que finalmente da como resultado fibrina reticulada . ^[6]

Otro ejemplo, la vía de señalización de Sonic Hedgehog , es uno de los reguladores clave del desarrollo embrionario y está presente en todos los bilaterales . ^[2] Diferentes partes del embrión tienen diferentes concentraciones de proteínas de señalización de Hedgehog, que dan a las células información para hacer que el embrión se desarrolle de manera adecuada y correcta en una cabeza o una cola. Cuando la vía funciona mal, puede provocar enfermedades como el carcinoma de células basales . ^[3] Estudios recientes apuntan al papel de la señalización de Hedgehog en la regulación de las células madre adultas involucradas en el mantenimiento y la regeneración de los tejidos adultos. La vía también se ha implicado en el desarrollo de algunos cánceres. Varias compañías farmacéuticas están desarrollando activamente medicamentos que se dirigen específicamente a la señalización de Hedgehog para combatir enfermedades. ^[7] La ​​mayoría de las cascadas bioquímicas son series de eventos, en los que un evento desencadena el siguiente, de forma lineal.

Las cascadas bioquímicas incluyen:

• El sistema del complemento
• La vía de señalización de la insulina
• La vía de señalización del erizo sónico
• La vía de señalización Wnt
• La vía de señalización JAK-STAT
• Las vías de los receptores adrenérgicos
• Las vías del receptor de acetilcolina
• La cascada de la proteína quinasa activada por mitógenos

Por el contrario, las cascadas negativas incluyen eventos que son de forma circular o que pueden causar o ser causados ​​por múltiples eventos. ^[8] Las cascadas negativas incluyen:

• Cascada isquémica

La adhesión es un proceso esencial para las células epiteliales para que se pueda formar el epitelio y las células puedan estar en contacto permanente con la matriz extracelular y otras células. Existen varias vías para lograr esta comunicación y adhesión con el medio ambiente. Pero las principales vías de señalización son las vías de la cadherina y la integrina. ^[9] La vía de la cadherina está presente en las uniones de adhesión o en los desmosomas y es responsable de la adhesión epitelial y la comunicación con las células adyacentes. La cadherina es un receptor de glucoproteína transmembrana que establece contacto con otra cadherina presente en la superficie de una célula vecina formando un complejo de adhesión. ^[10] Este complejo de adhesión está formado por β-catenina y α-catenina , y p120 ^CAS es esencial para su estabilización y regulación. Este complejo luego se une a la actina , lo que lleva a la polimerización. Para la polimerización de la actina a través de la vía de la cadherina, también participan proteínas de la familia Rho GTPasas . Este complejo está regulado por fosforilación, lo que conduce a la regulación negativa de la adhesión. Varios factores pueden inducir la fosforilación, como EGF , HGF o v-Src . La vía de la cadherina también tiene una función importante en la supervivencia y la proliferación porque regula la concentración de β-catenina citoplasmática. Cuando la β-catenina está libre en el citoplasma, normalmente se degrada, sin embargo, si se activa la señalización de Wnt , se inhibe la degradación de la β-catenina y se transloca al núcleo donde forma un complejo con factores de transcripción. Esto conduce a la activación de genes responsables de la proliferación y supervivencia celular. Por lo tanto, el complejo cadherina-catenina es esencial para la regulación del destino celular. ^{[11] [12]} Las integrinas son receptores de glucoproteínas heterodímeros que reconocen proteínas presentes en la matriz extracelular, como la fibronectina y la laminina. Para funcionar, las integrinas tienen que formar complejos con las proteínas ILK y Fak . Para la adhesión a la matriz extracelular, la ILK activa las proteínas Rac y Cdc42 y conduce a la polimerización de actina. La ERK también conduce a la polimerización de actina a través de la activación de cPLA2 . El reclutamiento de FAK por la integrina conduce a la activación de Akt y esto inhibe los factores proapoptóticos como BAD y Bax. Cuando la adhesión a través de las integrinas no ocurre, los factores proapoptóticos no se inhiben y resultan en apoptosis . ^{[13] [14]}

El hepatocito es una célula diferenciada compleja y multifuncional cuya respuesta celular estará influenciada por la zona en el lobulillo hepático , debido a que las concentraciones de oxígeno y sustancias tóxicas presentes en los sinusoides hepáticos cambian de la zona periportal a la zona centrolobulillar10. Los hepatocitos de la zona intermedia tienen las características morfológicas y funcionales adecuadas ya que tienen un ambiente con concentraciones promedio de oxígeno y otras sustancias. ^[15] Esta célula especializada es capaz de: ^[16]

• Regular el metabolismo de la glucosa ^{[4] [5] [17]}

1. A través de cAMP / PKA /TORC (transductores de CREB regulado) / CRE , PIP3 / PKB y PLC / IP3
2. Expresión de enzimas para la síntesis, almacenamiento y distribución de glucosa.

• Síntesis de proteínas de fase aguda ^{[18] [19] [20]}

1. A través de JAK / STAT /APRE (elemento de respuesta de fase aguda)
2. Expresión de la proteína C reactiva, inhibidores de la proteasa globulina, complemento, sistemas de coagulación y fibrinolíticos y homeostasis del hierro

• Regula la homeostasis del hierro (independiente de la fase aguda) ^{[4] [20] [21]}

1. Vía Smads / HAMP
2. Expresión de hepcidina

• Regular el metabolismo lipídico ^{[4] [20] [22] [23]}

1. A través de LXR /LXRE (elemento de respuesta LXR)
2. Expresión de ApoE CETP , FAS y LPL

• Producción exocrina de sales biliares y otros compuestos ^{[4] [20] [22] [23]}

1. A través de LXR /LXRE
2. Expresión de los transportadores CYP7A1 y ABC

• Degradación de sustancias tóxicas ^{[4] [20] [22] [23]}

1. A través de LXR /LXRE
2. Expresión de transportadores ABC

• Producción endocrina

1. A través de JAK / STAT /GHRE (elemento de respuesta de la hormona del crecimiento)

Expresión de IGF-1 e IGFBP-3

1. Vía THR /THRE (elemento de respuesta de la hormona tiroidea) ^{[4] [24] [25] [26]}

Expresión de angiotensinógeno

• Se regeneran por mitosis de los hepatocitos ^{[20] [27] [28] [29]}

1. A través de STAT y Gab1: RAS / MAPK , PLC / IP3 y PI3K / FAK
2. Crecimiento, proliferación, supervivencia, invasión y motilidad celular.

El hepatocito también regula otras funciones como la síntesis constitutiva de proteínas ( albúmina , ALT y AST ) que influyen en la síntesis o activación de otras moléculas (síntesis de urea y aminoácidos esenciales), activación de la vitamina D , utilización de la vitamina K , expresión del transportador de vitamina A y conversión de tiroxina . ^{[15] [30]}

La señalización purinérgica tiene un papel esencial en las interacciones entre neuronas y células gliales , permitiendo que estas detecten potenciales de acción y modulen la actividad neuronal, contribuyendo a la regulación de la homeostasis intra y extracelular. Además de neurotransmisor purinérgico, el ATP actúa como un factor trófico en el desarrollo y crecimiento celular, estando involucrado en la activación y migración de la microglía, y también en la mielinización axonal por oligodendrocitos. Existen dos tipos principales de receptores purinérgicos , P1 de unión a adenosina , y P2 de unión a ATP o ADP, presentando diferentes cascadas de señalización. ^{[31] [32]} La vía de señalización Nrf2 /ARE tiene un papel fundamental en la lucha contra el estrés oxidativo, al que las neuronas son especialmente vulnerables debido a su alto consumo de oxígeno y alto contenido lipídico. Esta vía neuroprotectora implica el control de la actividad neuronal por astrocitos perisinápticos y la liberación neuronal de glutamato, con el establecimiento de sinapsis tripartitas. La activación de Nrf2/ARE conduce a una mayor expresión de enzimas involucradas en la síntesis y metabolismo del glutatión, que tienen un papel clave en la respuesta antioxidante. ^{[33] [34] [35] [36]} La vía de señalización LKB1/NUAK1 regula la ramificación terminal del axón en las neuronas corticales, a través de la captura local de mitocondrias inmovilizadas. Además de NUAK1 , la quinasa LKB1 actúa bajo otras enzimas efectoras como SAD-A/B y MARK, regulando así la polarización neuronal y el crecimiento axonal, respectivamente. Estas cascadas de quinasas implican también a Tau y otras MAP . ^{[37] [38] [39]} Un conocimiento ampliado de estas y otras vías neuronales podría proporcionar nuevos objetivos terapéuticos potenciales para varias enfermedades crónicas neurodegenerativas como el Alzheimer , el Parkinson y la enfermedad de Huntington , y también la esclerosis lateral amiotrófica . ^{[31] [32] [33]}

Las células sanguíneas ( eritrocitos , leucocitos y plaquetas ) se producen por hematopoyesis . Los eritrocitos tienen como función principal el aporte de O2 a los tejidos, y esta transferencia se produce por difusión y está determinada por la tensión de O2 _{( PO2} ) _. El eritrocito es capaz de sentir la necesidad tisular de O2 _y provocar un cambio en el calibre vascular, a través de la vía de liberación de ATP , que requiere un aumento de AMPc , y están reguladas por la fosfodiesterasa (PDE). Esta vía puede desencadenarse mediante dos mecanismos: estímulo fisiológico (como la reducción de la tensión de O2) y activación del receptor de prostaciclina (IPR). Esta vía incluye proteínas G heterotriméricas , adenilil ciclasa (AC), proteína quinasa A (PKA), regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) y un conducto final que transporta ATP al lumen vascular ( pannexina 1 o canal aniónico dependiente de voltaje (VDAC)). El ATP liberado actúa sobre los receptores purinérgicos de las células endoteliales, desencadenando la síntesis y liberación de varios vasodilatadores , como el óxido nítrico (NO) y la prostaciclina (PGI ₂ ). ^{[40] [41]} El modelo actual de la cascada de adhesión leucocitaria incluye muchos pasos mencionados en la Tabla 1. ^[42] La adhesión mediada por integrinas de los leucocitos a las células endoteliales está relacionada con cambios morfológicos tanto en los leucocitos como en las células endoteliales, que juntos apoyan la migración leucocitaria a través de las paredes venulares. Las GTPasas pequeñas Rho y Ras están involucradas en las principales vías de señalización leucocitaria subyacentes a la adhesión dependiente de integrinas estimulada por quimiocinas , y tienen funciones importantes en la regulación de la forma, la adhesión y la motilidad celular. ^[43]

Después de que se produce una lesión vascular, las plaquetas son activadas por el colágeno expuesto localmente (receptor de glucoproteína (GP) VI), la trombina generada localmente (receptores PAR1 y PAR4), el tromboxano A2 derivado de plaquetas (TxA2) (receptor TP) y el ADP (receptores P2Y1 y P2Y12) que se libera de las células dañadas o se secreta de los gránulos densos de plaquetas . El factor de von Willebrand (VWF) sirve como una molécula accesoria esencial. En términos generales, la activación plaquetaria iniciada por el agonista da lugar a una cascada de señalización que conduce a un aumento de la concentración de calcio citosólico. En consecuencia, se activa la integrina α _IIb β _{3 y la unión al} fibrinógeno permite la agregación de plaquetas entre sí. El aumento del calcio citosólico también conduce al cambio de forma y a la síntesis de TxA2, lo que conduce a la amplificación de la señal.

El objetivo principal de las cascadas bioquímicas en los linfocitos es la secreción de moléculas que puedan suprimir células alteradas o eliminar agentes patógenos, a través de la proliferación, diferenciación y activación de estas células. Por lo tanto, los receptores antigénicos juegan un papel central en la transducción de señales en los linfocitos, ya que cuando los antígenos interactúan con ellos dan lugar a una cascada de eventos de señal. Estos receptores, que reconocen el antígeno soluble (células B) o unido a una molécula en las células presentadoras de antígeno (células T), no tienen colas largas en el citoplasma, por lo que están anclados a proteínas señal, que contienen una larga cola citoplasmática con un motivo que puede ser fosforilado ( ITAM – immunoreceptor tyrosine-based activation reason) y dar lugar a diferentes vías de señal. El receptor de antígeno y la proteína señal forman un complejo estable, denominado BCR o TCR , en las células B o T, respectivamente. La familia Src es esencial para la transducción de señales en estas células, porque es responsable de la fosforilación de los ITAM. Por lo tanto, Lyn y Lck , en los linfocitos B y T, respectivamente, fosforilan motivos de activación basados ​​en tirosina del inmunorreceptor después del reconocimiento del antígeno y el cambio conformacional del receptor, lo que conduce a la unión de las quinasas Syk / Zap-70 a ITAM y su activación. La quinasa Syk es específica de los linfocitos B y Zap-70 está presente en las células T. Después de la activación de estas enzimas, algunas proteínas adaptadoras se fosforilan, como BLNK (células B) y LAT (células T). Estas proteínas después de la fosforilación se activan y permiten la unión de otras enzimas que continúan la cascada bioquímica. ^{[4] [44] [45] [46]} Un ejemplo de una proteína que se une a las proteínas adaptadoras y se activa es la PLC que es muy importante en las vías de señalización de los linfocitos. La PLC es responsable de la activación de PKC , a través de DAG y Ca ²⁺ , lo que conduce a la fosforilación de la molécula CARMA1 y la formación del complejo CBM. Este complejo activa la quinasa Iκκ, que fosforila I-κB y luego permite la translocación de NF-κB al núcleo y la transcripción de genes que codifican citocinas , por ejemplo. Otros factores de transcripción como NFAT y el complejo AP1 también son importantes para la transcripción de citocinas . ^{[45] [47] [48][49]} La diferenciación de células B a células plasmáticas también es un ejemplo de un mecanismo de señalización en linfocitos, inducido por un receptor de citocinas . En este caso, algunas interleucinas se unen a un receptor específico, lo que conduce a la activación de la vía MAPK/ERK . En consecuencia, la proteína BLIMP1 se traduce e inhibe PAX5 , lo que permite la transcripción de genes de inmunoglobulina y la activación de XBP1 (importante para la formación del aparato secretor y la mejora de la síntesis de proteínas). ^{[50] [51] [52]} Además, los correceptores ( CD28 / CD19 ) juegan un papel importante porque pueden mejorar la unión antígeno/receptor e iniciar eventos en cascada paralelos, como la activación de PI3 Kinase. PIP3 es entonces responsable de la activación de varias proteínas, como vav (conduce a la activación de la vía JNK , que en consecuencia conduce a la activación de c-Jun ) y btk (también puede activar PLC). ^{[45] [53]}

La vía de señalización de Wnt se puede dividir en canónica y no canónica. La señalización canónica implica la unión de Wnt a Frizzled y al correceptor LRP5, lo que lleva a la fosforilación de GSK3 y la inhibición de la degradación de β-catenina, lo que resulta en su acumulación y translocación al núcleo, donde actúa como un factor de transcripción. La señalización de Wnt no canónica se puede dividir en la vía de polaridad celular plana (PCP) y la vía Wnt/calcio. Se caracteriza por la unión de Wnt a Frizzled y la activación de proteínas G y por un aumento de los niveles intracelulares de calcio a través de mecanismos que involucran a PKC 50. ^[54] La vía de señalización de Wnt juega un papel significativo en la osteoblastogénesis y la formación ósea, induciendo la diferenciación de células pluripotentes mesenquimales en osteoblastos e inhibiendo la vía RANKL/RANK y la osteoclastogénesis. ^[55]

RANKL es un miembro de la superfamilia de ligandos TNF. A través de su unión al receptor RANK, activa varias moléculas, como NF-kappa B, MAPK, NFAT y PI3K52. La vía de señalización RANKL/RANK regula la osteoclastogénesis, así como la supervivencia y activación de los osteoclastos. ^{[56] [57]}

La adenosina es muy relevante en el metabolismo óseo, ya que desempeña un papel en la formación y activación tanto de osteoclastos como de osteoblastos. La adenosina actúa uniéndose a los receptores purinérgicos e influyendo en la actividad de la adenilil ciclasa y en la formación de AMPc y PKA 54. ^[58] La adenosina puede tener efectos opuestos en el metabolismo óseo, porque mientras ciertos receptores purinérgicos estimulan la actividad de la adenilil ciclasa, otros tienen el efecto opuesto. ^{[58] [59]} En determinadas circunstancias, la adenosina estimula la destrucción ósea y en otras situaciones promueve la formación ósea, dependiendo del receptor purinérgico que se esté activando.

La capacidad de autorrenovación y diferenciación son propiedades excepcionales de las células madre. Estas células pueden clasificarse según su capacidad de diferenciación, que disminuye progresivamente con el desarrollo, en totipotentes, pluripotentes, multipotentes y unipotentes. ^[60]

El proceso de autorrenovación está altamente regulado por el ciclo celular y el control de la transcripción genética. Existen algunas vías de señalización, como LIF / JAK / STAT3 (factor inhibidor de la leucemia/Janus kinase/Transductor de señales y activador de la transcripción 3) y BMP / SMADs /Id (proteínas morfogenéticas óseas/Mothers against decapentaplegic/Inhibitor of differentiation), mediadas por factores de transcripción, reguladores epigenéticos y otros componentes, y son responsables de la expresión de genes de autorrenovación e inhibición de la expresión de genes de diferenciación, respectivamente. ^[61]

A nivel del ciclo celular, en las células madre somáticas se observa un aumento de la complejidad de los mecanismos, pero con la edad se observa una disminución del potencial de autorrenovación. Estos mecanismos están regulados por las vías de señalización p16 ^Ink4a -CDK4/6- Rb y p19 ^Arf - p53 - P21 ^Cip1 . Las células madre embrionarias tienen actividad constitutiva de ciclina E-CDK2, que hiperfosforila e inactiva a Rb, lo que conduce a una fase G1 corta del ciclo celular con una transición G1-S rápida y poca dependencia de señales mitogénicas o ciclinas D para la entrada en la fase S. En las células madre fetales, los mitógenos promueven una transición G1-S relativamente rápida a través de la acción cooperativa de ciclina D-CDK4/6 y ciclina E-CDK2 para inactivar las proteínas de la familia Rb. La expresión de p16 ^Ink4a y p19 ^Arf se inhibe mediante la regulación de la cromatina dependiente de Hmga2. Muchas células madre adultas jóvenes están inactivas la mayor parte del tiempo. En ausencia de señales mitogénicas, los inhibidores del ciclo celular, entre ellos las proteínas de la familia Ink4 y Cip/Kip, suprimen la ciclina-CDK y la transición G1-S. Como resultado, Rb se hipofosforila e inhibe E2F, lo que promueve la quiescencia en la fase G0 del ciclo celular. La estimulación mitogénica moviliza a estas células para que entren en el ciclo activando la expresión de ciclina D. En las células madre adultas viejas, aumenta la expresión del microARN let-7 , lo que reduce los niveles de Hmga2 y aumenta los niveles de p16 ^Ink4a y p19 ^Arf . Esto reduce la sensibilidad de las células madre a las señales mitogénicas al inhibir los complejos ciclina-CDK. Como resultado, las células madre no pueden entrar en el ciclo celular o la división celular se ralentiza en muchos tejidos. ^[62]

La regulación extrínseca se realiza por señales provenientes del nicho donde se encuentran las células madre, las cuales son capaces de promover el estado de reposo y la activación del ciclo celular en las células madre somáticas. ^[63] La división asimétrica es característica de las células madre somáticas, manteniendo el reservorio de células madre en el tejido y la producción de células especializadas de las mismas. ^[64]

Las células madre presentan un elevado potencial terapéutico, sobre todo en patologías hemato-oncológicas, como leucemias y linfomas. Se han encontrado pequeños grupos de células madre en tumores, denominadas células madre cancerosas. Existen evidencias de que estas células promueven el crecimiento tumoral y la metástasis. ^[65]

El ovocito es la célula femenina involucrada en la reproducción. ^[66] Existe una estrecha relación entre el ovocito y las células foliculares circundantes que es crucial para el desarrollo de ambos. ^[67] GDF9 y BMP15 producidos por el ovocito se unen a los receptores BMPR2 en las células foliculares activando SMADs 2/3 , asegurando el desarrollo folicular. ^[68] Concomitantemente, el crecimiento del ovocito se inicia por la unión de KITL a su receptor KIT en el ovocito, lo que lleva a la activación de la vía PI3K/Akt , permitiendo la supervivencia y el desarrollo del ovocito. ^[69] Durante la embriogénesis , los ovocitos inician la meiosis y se detienen en la profase I. Este arresto se mantiene por niveles elevados de AMPc dentro del ovocito. ^[70] Recientemente se sugirió que cGMP coopera con el AMPc para mantener el arresto del ciclo celular . ^{[70] [71]} Durante la maduración meiótica, el pico de LH que precede a la ovulación activa la vía MAPK que conduce a la interrupción de la unión gap y la ruptura de la comunicación entre el ovocito y las células foliculares. La PDE3A se activa y degrada el AMPc, lo que conduce a la progresión del ciclo celular y la maduración del ovocito. ^{[72] [73]} El pico de LH también conduce a la producción de progesterona y prostaglandinas que inducen la expresión de ADAMTS1 y otras proteasas, así como sus inhibidores. Esto conducirá a la degradación de la pared folicular, pero limitando el daño y asegurando que la ruptura ocurra en el lugar apropiado, liberando el ovocito en las trompas de Falopio . ^{[74] [75]} La activación del ovocito depende de la fertilización por el espermatozoide. ^[76] Se inicia con la atracción del espermatozoide inducida por las prostaglandinas producidas por el ovocito, que crearán un gradiente que influirá en la dirección y velocidad del espermatozoide. ^[77] Después de la fusión con el ovocito, la PLC ζ del espermatozoide se libera en el ovocito, lo que conduce a un aumento de los niveles de Ca2+ que activarán CaMKII , que degradará MPF , lo que conducirá a la reanudación de la meiosis. ^{[78] [79]} Los niveles aumentados de Ca ²⁺ inducirán la exocitosis degránulos corticales que degradan los receptores ZP , utilizados por los espermatozoides para penetrar en el ovocito, bloqueando la poliespermia . ^[80] La desregulación de estas vías conducirá a varias enfermedades como el síndrome de falla de la maduración de los ovocitos que resulta en infertilidad . ^[81] Aumentar nuestro conocimiento molecular de los mecanismos de desarrollo de los ovocitos podría mejorar el resultado de los procedimientos de reproducción asistida , facilitando la concepción.

El espermatozoide es el gameto masculino. Después de la eyaculación, esta célula no está madura, por lo que no puede fecundar el ovocito. Para tener la capacidad de fecundar el gameto femenino, esta célula sufre capacitación y reacción acrosómica en el tracto reproductivo femenino. Las vías de señalización mejor descritas para el espermatozoide involucran estos procesos. La vía de señalización cAMP/PKA conduce a la capacitación de las células espermáticas; sin embargo, la adenilil ciclasa en las células espermáticas es diferente de las células somáticas. La adenilil ciclasa en el espermatozoide no reconoce las proteínas G , por lo que es estimulada por los iones de bicarbonato y Ca ²⁺ . Luego, convierte el trifosfato de adenosina en AMP cíclico, que activa la proteína quinasa A. La PKA conduce a la fosforilación de la proteína tirosina. ^{[82] [83] [84]} La fosfolipasa C (PLC) está involucrada en la reacción acrosómica. La ZP3 es una glicoproteína presente en la zona pelúcida que interactúa con los receptores del espermatozoide. Por lo tanto, la ZP3 puede activar los receptores acoplados a la proteína G y los receptores de la tirosina quinasa , lo que conduce a la producción de PLC. La PLC escinde el fosfolípido fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) en diacilglicerol (DAG) e inositol 1,4,5-trifosfato . El IP3 se libera como una estructura soluble en el citosol y el DAG permanece unido a la membrana. El IP3 se une a los receptores de IP3, presentes en la membrana del acrosoma. Además, el calcio y el DAG trabajan juntos para activar la proteína quinasa C , que fosforila otras moléculas, lo que conduce a una actividad celular alterada. Estas acciones provocan un aumento en la concentración citosólica de Ca ²⁺ que conduce a la dispersión de la actina y, en consecuencia, promueve la fusión de la membrana plasmática y la membrana externa del acrosoma. ^{[85] [86]} La progesterona es una hormona esteroide producida en el cúmulo oóforo. En las células somáticas se une a receptores en el núcleo ; sin embargo, en el espermatozoide sus receptores están presentes en la membrana plasmática. Esta hormona activa AKT que conduce a la activación de otras proteínas quinasas, involucradas en la capacitación y la reacción del acrosoma. ^{[87] [88]} Cuando las ROS (especies reactivas de oxígeno)Las ROS están presentes en altas concentraciones y pueden afectar la fisiología de las células, pero cuando están presentes en concentraciones moderadas son importantes para la reacción y la capacitación del acrosoma. Las ROS pueden interactuar con la vía de cAMP/PKA y progesterona, estimulándolas. Las ROS también interactúan con la vía de ERK que conduce a la activación de Ras, MEK y proteínas similares a MEK. Estas proteínas activan la proteína tirosina quinasa (PTK) que fosforila varias proteínas importantes para la capacitación y la reacción del acrosoma. ^{[89] [90]}

Varias vías de señalización, como las vías FGF, WNT y TGF-β , regulan los procesos implicados en la embriogénesis .

Los ligandos de FGF (Factor de Crecimiento de Fibroblastos) se unen a los receptores de tirosina quinasa , FGFR (Receptores del Factor de Crecimiento de Fibroblastos), y forman un complejo estable con los correceptores HSPG (Proteoglicanos de Heparán Sulfato) que promoverán la autofosforilación del dominio intracelular de FGFR y la consecuente activación de cuatro vías principales: MAPK/ERK , PI3K , PLCγ y JAK/STAT . ^{[91] [92] [93]}

• MAPK / ERK (Mitogen-Activated Protein Kinase/Extracellular Signal-Regulated Kinase) regula la transcripción genética a través de la fosforilación sucesiva de quinasas y en células madre embrionarias humanas ayuda a mantener la pluripotencia. ^{[93] [94]} Sin embargo, en presencia de Activina A, un ligando de TGF-β, provoca la formación de mesodermo y neuroectodermo . ^[95]
• La fosforilación de los fosfolípidos de membrana por la PI3K (fosfatidilinositol 3-quinasa) da como resultado la activación de la AKT/PKB (proteína quinasa B). Esta quinasa está involucrada en la supervivencia celular y la inhibición de la apoptosis , el crecimiento celular y el mantenimiento de la pluripotencia en células madre embrionarias . ^{[93] [96] [97]}
• La PLC γ (fosfoinosítido fosfolipasa C γ) hidroliza los fosfolípidos de membrana para formar IP3 (inositoltrifosfato) y DAG (diacilglicerol), lo que conduce a la activación de las quinasas y regula los movimientos morfogénicos durante la gastrulación y la neurulación . ^{[91] [92] [98]}
• El STAT (transductor de señales y activador de la transcripción) es fosforilado por la JAK (cinasa Janus) y regula la transcripción génica, determinando el destino de las células. En las células madre embrionarias de ratón, esta vía ayuda a mantener la pluripotencia. ^{[92] [93]}

La vía WNT permite la función de la β-catenina en la transcripción génica, una vez que la interacción entre el ligando WNT y el receptor acoplado a proteína G Frizzled inhibe GSK-3 (glucógeno sintasa quinasa-3) y, por lo tanto, la formación del complejo de destrucción de β-catenina. ^{[93] [99] [100]} Aunque existe cierta controversia sobre los efectos de esta vía en la embriogénesis, se cree que la señalización de WNT induce la formación de la estría primitiva , el mesodermo y el endodermo . ^[100] En la vía TGF-β (factor de crecimiento transformante β), los ligandos BMP (proteína morfogénica ósea), activina y nodal se unen a sus receptores y activan Smads que se unen al ADN y promueven la transcripción génica. ^{[93] [101] [102]} La activina es necesaria para la diferenciación del mesodermo y especialmente del endodermo , y Nodal y BMP están involucrados en el patrón del embrión. La BMP también es responsable de la formación de tejidos extraembrionarios antes y durante la gastrulación, y de la diferenciación temprana del mesodermo, cuando se activan las vías de activina y FGF. ^{[101] [102] [103]}

La construcción de vías ha sido realizada por grupos individuales que estudian una red de interés (por ejemplo, la vía de señalización inmune), así como por grandes consorcios de bioinformática (por ejemplo, el Proyecto Reactome) y entidades comerciales (por ejemplo, Ingenuity Systems ). La construcción de vías es el proceso de identificar e integrar las entidades, interacciones y anotaciones asociadas, y llenar la base de conocimiento. La construcción de vías puede tener un objetivo impulsado por datos (DDO) o un objetivo impulsado por conocimiento (KDO). La construcción de vías impulsada por datos se utiliza para generar información de relación de genes o proteínas identificados en un experimento específico, como un estudio de microarrays. ^[104] La construcción de vías impulsada por conocimiento implica el desarrollo de una base de conocimiento de vías detallada para dominios particulares de interés, como un tipo de célula, enfermedad o sistema. El proceso de curación de una vía biológica implica identificar y estructurar contenido, extraer información manualmente y/o computacionalmente, y ensamblar una base de conocimiento utilizando herramientas de software apropiadas. ^[105] Un esquema que ilustra los principales pasos involucrados en los procesos de construcción basados ​​en datos y conocimientos. ^[104]

Para la construcción de vías DDO o KDO, el primer paso es extraer información pertinente de fuentes de información relevantes sobre las entidades e interacciones. La información recuperada se reúne utilizando formatos apropiados, estándares de información y herramientas de construcción de vías para obtener un prototipo de vía. La vía se refina aún más para incluir anotaciones específicas del contexto, como especie, tipo de célula/tejido o tipo de enfermedad. Luego, los expertos en el dominio pueden verificar la vía y los curadores la pueden actualizar en función de los comentarios apropiados. ^[106] Los intentos recientes de mejorar la integración del conocimiento han llevado a clasificaciones refinadas de entidades celulares, como GO, y al ensamblaje de repositorios de conocimiento estructurado. ^[107] Los repositorios de datos, que contienen información sobre datos de secuencia, metabolismo, señalización, reacciones e interacciones, son una fuente importante de información para la construcción de vías. ^[108] En la siguiente tabla se describen algunas bases de datos útiles. ^[104]

Leyenda: Y – Sí, N – No; BIND – Base de datos de la red de interacción biomolecular, DIP – Base de datos de proteínas interactuantes, GNPV – Visualizador de la plataforma de la red del genoma, HPRD = Base de datos de referencia de proteínas humanas, MINT – Base de datos de interacción molecular, MIPS – Centro de información de Munich para secuencias de proteínas, UNIHI – Interactoma humano unificado, OPHID – Base de datos de interacción humana predicha en línea, EcoCyc – Enciclopedia de genes y metabolismo de E. coli, MetaCyc – Base de datos de vías metabólicas, KEGG – Enciclopedia de genes y genomas de Kioto, PANTHER – Base de datos de análisis de proteínas a través de relaciones evolutivas, STKE – Entorno de conocimiento de transducción de señales, PID – Base de datos de interacción de vías, BioPP – Editor de vías biológicas. Se puede encontrar una lista completa de recursos en http://www.pathguide.org.

La creciente cantidad de información genómica y molecular es la base para comprender los sistemas biológicos de orden superior, como la célula y el organismo, y sus interacciones con el medio ambiente, así como para aplicaciones médicas, industriales y otras aplicaciones prácticas. El recurso KEGG ^[109] proporciona una base de conocimiento de referencia para vincular genomas a sistemas biológicos, categorizados como bloques de construcción en el espacio genómico (GENES KEGG), el espacio químico (LIGANDO KEGG), diagramas de cableado de redes de interacción y redes de reacción (RUTA KEGG) y ontologías para la reconstrucción de vías (base de datos BRITE). ^[110] La base de datos KEGG PATHWAY es una colección de mapas de vías dibujados manualmente para el metabolismo , el procesamiento de información genética, el procesamiento de información ambiental como la transducción de señales, la interacción ligando -receptor y la comunicación celular, varios otros procesos celulares y enfermedades humanas, todos basados ​​en un estudio extenso de la literatura publicada. ^[111]

Gene Map Annotator and Pathway Profiler ( GenMAPP ) ^[112] es un programa informático independiente, gratuito y de código abierto diseñado para organizar, analizar y compartir datos a escala del genoma en el contexto de las vías biológicas. La base de datos GenMAPP admite múltiples anotaciones de genes y especies, así como la creación de bases de datos de especies personalizadas para un número potencialmente ilimitado de especies. ^[113] Los recursos de vías se expanden utilizando información de homología para traducir el contenido de las vías entre especies y extendiendo las vías existentes con datos derivados de interacciones proteicas conservadas y coexpresión. Se ha implementado un nuevo modo de visualización de datos que incluye el curso temporal, el polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) y el empalme , con la base de datos GenMAPP para respaldar el análisis de datos complejos. GenMAPP también ofrece formas innovadoras de mostrar y compartir datos incorporando la exportación HTML de análisis para conjuntos completos de vías como páginas web organizadas. ^[114] En resumen, GenMAPP proporciona un medio para interrogar rápidamente datos experimentales complejos para cambios a nivel de vía en una amplia gama de organismos.

Dada la composición genética de un organismo, el conjunto completo de reacciones posibles constituye su reactoma . Reactome , ubicado en http://www.reactome.org, es un recurso curado y revisado por pares de datos de procesos/vías biológicas humanas. La unidad básica de la base de datos de Reactome es una reacción; las reacciones luego se agrupan en cadenas causales para formar vías ^[115]. El modelo de datos de Reactome nos permite representar muchos procesos diversos en el sistema humano, incluidas las vías del metabolismo intermediario, las vías reguladoras y la transducción de señales, y procesos de alto nivel, como el ciclo celular . ^[116] Reactome proporciona un marco cualitativo, sobre el cual se pueden superponer datos cuantitativos. Se han desarrollado herramientas para facilitar la entrada y anotación de datos personalizados por parte de biólogos expertos, y para permitir la visualización y exploración del conjunto de datos terminado como un mapa de procesos interactivo. ^[117] Aunque el dominio curativo primario son las vías del Homo sapiens, las proyecciones electrónicas de vías humanas sobre otros organismos se crean regularmente a través de ortólogos putativos, lo que hace que Reactome sea relevante para las comunidades de investigación de organismos modelo. La base de datos está disponible públicamente bajo términos de código abierto, lo que permite que tanto su contenido como su infraestructura de software se utilicen y redistribuyan libremente. El estudio de perfiles transcripcionales completos y la catalogación de interacciones proteína-proteína ha producido mucha información biológica valiosa, desde el genoma o el proteoma hasta la fisiología de un organismo, un órgano, un tejido o incluso una sola célula. La base de datos Reactome contiene un marco de posibles reacciones que, cuando se combina con datos de expresión y cinética enzimática, proporciona la infraestructura para modelos cuantitativos, por lo tanto, una vista integrada de los procesos biológicos, que vincula dichos productos genéticos y puede extraerse sistemáticamente mediante el uso de aplicaciones bioinformáticas. ^[118] Los datos de Reactome están disponibles en una variedad de formatos estándar, incluidos BioPAX , SBML y PSI-MI, y también permiten el intercambio de datos con otras bases de datos de vías, como Cycs, KEGG y amaze , y bases de datos de interacción molecular, como BIND y HPRD . La próxima publicación de datos cubrirá la apoptosis, incluidas las vías de señalización del receptor de muerte y las vías Bcl2, así como las vías involucradas en la hemostasia . Otros temas actualmente en desarrollo incluyen varias vías de señalización, mitosis , fototransducción visual y hematopoyesis . ^[119]En resumen, Reactome proporciona resúmenes seleccionados de alta calidad de procesos biológicos fundamentales en humanos en una forma de visualización de datos de vías amigable para biólogos, y es un proyecto de código abierto.

En la era posgenómica, las técnicas de secuenciación de alto rendimiento y de elaboración de perfiles genéticos y proteicos han transformado la investigación biológica al permitir el seguimiento exhaustivo de un sistema biológico, lo que produce una lista de genes o proteínas expresados ​​de forma diferencial, lo que resulta útil para identificar genes que pueden tener funciones en un fenómeno o fenotipo determinado. ^[120] Con los microarreglos de ADN y la ingeniería genética de todo el genoma, es posible examinar los perfiles de expresión genética global para aportar una gran cantidad de datos genómicos al dominio público. Con la interferencia del ARN , es posible destilar las inferencias contenidas en la literatura experimental y las bases de datos primarias en bases de conocimiento que consisten en representaciones anotadas de vías biológicas. En este caso, se sabe que los genes y las proteínas individuales están implicados en procesos, componentes o estructuras biológicas, así como también cómo y dónde los productos genéticos interactúan entre sí. ^{[121] [122]} Los enfoques orientados a vías para analizar datos de microarrays, mediante la agrupación de largas listas de genes, proteínas y/u otras moléculas biológicas individuales según las vías en las que están involucrados en conjuntos más pequeños de genes o proteínas relacionados, lo que reduce la complejidad, han demostrado ser útiles para conectar datos genómicos a procesos y sistemas biológicos específicos. Identificar vías activas que difieren entre dos condiciones puede tener más poder explicativo que una simple lista de diferentes genes o proteínas. Además, una gran cantidad de métodos analíticos de vías explotan el conocimiento de las vías en repositorios públicos como Gene Ontology (GO) o Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes ( KEGG ), en lugar de inferir vías a partir de mediciones moleculares. ^{[123] [124]} Además, diferentes enfoques de investigación han dado a la palabra "vía" diferentes significados. Por ejemplo, "vía" puede denotar una vía metabólica que involucra una secuencia de reacciones catalizadas por enzimas de moléculas pequeñas, o una vía de señalización que involucra un conjunto de reacciones de fosforilación de proteínas y eventos de regulación genética. Por lo tanto, el término "análisis de vías" tiene una aplicación muy amplia. Por ejemplo, puede referirse al análisis de redes de interacción física (por ejemplo, interacciones proteína-proteína), simulación cinética de vías y análisis de vías en estado estable (por ejemplo, análisis de equilibrio de flujo), así como su uso en la inferencia de vías a partir de datos de expresión y secuencia. Se han desarrollado varias herramientas de análisis de enriquecimiento funcional ^{[125] [126] [127] [128]} y algoritmos ^[129] para mejorar la interpretación de los datos. Los métodos de análisis de vías basados ​​en la base de conocimientos existentes en cada generación se han resumido en la literatura reciente.^[130]

Se utilizó un paquete de programa MatchMiner para escanear los nombres HUGO en busca de genes clonados de interés, que luego se ingresan en GoMiner, que aprovechó GO para identificar los procesos biológicos, las funciones y los componentes representados en el perfil genético. Además, la base de datos para anotación, visualización y descubrimiento integrado ( DAVID ) y la base de datos KEGG se pueden utilizar para el análisis de datos de expresión de microarrays y el análisis de cada ontología de proceso biológico (P), componente celular (C) y función molecular (F) de GO. Además, las herramientas DAVID se pueden utilizar para analizar los roles de los genes en las vías metabólicas y mostrar las relaciones biológicas entre genes o productos genéticos y pueden representar vías metabólicas. Estas dos bases de datos también proporcionan herramientas bioinformáticas en línea para combinar información bioquímica específica sobre un determinado organismo y facilitar la interpretación de significados biológicos para datos experimentales. Al utilizar un enfoque combinado de tecnologías de microarrays y bioinformática, se ha demostrado un mecanismo metabólico potencial que contribuye al cáncer colorrectal (CCR) ^[131]. Varios factores ambientales pueden estar involucrados en una serie de puntos a lo largo de la vía genética hacia el CCR. Estos incluyen genes asociados con el metabolismo de los ácidos biliares, el metabolismo de la glucólisis y las vías del metabolismo de los ácidos grasos , lo que respalda la hipótesis de que algunas alteraciones metabólicas observadas en el carcinoma de colon pueden ocurrir en el desarrollo del CCR. ^[131]

Los modelos celulares son fundamentales para diseccionar un proceso patológico complejo en eventos moleculares más simples. La enfermedad de Parkinson (EP) es multifactorial y clínicamente heterogénea; la etiología de la forma esporádica (y más común) aún no está clara y solo se han aclarado hasta ahora unos pocos mecanismos moleculares en la cascada neurodegenerativa . En un panorama tan multifacético, es particularmente importante identificar modelos experimentales que simplifiquen el estudio de las diferentes redes de proteínas y genes involucrados. Los modelos celulares que reproducen algunas de las características de las neuronas que degeneran en la EP han contribuido a muchos avances en nuestra comprensión del flujo patogénico de la enfermedad. En particular, las vías bioquímicas fundamentales (es decir, apoptosis y estrés oxidativo , deterioro mitocondrial y mitofagia disfuncional , estrés de proteínas desplegadas y eliminación inadecuada de proteínas mal plegadas) se han explorado ampliamente en líneas celulares, desafiadas con insultos tóxicos o modificadas genéticamente. El papel central de la a-sinucleína ha generado muchos modelos que apuntan a dilucidar su contribución a la desregulación de varios procesos celulares. Los modelos celulares clásicos parecen ser la opción correcta para estudios preliminares sobre la acción molecular de nuevos fármacos o toxinas potenciales y para comprender el papel de factores genéticos individuales. Además, la disponibilidad de nuevos sistemas celulares, como los cíbridos o las células madre pluripotentes inducidas, ofrece la oportunidad de aprovechar las ventajas de una investigación in vitro, aunque reflejando más de cerca la población celular afectada. ^[132]

La degeneración sináptica y la muerte de las células nerviosas son características definitorias de la enfermedad de Alzheimer (EA), el trastorno neurodegenerativo relacionado con la edad más prevalente. En la EA, las neuronas en el hipocampo y el prosencéfalo basal (regiones del cerebro que sirven para las funciones de aprendizaje y memoria) son selectivamente vulnerables. Los estudios de tejido cerebral post mortem de personas con EA han proporcionado evidencia de mayores niveles de estrés oxidativo, disfunción mitocondrial y alteración de la captación de glucosa en poblaciones neuronales vulnerables. Los estudios de modelos animales y de cultivo celular de EA sugieren que el aumento de los niveles de estrés oxidativo ( peroxidación lipídica de membrana , en particular) puede alterar el metabolismo energético neuronal y la homeostasis iónica, al perjudicar la función de las ATPasas motrices iónicas de membrana , transportadores de glucosa y glutamato . Tal compromiso oxidativo y metabólico puede hacer que las neuronas sean vulnerables a la excitotoxicidad y la apoptosis . Estudios recientes sugieren que la EA puede manifestar alteraciones sistémicas en el metabolismo energético (p. ej., aumento de la resistencia a la insulina y desregulación del metabolismo de la glucosa). La evidencia emergente de que la restricción dietética puede prevenir el desarrollo de la EA es consistente con un componente "metabólico" importante en estos trastornos y brinda optimismo respecto de que estos devastadores trastornos cerebrales del envejecimiento pueden ser en gran medida prevenibles. ^[133]

• Recurso KEGG
• Herramientas DAVID Archivado el 16 de septiembre de 2014 en Wayback Machine.
• Mapa genético
• GoMiner Archivado el 1 de enero de 2016 en Wayback Machine
• Guía de ruta
• [1]