Silenciamiento genético
Proceso que impide la expresión de un gen.

El silenciamiento genético es la regulación de la expresión genética en una célula para evitar la expresión de un gen determinado . [1] [2] El silenciamiento genético puede ocurrir durante la transcripción o la traducción y se utiliza a menudo en la investigación. [1] [2] En particular, los métodos utilizados para silenciar genes se utilizan cada vez más para producir terapias para combatir el cáncer y otras enfermedades, como enfermedades infecciosas y trastornos neurodegenerativos .

El silenciamiento génico se considera a menudo lo mismo que la eliminación de genes . [3] [4] Cuando se silencian los genes, su expresión se reduce. [3] [4] Por el contrario, cuando se eliminan los genes, se borran por completo del genoma del organismo y, por lo tanto, no tienen expresión. [3] [4] El silenciamiento génico se considera un mecanismo de eliminación de genes ya que los métodos utilizados para silenciar genes, como RNAi , CRISPR o siRNA , generalmente reducen la expresión de un gen al menos en un 70% pero no lo eliminan [ cita requerida ] . Los métodos que utilizan el silenciamiento génico a menudo se consideran mejores que los knockouts genéticos [ cita requerida ] ya que permiten a los investigadores estudiar genes esenciales que son necesarios para que los modelos animales sobrevivan y no se pueden eliminar. Además, proporcionan una visión más completa sobre el desarrollo de enfermedades ya que las enfermedades generalmente están asociadas con genes que tienen una expresión reducida. [3]

Tipos

Transcripcional

Post-transcripcional

Meiótico

Métodos de investigación

Oligonucleótidos antisentido

Los oligonucleótidos antisentido fueron descubiertos en 1978 por Paul Zamecnik y Mary Stephenson. [5] Los oligonucleótidos , que son fragmentos cortos de ácido nucleico , se unen a moléculas complementarias de ARNm objetivo cuando se agregan a la célula. [5] [6] Estas moléculas pueden estar compuestas de ADN o ARN monocatenario y generalmente tienen una longitud de 13 a 25 nucleótidos. [6] [7] Los oligonucleótidos antisentido pueden afectar la expresión génica de dos maneras: mediante un mecanismo dependiente de la ARNasa H o mediante un mecanismo de bloqueo estérico. [6] [7] Los oligonucleótidos dependientes de la ARNasa H hacen que las moléculas de ARNm objetivo se degraden, mientras que los oligonucleótidos bloqueadores estéricos previenen la traducción de la molécula de ARNm. [6] [7] La ​​mayoría de los fármacos antisentido funcionan a través del mecanismo dependiente de la ARNasa H, en el que la ARNasa H hidroliza la cadena de ARN del heterodúplex de ADN/ARN . [6] [7] expresión. [6]

Ribozimas

Mecanismo general utilizado por las ribozimas para escindir moléculas de ARN

Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas que se utilizan para inhibir la expresión génica . Estas moléculas funcionan escindiendo moléculas de ARNm , silenciando esencialmente los genes que las produjeron. Sidney Altman y Thomas Cech descubrieron por primera vez las moléculas de ARN catalíticas, las ribozimas de intrones de la ARNasa P y del grupo II, en 1989 y ganaron el Premio Nobel por su descubrimiento. [8] [9] Existen varios tipos de motivos de ribozimas, incluidas las ribozimas de cabeza de martillo , horquilla , virus de la hepatitis delta , grupo I , grupo II y ARNasa P. Los motivos de ribozimas de cabeza de martillo, horquilla y virus de la hepatitis delta (HDV) se encuentran generalmente en virus o ARN viroides. [8] Estos motivos pueden autoescindir un enlace fosfodiéster específico en una molécula de ARNm. [8] Los eucariotas inferiores y algunas bacterias contienen ribozimas del grupo I y del grupo II. [8] Estos motivos pueden autoempalmarse escindiendo y uniendo enlaces fosfodiéster. [8] El último motivo ribozima, la ribozima ARNasa P, se encuentra en Escherichia coli y es conocida por su capacidad de escindir los enlaces fosfodiéster de varios precursores de ARNt cuando se unen a un cofactor proteico. [8]

El mecanismo catalítico general utilizado por las ribozimas es similar al mecanismo utilizado por las ribonucleasas proteicas . [10] Estas moléculas catalíticas de ARN se unen a un sitio específico y atacan al fosfato vecino en la cadena principal del ARN con su oxígeno 2', que actúa como un nucleófilo , lo que resulta en la formación de productos escindidos con un fosfato cíclico 2'3' y un extremo terminal hidroxilo 5'. [10] Este mecanismo catalítico ha sido cada vez más utilizado por los científicos para realizar la escisión específica de la secuencia de moléculas de ARNm objetivo. Además, se están realizando intentos de utilizar ribozimas para producir terapias de silenciamiento de genes, que silenciarían los genes que son responsables de causar enfermedades. [11]

Interferencia de ARN

Izquierda: Descripción general de la interferencia del ARN.

La interferencia de ARN ( RNAi ) es un proceso natural utilizado por las células para regular la expresión genética. Fue descubierto en 1998 por Andrew Fire y Craig Mello , quienes ganaron el Premio Nobel por su descubrimiento en 2006. [12] El proceso para silenciar genes comienza primero con la entrada de una molécula de ARN bicatenario (dsRNA) en la célula, que desencadena la vía de RNAi. [12] Luego, la molécula bicatenaria se corta en pequeños fragmentos bicatenarios mediante una enzima llamada Dicer . [12] Estos pequeños fragmentos, que incluyen pequeños ARN interferentes (siRNA) y microARN (miRNA) , tienen aproximadamente entre 21 y 23 nucleótidos de longitud. [12] [13] Los fragmentos se integran en una proteína de múltiples subunidades llamada complejo de silenciamiento inducido por ARN , que contiene proteínas Argonaute que son componentes esenciales de la vía de RNAi. [12] [13] Una hebra de la molécula, llamada la hebra "guía", se une a RISC, mientras que la otra hebra, conocida como la hebra "pasajera", se degrada. [12] [13] La guía o hebra antisentido del fragmento que permanece unida a RISC dirige el silenciamiento específico de la secuencia de la molécula de ARNm objetivo. [13] Los genes pueden ser silenciados por moléculas de ARNi que causan la escisión endonucleática de las moléculas de ARNm objetivo o por moléculas de miARN que suprimen la traducción de la molécula de ARNm. [13] Con la escisión o represión traduccional de las moléculas de ARNm, los genes que las forman se vuelven esencialmente inactivos. [12] Se cree que el ARNi ha evolucionado como un mecanismo de defensa celular contra invasores, como los virus de ARN , o para combatir la proliferación de transposones dentro del ADN de una célula. [12] Tanto los virus de ARN como los transposones pueden existir como ARN bicatenario y conducir a la activación de RNAi. [12] Actualmente, los ARNi se están utilizando ampliamente para suprimir la expresión de genes específicos y evaluar la función de los genes . Las empresas que utilizan este enfoque incluyen Alnylam , Sanofi , [14] Arrowhead, Discerna, [15] y Persomics , [16] entre otras.

Tres regiones principales no traducidas y microARN

Las tres regiones no traducidas principales (3'UTR) de los ARN mensajeros (ARNm) a menudo contienen secuencias reguladoras que provocan el silenciamiento génico postranscripcional. Estas 3'-UTR a menudo contienen tanto sitios de unión para microARN (miARN) como para proteínas reguladoras . Al unirse a sitios específicos dentro de la 3'-UTR, una gran cantidad de miARN específicos disminuyen la expresión génica de sus ARNm objetivo particulares, ya sea inhibiendo la traducción o causando directamente la degradación de la transcripción, utilizando un mecanismo similar a la interferencia del ARN (ver MicroARN ). La 3'-UTR también puede tener regiones silenciadoras que se unen a proteínas represoras que inhiben la expresión de un ARNm. [ cita requerida ]

El 3'-UTR a menudo contiene elementos de respuesta a microARN (MRE) . Los MRE son secuencias a las que se unen los microARN y provocan el silenciamiento de genes. Estos son motivos predominantes dentro de los 3'-UTR. Entre todos los motivos reguladores dentro de los 3'-UTR (por ejemplo, incluidas las regiones silenciadoras), los MRE constituyen aproximadamente la mitad de los motivos. [ cita requerida ]

En 2014, el sitio web miRBase [17] , un archivo de secuencias y anotaciones de miRNA, enumeraba 28.645 entradas en 233 especies biológicas. De estas, 1.881 miRNA se encontraban en loci de miRNA humanos anotados. Se predijo que cada miRNA tendría un promedio de aproximadamente cuatrocientos ARNm diana (lo que causa el silenciamiento génico de varios cientos de genes). [18] Freidman et al. [18] estiman que >45.000 sitios diana de miRNA dentro de los 3'UTR de ARNm humanos se conservan por encima de los niveles de fondo, y >60% de los genes codificadores de proteínas humanas han estado bajo presión selectiva para mantener el emparejamiento con miRNA. [ cita requerida ]

Experimentos directos muestran que un único miRNA puede reducir la estabilidad de cientos de ARNm únicos. [19] Otros experimentos muestran que un único miRNA puede reprimir la producción de cientos de proteínas, pero que esta represión a menudo es relativamente leve (menos del doble). [20] [21]

Los efectos de la desregulación de la expresión genética por parte de los microARN parecen ser importantes en el cáncer. [22] Por ejemplo, en los cánceres gastrointestinales, se han identificado nueve microARN alterados epigenéticamente y eficaces para regular negativamente las enzimas reparadoras del ADN. [23]

Los efectos de la desregulación de la expresión genética por parte de los miRNA también parecen ser importantes en trastornos neuropsiquiátricos , como la esquizofrenia, el trastorno bipolar, la depresión mayor, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y los trastornos del espectro autista. [24] [25] [26]

Aplicaciones

Investigación médica

Las técnicas de silenciamiento de genes han sido ampliamente utilizadas por los investigadores para estudiar genes asociados con trastornos, como el cáncer , las enfermedades infecciosas , las enfermedades respiratorias y los trastornos neurodegenerativos . El silenciamiento de genes también se está utilizando actualmente en los esfuerzos de descubrimiento de fármacos, como la letalidad sintética , el cribado de alto rendimiento y los cribado de ARNi miniaturizado. [ cita requerida ]

Cáncer

La interferencia de ARN se ha utilizado para silenciar genes asociados con varios tipos de cáncer. En estudios in vitro de leucemia mieloide crónica (LMC) , se utilizó ARNi para escindir la proteína de fusión, BCR-ABL , que evita que el fármaco Gleevec ( imatinib ) se una a las células cancerosas. [27] La ​​escisión de la proteína de fusión redujo la cantidad de células hematopoyéticas transformadas que se propagaron por todo el cuerpo al aumentar la sensibilidad de las células al fármaco. [27] La ​​interferencia de ARN también se puede utilizar para dirigirse a mutantes específicos. Por ejemplo, los ARNi pudieron unirse específicamente a las moléculas supresoras de tumores p53 que contenían una única mutación puntual y destruirla, mientras dejaban intacto el supresor de tipo salvaje. [28]

Los receptores implicados en las vías mitogénicas que conducen al aumento de la producción de células cancerosas también han sido el objetivo de las moléculas de ARNi. El receptor de quimiocinas 4 (CXCR4) , asociado con la proliferación del cáncer de mama, fue escindido por moléculas de ARNi que redujeron el número de divisiones observadas comúnmente por las células cancerosas. [29] Los investigadores también han utilizado ARNi para regular selectivamente la expresión de genes relacionados con el cáncer. Las proteínas antiapoptóticas, como la clusterina y la survivina , a menudo se expresan en células cancerosas. [30] [31] Los ARNi dirigidos a la clusterina y la survivina se utilizaron para reducir el número de proteínas antiapoptóticas y, por tanto, aumentar la sensibilidad de las células cancerosas a los tratamientos de quimioterapia. [30] [31] Los estudios in vivo también se están utilizando cada vez más para estudiar el uso potencial de las moléculas de ARNi en la terapéutica del cáncer. Por ejemplo, se descubrió que los ratones a los que se les implantaron células de adenocarcinoma de colon sobrevivían más tiempo cuando las células eran tratadas previamente con ARNi dirigidos a la β-catenina en las células cancerosas. [32]

Enfermedad infecciosa

Virus

Los genes virales y los genes del huésped que son necesarios para que los virus se repliquen o entren en la célula, o que desempeñan un papel importante en el ciclo de vida del virus, suelen ser el objetivo de las terapias antivirales. El ARNi se ha utilizado para atacar genes en varias enfermedades virales, como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y la hepatitis . [33] [34] En particular, se utilizó ARNi para silenciar el receptor de quimiocina 5 del receptor primario del VIH (CCR5). [35] Esto evitó que el virus entrara en los linfocitos de sangre periférica humana y en las células madre hematopoyéticas primarias. [35] [36] Se utilizó una técnica similar para disminuir la cantidad de virus detectable en las células infectadas con hepatitis B y C. En la hepatitis B, se utilizó el silenciamiento de ARNi para atacar el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B y condujo a una disminución en la cantidad de componentes virales. [37] Además, las técnicas de ARNi utilizadas en la hepatitis C pudieron reducir la cantidad de virus en la célula en un 98%. [38] [39]

La interferencia de ARN se ha utilizado comercialmente para controlar enfermedades virales de plantas durante más de 20 años (ver Resistencia a enfermedades de plantas ). En 1986-1990, se publicaron múltiples ejemplos de "resistencia mediada por proteína de cubierta" contra virus de plantas, antes de que se descubriera la interferencia de ARN. [40] En 1993, el trabajo con el virus del grabado del tabaco demostró por primera vez que los organismos hospedadores pueden dirigirse a secuencias específicas de virus o ARNm para su degradación, y que esta actividad es el mecanismo detrás de algunos ejemplos de resistencia a virus en plantas transgénicas. [41] [42] El descubrimiento de pequeños ARN interferentes (el determinante de especificidad en el silenciamiento génico mediado por ARN) también utilizó el silenciamiento génico postranscripcional inducido por virus en plantas. [43] Para 1994, se habían generado variedades de calabaza transgénica que expresaban genes de proteína de cubierta de tres virus diferentes, lo que proporcionó híbridos de calabaza con resistencia multiviral validada en el campo que siguen en uso comercial en la actualidad. Las líneas de papa que expresan secuencias de replicasa viral que confieren resistencia al virus del enrollamiento de la hoja de la papa se vendieron bajo los nombres comerciales NewLeaf Y y NewLeaf Plus, y fueron ampliamente aceptadas en la producción comercial en 1999-2001, hasta que McDonald's Corp. decidió no comprar papas GM y Monsanto decidió cerrar su negocio de papas NatureMark. [44] Otro ejemplo citado con frecuencia de resistencia a virus mediada por silenciamiento genético involucra a la papaya, donde la industria de la papaya hawaiana fue rescatada por papayas GM resistentes a virus producidas y autorizadas por investigadores universitarios en lugar de una gran corporación. [45] Estas papayas también siguen en uso en la actualidad, aunque no sin una protesta pública significativa, [46] [47] lo que es notablemente menos evidente en los usos médicos del silenciamiento genético.

Las técnicas de silenciamiento génico también se han utilizado para atacar a otros virus, como el virus del papiloma humano , el virus del Nilo Occidental y el virus Tulane. El gen E6 en muestras de tumores recuperadas de pacientes con el virus del papiloma humano fue atacado y se encontró que causa apoptosis en las células infectadas. [48] Los vectores de expresión de ARNi plasmídicos utilizados para atacar al virus del Nilo Occidental también pudieron prevenir la replicación de virus en líneas celulares. [49] Además, se ha descubierto que el ARNi tiene éxito en la prevención de la replicación del virus Tulane, parte de la familia de virus Caliciviridae , al atacar sus genes estructurales y no estructurales. [50] Al atacar el gen NTPasa, se demostró que una dosis de ARNi 4 horas antes de la infección controlaba la replicación del virus Tulane durante 48 horas después de la infección, reduciendo el título viral hasta en 2,6 logaritmos. [50] Aunque el virus Tulane es específico de una especie y no afecta a los humanos, se ha demostrado que está estrechamente relacionado con el norovirus humano , que es la causa más común de gastroenteritis aguda y brotes de enfermedades transmitidas por alimentos en los Estados Unidos. [51] Los norovirus humanos son conocidos por ser difíciles de estudiar en el laboratorio, pero el virus Tulane ofrece un modelo a través del cual estudiar esta familia de virus con el objetivo clínico de desarrollar terapias que puedan usarse para tratar enfermedades causadas por el norovirus humano. [ cita requerida ]

Bacteria
Estructura de una célula bacteriana Gram-positiva típica

A diferencia de los virus, las bacterias no son tan susceptibles al silenciamiento por ARNi. [52] Esto se debe en gran medida a la forma en que se replican las bacterias. Las bacterias se replican fuera de la célula huésped y no contienen la maquinaria necesaria para que funcione el ARNi. [52] Sin embargo, las infecciones bacterianas aún pueden ser suprimidas por ARNi al dirigirse a los genes del huésped que están involucrados en la respuesta inmune causada por la infección o al dirigirse a los genes del huésped involucrados en la mediación de la entrada de bacterias en las células. [52] [53] Por ejemplo, se utilizó ARNi para reducir la cantidad de citocinas proinflamatorias expresadas en las células de ratones tratados con lipopolisacárido (LPS) . [52] [54] La expresión reducida de la citocina inflamatoria, factor de necrosis tumoral α (TNFα) , a su vez, causó una reducción en el choque séptico sentido por los ratones tratados con LPS. [54] Además, se utilizó ARNi para evitar que la bacteria Psueomonas aeruginosa invadiera las células epiteliales del pulmón murino al inhibir el gen caveolina-2 (CAV2). [55] Por lo tanto, aunque las bacterias no pueden ser atacadas directamente por los mecanismos de ARNi, aún pueden verse afectadas por el ARNi cuando se atacan los componentes involucrados en la infección bacteriana. [ cita requerida ]

Enfermedades respiratorias

Las ribozimas, los oligonucleótidos antisentido y, más recientemente, el ARNi se han utilizado para atacar las moléculas de ARNm implicadas en el asma . [53] [56] Estos experimentos han sugerido que el ARNi puede utilizarse para combatir otras enfermedades respiratorias, como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y la fibrosis quística . [53] La EPOC se caracteriza por hiperplasia de células caliciformes e hipersecreción de moco . [57] Se descubrió que la secreción de moco se reducía cuando el ARNi atacaba el factor de crecimiento transformante (TGF)-α en las células epiteliales de las vías respiratorias humanas NCI-H292 . [58] Además de la hipersecreción de moco, la inflamación crónica y el tejido pulmonar dañado son característicos de la EPOC y el asma. Se cree que el factor de crecimiento transformante TGF-β desempeña un papel en estas manifestaciones. [59] [60] Como resultado, cuando se utilizó interferón (IFN)-γ para inhibir el TGF-β, se mejoró la fibrosis de los pulmones, causada por el daño y la cicatrización del tejido pulmonar. [61] [62]

Trastornos neurodegenerativos

Enfermedad de Huntington
Estructura cristalográfica de la región N-terminal de la proteína huntingtina humana.

La enfermedad de Huntington (EH) es el resultado de una mutación en el gen huntingtina que causa un exceso de repeticiones CAG. [63] El gen luego forma una proteína huntingtina mutada con repeticiones de poliglutamina cerca del extremo amino . [64] Esta enfermedad es incurable y se sabe que causa déficits motores, cognitivos y conductuales. [65] Los investigadores han estado considerando el silenciamiento de genes como una posible terapia para la EH. [ cita requerida ]

El silenciamiento génico se puede utilizar para tratar la EH al dirigirse a la proteína huntingtina mutante. La proteína huntingtina mutante se ha dirigido a través del silenciamiento génico que es específico del alelo utilizando oligonucleótidos específicos del alelo . En este método, los oligonucleótidos antisentido se utilizan para dirigirse a los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) , que son cambios de un solo nucleótido en la secuencia de ADN, ya que se ha descubierto que los pacientes con EH comparten SNP comunes que están asociados con el alelo huntingtina mutado. Se ha descubierto que aproximadamente el 85% de los pacientes con EH pueden ser cubiertos cuando se dirigen a tres SNP. Además, cuando se utilizaron oligonucleótidos antisentido para dirigirse a un SNP asociado a la EH en ratones, hubo una disminución del 50% en la proteína huntingtina mutante. [63]

También se ha utilizado el silenciamiento de genes no específicos de alelos mediante moléculas de ARNi para silenciar las proteínas huntingtina mutantes. Mediante este enfoque, en lugar de dirigirse a los SNP de la proteína mutada, se dirigen a todas las proteínas huntingtina normales y mutadas. Cuando se estudió en ratones, se descubrió que el ARNi podía reducir los niveles de huntingtina normal y mutante en un 75 %. A este nivel, descubrieron que los ratones desarrollaban un mejor control motor y una mayor tasa de supervivencia en comparación con los controles. [63] Por lo tanto, los métodos de silenciamiento de genes pueden resultar beneficiosos en el tratamiento de la EH.

Esclerosis lateral amiotrófica

La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) , también llamada enfermedad de Lou Gehrig, es una enfermedad de las neuronas motoras que afecta el cerebro y la médula espinal . La enfermedad hace que las neuronas motoras se degeneren, lo que finalmente conduce a la muerte neuronal y la degeneración muscular. [66] Se ha descubierto que cientos de mutaciones en el gen de la superóxido dismutasa Cu/Zn (SOD1) causan ELA. [67] El silenciamiento génico se ha utilizado para inhibir el mutante SOD1 que es característico de la ELA. [67] [68] En concreto, se han utilizado con éxito moléculas de ARNi para atacar al gen mutante SOD1 y reducir su expresión a través del silenciamiento génico específico de alelos. [67] [69]

Desafíos terapéuticos

Mecanismo básico que utilizan los vectores virales para transportar genes a las células diana. El ejemplo que se muestra es un vector lentiviral.

Existen varios desafíos asociados con las terapias de silenciamiento génico, incluyendo la administración y la especificidad para las células objetivo. Por ejemplo, para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos, las moléculas para una posible terapia de silenciamiento génico deben administrarse al cerebro. La barrera hematoencefálica dificulta la administración de moléculas al cerebro a través del torrente sanguíneo al impedir el paso de la mayoría de las moléculas que se inyectan o absorben en la sangre. [63] [64] Por lo tanto, los investigadores han descubierto que deben inyectar directamente las moléculas o implantar bombas que las impulsen hacia el cerebro. [63]

Sin embargo, una vez dentro del cerebro, las moléculas deben moverse dentro de las células objetivo. Para administrar de manera eficiente las moléculas de ARNi a las células, se pueden utilizar vectores virales . [63] [65] Sin embargo, este método de administración también puede ser problemático, ya que puede provocar una respuesta inmunitaria contra las moléculas. Además de la administración, se ha descubierto que la especificidad también es un problema en el silenciamiento génico. Tanto los oligonucleótidos antisentido como las moléculas de ARNi pueden unirse potencialmente a la molécula de ARNm incorrecta. [63] Por lo tanto, los investigadores están buscando métodos más eficientes para administrar y desarrollar terapias específicas de silenciamiento génico que sigan siendo seguras y efectivas. [ cita requerida ]

Alimento

Las manzanas Arctic son una serie de manzanas registradas [70] que contienen una propiedad que evita el oscurecimiento, creada mediante el silenciamiento de genes para reducir la expresión de la polifenol oxidasa (PPO). Es el primer producto alimenticio aprobado que utiliza esta técnica. [71]

Véase también

Referencias

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