Interferencia de ARN

La interferencia de ARN ( RNAi ) es un proceso biológico en el que las moléculas de ARN participan en la supresión específica de secuencia de la expresión génica por ARN bicatenario , a través de la represión traduccional o transcripcional. Históricamente, la RNAi se conocía con otros nombres, entre ellos cosupresión , silenciamiento génico postranscripcional (PTGS) y quelling . El estudio detallado de cada uno de estos procesos aparentemente diferentes dilucidó que la identidad de estos fenómenos era en realidad RNAi. Andrew Fire y Craig C. Mello compartieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 2006 por su trabajo sobre RNAi en el gusano nematodo Caenorhabditis elegans , que publicaron en 1998. Desde el descubrimiento de RNAi y sus potenciales reguladores, se ha hecho evidente que RNAi tiene un inmenso potencial en la supresión de genes deseados. RNAi ahora se conoce como preciso, eficiente, estable y mejor que la terapia antisentido para la supresión génica. ^[1] Se puede desarrollar ARN antisentido producido intracelularmente por un vector de expresión y encontrarlo útil como nuevo agente terapéutico. ^[2]

Dos tipos de pequeñas moléculas de ácido ribonucleico (ARN), el microARN (miARN) y el pequeño ARN interferente ( siARN ), son fundamentales para los componentes de la vía del ARNi. Una vez que se degrada el ARNm, se produce un silenciamiento postranscripcional a medida que se impide la traducción de proteínas. La transcripción se puede inhibir a través del mecanismo de silenciamiento pretranscripcional del ARNi, a través del cual un complejo enzimático cataliza la metilación del ADN en posiciones genómicas complementarias al ARNi o miARN complejado. El ARNi tiene un papel importante en la defensa de las células contra secuencias de nucleótidos parásitas (p. ej., virus o transposones ) y también influye en el desarrollo de los organismos.

La vía de RNAi es un proceso natural que se encuentra en muchos eucariotas y células animales. Es iniciada por la enzima Dicer , que escinde moléculas largas de ARN bicatenario (dsRNA) en fragmentos cortos de doble cadena de aproximadamente 21 a 23 nucleótidos de siRNA. Cada siRNA se desenrolla en dos ARN monocatenarios (ssRNA), la cadena pasajera (sentido) y la cadena guía (antisentido). La cadena pasajera es luego escindida por la proteína Argonaute 2 (Ago2). La cadena pasajera se degrada y la cadena guía se incorpora al complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC). El ensamblaje RISC luego se une y degrada el ARNm objetivo. Específicamente, esto se logra cuando la cadena guía se empareja con una secuencia complementaria en una molécula de ARNm e induce la escisión por Ago2, un componente catalítico del RISC. En algunos organismos, este proceso se propaga sistémicamente, a pesar de las concentraciones molares inicialmente limitadas de ARNi. ^[3]

El ARNi es una herramienta de investigación valiosa, tanto en cultivos celulares como en organismos vivos , porque el ARN bicatenario sintético introducido en las células puede inducir de forma selectiva y robusta la supresión de genes específicos de interés. El ARNi puede utilizarse para análisis a gran escala que inhiben sistemáticamente cada gen (y las proteínas posteriores que codifica) en la célula, lo que puede ayudar a identificar los componentes necesarios para un proceso celular particular o un evento como la división celular . La vía también se utiliza como una herramienta práctica para alimentos, medicamentos e insecticidas . ^[4]

El RNAi es un proceso de silenciamiento génico dependiente del ARN que está controlado por RISC y es iniciado por moléculas cortas de ARN bicatenario en el citoplasma de una célula, donde interactúan con el componente catalítico RISC Argonaute . ^[6] Cuando el dsRNA es exógeno (procedente de una infección por un virus con un genoma de ARN o manipulaciones de laboratorio), el ARN se importa directamente al citoplasma y Dicer lo escinde en fragmentos cortos. El dsRNA iniciador también puede ser endógeno (originario de la célula), como en los pre-microRNA expresados ​​a partir de genes codificadores de ARN en el genoma. Las transcripciones primarias de dichos genes se procesan primero para formar la estructura característica de tallo-bucle del pre-miRNA en el núcleo , luego se exportan al citoplasma. Por lo tanto, las dos vías del dsRNA, exógena y endógena, convergen en el RISC. ^[7]

El dsRNA exógeno inicia el RNAi activando la proteína ribonucleasa Dicer, ^[8] que se une y escinde los dsRNA en plantas, o los ARN de horquilla corta (shRNA) en humanos, para producir fragmentos bicatenarios de 20-25 pares de bases con un saliente de 2 nucleótidos en el extremo 3'. ^{[9] Los estudios} bioinformáticos sobre los genomas de múltiples organismos sugieren que esta longitud maximiza la especificidad del gen diana y minimiza los efectos no específicos. ^[10] Estos fragmentos bicatenarios cortos se denominan siRNA . Estos siRNA luego se separan en hebras simples y se integran en un RISC activo, por RISC-Loading Complex (RLC). RLC incluye Dicer-2 y R2D2, y es crucial para unir Ago2 y RISC. ^[11] El factor 11 asociado a la proteína de unión a TATA (TAF11) ensambla el RLC al facilitar la tetramerización de Dcr-2-R2D2, lo que aumenta la afinidad de unión al ARNi en 10 veces. La asociación con TAF11 convertiría el complejo R2-D2-Iniciador (RDI) en el RLC. ^[12] R2D2 lleva dominios de unión al ARN bicatenario en tándem para reconocer el extremo termodinámicamente estable de los dúplex de ARNi , mientras que Dicer-2 lleva el otro extremo menos estable. La carga es asimétrica: el dominio MID de Ago2 reconoce el extremo termodinámicamente estable del ARNi. Por lo tanto, la cadena "pasajera" (sentido) cuyo extremo 5' es descartado por MID es expulsada, mientras que la cadena "guía" (antisentido) guardada coopera con AGO para formar el RISC. ^[11]

Después de la integración en el RISC, los siRNA se aparean con su ARNm objetivo y lo escinden, evitando así que se lo use como plantilla de traducción . ^[13] A diferencia del siRNA , un complejo RISC cargado con miRNA escanea los ARNm citoplasmáticos en busca de una posible complementariedad. En lugar de una escisión destructiva (por Ago2), los miRNA se dirigen a las regiones 3' no traducidas (UTR) de los ARNm donde normalmente se unen con una complementariedad imperfecta, bloqueando así el acceso de los ribosomas para la traducción. ^[14]

El dsRNA exógeno es detectado y unido por una proteína efectora, conocida como RDE-4 en C. elegans y R2D2 en Drosophila , que estimula la actividad de Dicer. ^[15] Se desconoce el mecanismo que produce esta especificidad de longitud y esta proteína solo se une a dsRNA largos. ^[15]

En C. elegans, esta respuesta de iniciación se amplifica a través de la síntesis de una población de ARNi "secundarios" durante la cual los ARNi iniciadores o "primarios" producidos por Dicer se utilizan como plantillas. ^[16] Estos ARNi "secundarios" son estructuralmente distintos de los ARNi producidos por Dicer y parecen ser producidos por una ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP). ^[17]

Los microARN (miARN) son ARN no codificantes codificados genómicamente que ayudan a regular la expresión génica , particularmente durante el desarrollo . ^[18] El fenómeno de RNAi, ampliamente definido, incluye los efectos de silenciamiento génico inducidos endógenamente de los miARN, así como el silenciamiento desencadenado por dsARN extraño. Los miARN maduros son estructuralmente similares a los siARN producidos a partir de dsARN exógeno, pero antes de alcanzar la madurez, los miARN primero deben sufrir una extensa modificación postranscripcional . Un miARN se expresa a partir de un gen codificador de ARN mucho más largo como una transcripción primaria conocida como pri-miARN que se procesa, en el núcleo celular , a una estructura de tallo-bucle de 70 nucleótidos llamada pre-miARN por el complejo microprocesador . Este complejo consta de una enzima ARNasa III llamada Drosha y una proteína de unión a dsARN DGCR8 . La porción dsRNA de este pre-miRNA se une y escinde por Dicer para producir la molécula de miRNA madura que se puede integrar en el complejo RISC; por lo tanto, el miRNA y el siRNA comparten la misma maquinaria celular descendente. ^[19] Primero, el miRNA codificado viral se describió en el virus de Epstein-Barr (VEB). ^[20] A partir de entonces, se ha descrito un número cada vez mayor de microRNA en virus. VIRmiRNA es un catálogo completo que cubre el microRNA viral, sus objetivos y los miRNA antivirales ^[21] (ver también el recurso VIRmiRNA: http://crdd.osdd.net/servers/virmirna/).

Los siRNA derivados de precursores de dsRNA largos difieren de los miRNA en que los miRNA, especialmente los de animales, típicamente tienen un apareamiento de bases incompleto con un objetivo e inhiben la traducción de muchos ARNm diferentes con secuencias similares. Por el contrario, los siRNA típicamente tienen un apareamiento de bases perfecto e inducen la escisión del ARNm solo en un único objetivo específico. ^[22] En Drosophila y C. elegans , los miRNA y siRNA son procesados ​​por proteínas Argonaute y enzimas Dicer distintas. ^{[23] [24]}

Las tres regiones no traducidas principales (3'-UTR) de los ARNm suelen contener secuencias reguladoras que provocan la interferencia del ARN postranscripcional. Estas 3'-UTR suelen contener tanto sitios de unión para los miARN como para las proteínas reguladoras. Al unirse a sitios específicos dentro de la 3'-UTR, los miARN pueden disminuir la expresión génica de varios ARNm, ya sea inhibiendo la traducción o causando directamente la degradación de la transcripción. La 3'-UTR también puede tener regiones silenciadoras que se unen a proteínas represoras que inhiben la expresión de un ARNm.

El 3′-UTR a menudo contiene elementos de respuesta a microARN (MRE) . Los MRE son secuencias a las que se unen los microARN. Estos son motivos predominantes dentro de los 3′-UTR. Entre todos los motivos reguladores dentro de los 3′-UTR (por ejemplo, incluidas las regiones silenciadoras), los MRE constituyen aproximadamente la mitad de los motivos.

En 2023, el sitio web miRBase , ^[25] un archivo de secuencias y anotaciones de miRNA , enumeraba 28.645 entradas en 271 especies biológicas. De estas, 1.917 miRNA se encontraban en loci de miRNA humanos anotados. Se predijo que los miRNA tendrían un promedio de alrededor de cuatrocientos ARNm diana (que afectan la expresión de varios cientos de genes). ^[26] Friedman et al. ^[26] estiman que >45.000 sitios diana de miRNA dentro de los 3′UTR de ARNm humano se conservan por encima de los niveles de fondo, y >60% de los genes codificadores de proteínas humanas han estado bajo presión selectiva para mantener el emparejamiento con miRNA.

Experimentos directos muestran que un único miRNA puede reducir la estabilidad de cientos de ARNm únicos. ^[27] Otros experimentos muestran que un único miRNA puede reprimir la producción de cientos de proteínas, pero que esta represión a menudo es relativamente leve (menos del doble). ^{[28] [29]}

Los efectos de la desregulación de la expresión genética por parte de los microARN parecen ser importantes en el cáncer. ^[30] Por ejemplo, en los cánceres gastrointestinales, se han identificado nueve microARN alterados epigenéticamente y eficaces para regular negativamente las enzimas de reparación del ADN. ^[31]

Los efectos de la desregulación de la expresión genética por parte de los miRNA también parecen ser importantes en trastornos neuropsiquiátricos, como la esquizofrenia, el trastorno bipolar, la depresión mayor, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y los trastornos del espectro autista. ^{[32] [33] [34]}

El dsRNA exógeno es detectado y unido por una proteína efectora, conocida como RDE-4 en C. elegans y R2D2 en Drosophila , que estimula la actividad de Dicer. ^[15] Esta proteína solo se une a dsRNA largos, pero se desconoce el mecanismo que produce esta especificidad de longitud. ^[15] Esta proteína de unión al ARN facilita luego la transferencia de siRNA escindidos al complejo RISC. ^[35]

En C. elegans, esta respuesta de iniciación se amplifica a través de la síntesis de una población de ARNi "secundarios" durante la cual los ARNi iniciadores o "primarios" producidos por Dicer se utilizan como plantillas. ^[16] Estos ARNi "secundarios" son estructuralmente distintos de los ARNi producidos por Dicer y parecen ser producidos por una ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRP). ^[17]

Los componentes activos de un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) son endonucleasas llamadas proteínas Argonaute, que escinden la cadena de ARNm diana complementaria a su ARNi unido . ^[6] Como los fragmentos producidos por Dicer son de doble cadena, cada uno podría, en teoría, producir un ARNi funcional . Sin embargo, solo una de las dos cadenas, conocida como cadena guía , se une a Argonaute y dirige el silenciamiento del gen. La otra cadena anti-guía o cadena pasajera se degrada durante la activación de RISC. ^[36] Aunque primero se creyó que una helicasa dependiente de ATP separaba estas dos cadenas, ^[37] el proceso demostró ser independiente de ATP y realizado directamente por los componentes proteicos de RISC. ^{[3] [38]} Sin embargo, un análisis cinético in vitro de RNAi en presencia y ausencia de ATP mostró que puede requerirse ATP para desenrollar y eliminar la cadena de ARNm escindida del complejo RISC después de la catálisis. ^[39] La cadena guía tiende a ser aquella cuyo extremo 5' está emparejado de manera menos estable con su complemento, ^[40] pero la selección de la cadena no se ve afectada por la dirección en la que Dicer corta el dsRNA antes de la incorporación de RISC. ^[41] En cambio, la proteína R2D2 puede servir como factor diferenciador al unirse al extremo 5' más estable de la cadena pasajera. ^[42]

La base estructural de la unión del ARN a la proteína Argonauta se examinó mediante cristalografía de rayos X del dominio de unión de un Argonauta unido al ARN. Aquí, el extremo 5′ fosforilado de la cadena de ARN entra en un bolsillo superficial básico conservado y hace contactos a través de un catión divalente (un átomo con dos cargas positivas) como el magnesio y por apilamiento aromático (un proceso que permite que más de un átomo comparta un electrón pasándolo de un lado a otro) entre el nucleótido 5′ en el ARNi y un residuo de tirosina conservado . Se cree que este sitio forma un sitio de nucleación para la unión del ARNi a su ARNm diana. ^[43] El análisis del efecto inhibidor de los desajustes en el extremo 5' o 3' de la cadena guía ha demostrado que el extremo 5' de la cadena guía es probablemente responsable de la coincidencia y la unión con el ARNm objetivo, mientras que el extremo 3' es responsable de organizar físicamente el ARNm objetivo en una región RISC favorable a la escisión. ^[39]

No se entiende cómo el complejo RISC activado localiza los ARNm complementarios dentro de la célula. Aunque se ha propuesto que el proceso de escisión está vinculado a la traducción , la traducción del ARNm diana no es esencial para la degradación mediada por RNAi. ^[44] De hecho, el RNAi puede ser más eficaz contra los ARNm dianas que no se traducen. ^[45] Las proteínas Argonaute se localizan en regiones específicas en el citoplasma llamadas P-bodies (también cuerpos citoplasmáticos o cuerpos GW), que son regiones con altas tasas de descomposición del ARNm; ^[46] La actividad de miRNA también se agrupa en P-bodies. ^[47] La ​​interrupción de P-bodies disminuye la eficiencia de RNAi, lo que sugiere que son un sitio crítico en el proceso de RNAi. ^[48]

Los componentes de la vía RNAi se utilizan en muchos eucariotas en el mantenimiento de la organización y estructura de sus genomas . La modificación de histonas y la inducción asociada de la formación de heterocromatina sirven para regular negativamente los genes pretranscripcionalmente ; [ ^50] este proceso se conoce como silenciamiento transcripcional inducido por ARN (RITS), y se lleva a cabo por un complejo de proteínas llamado complejo RITS. En la levadura de fisión , este complejo contiene Argonaute, una proteína cromodominio Chp1 y una proteína llamada Tas3 de función desconocida. ^[51] Como consecuencia, la inducción y propagación de regiones heterocromáticas requiere las proteínas Argonaute y RdRP. ^[52] De hecho, la eliminación de estos genes en la levadura de fisión S. pombe interrumpe la metilación de histonas y la formación del centrómero , ^{[53] causando} una anafase lenta o estancada durante la división celular . ^[54] En algunos casos, se ha observado que procesos similares asociados con la modificación de histonas regulan positivamente la transcripción de genes. ^[55]

El mecanismo por el cual el complejo RITS induce la formación y organización de la heterocromatina no se entiende bien. La mayoría de los estudios se han centrado en la región de tipo de apareamiento en la levadura de fisión, que puede no ser representativa de las actividades en otras regiones/organismos genómicos. En el mantenimiento de las regiones de heterocromatina existentes, RITS forma un complejo con ARNi complementarios a los genes locales y se une de manera estable a las histonas metiladas locales, actuando co-transcripcionalmente para degradar cualquier transcripción de pre-ARNm naciente que sea iniciada por la ARN polimerasa . La formación de dicha región de heterocromatina, aunque no su mantenimiento, depende de Dicer, presumiblemente porque Dicer es necesario para generar el complemento inicial de ARNi que se dirigen a las transcripciones posteriores. ^[56] Se ha sugerido que el mantenimiento de la heterocromatina funciona como un bucle de retroalimentación de autorreforzamiento, ya que los nuevos ARNi se forman a partir de las transcripciones nacientes ocasionales por RdRP para su incorporación a los complejos RITS locales. ^[57] La ​​relevancia de las observaciones de las regiones de apareamiento y los centrómeros de la levadura de fisión para los mamíferos no está clara, ya que el mantenimiento de la heterocromatina en las células de mamíferos puede ser independiente de los componentes de la vía del ARNip. ^[58]

El tipo de edición de ARN que es más frecuente en eucariotas superiores convierte nucleótidos de adenosina en inosina en dsRNAs a través de la enzima adenosina desaminasa (ADAR). ^[59] Se propuso originalmente en 2000 que las vías de edición de ARN RNAi y A→I podrían competir por un sustrato de dsRNA común. ^[60] Algunos pre-miRNAs experimentan edición de ARN A→I ^{[61] [62]} y este mecanismo puede regular el procesamiento y la expresión de miRNA maduros. ^[62] Además, al menos un ADAR mamífero puede secuestrar siRNAs de componentes de la vía RNAi. ^[63] Otro respaldo para este modelo proviene de estudios sobre cepas de C. elegans ADAR-nulas que indican que la edición de ARN A→I puede contrarrestar el silenciamiento de genes endógenos y transgenes por RNAi. ^[64]

Los organismos varían en su capacidad para captar dsRNA extraño y usarlo en la vía RNAi. Los efectos de RNAi pueden ser tanto sistémicos como hereditarios en plantas y C. elegans , aunque no en Drosophila o mamíferos. En plantas, se cree que RNAi se propaga por la transferencia de siRNA entre células a través de plasmodesmos (canales en las paredes celulares que permiten la comunicación y el transporte). ^[37] La ​​heredabilidad proviene de la metilación de promotores diana por RNAi; el nuevo patrón de metilación se copia en cada nueva generación de la célula. ^[66] Una amplia distinción general entre plantas y animales radica en la orientación de los miRNA producidos endógenamente; en plantas, los miRNA suelen ser perfectamente o casi perfectamente complementarios a sus genes diana e inducen la escisión directa del mRNA por RISC, mientras que los miRNA de los animales tienden a ser más divergentes en secuencia e inducen la represión de la traducción. ^[65] Este efecto traduccional puede producirse inhibiendo las interacciones de los factores de iniciación de la traducción con la cola de poliadenina del ARNm . ^[67]

Algunos protozoos eucariotas como Leishmania major y Trypanosoma cruzi carecen por completo de la vía RNAi. ^{[68] [69]} La mayoría o todos los componentes también faltan en algunos hongos , más notablemente el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae . ^[70] La presencia de RNAi en otras especies de levadura en ciernes como Saccharomyces castellii y Candida albicans , demuestra además que la inducción de dos proteínas relacionadas con RNAi de S. castellii facilita RNAi en S. cerevisiae . ^[71] El hecho de que ciertos ascomicetos y basidiomicetos carezcan de vías RNAi indica que las proteínas necesarias para el silenciamiento de ARN se han perdido independientemente de muchos linajes de hongos , posiblemente debido a la evolución de una nueva vía con función similar, o a la falta de ventaja selectiva en ciertos nichos . ^[72]

La expresión génica en procariotas está influenciada por un sistema basado en ARN similar en algunos aspectos al RNAi. En este caso, los genes que codifican ARN controlan la abundancia o la traducción del ARNm al producir un ARN complementario que se une a un ARNm. Sin embargo, estos ARN reguladores no se consideran generalmente análogos a los microARN porque la enzima Dicer no está involucrada. ^[73] Se ha sugerido que los sistemas de interferencia CRISPR en procariotas son análogos a los sistemas RNAi eucariotas, aunque ninguno de los componentes proteicos es ortólogo . ^[74]

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El ARNi es una parte vital de la respuesta inmune a los virus y otro material genético extraño , especialmente en plantas donde también puede prevenir la autopropagación de transposones. ^[75] Plantas como Arabidopsis thaliana expresan múltiples homólogos de Dicer que están especializados para reaccionar de manera diferente cuando la planta está expuesta a diferentes virus. ^[76] Incluso antes de que la vía del ARNi se entendiera completamente, se sabía que el silenciamiento genético inducido en las plantas podría propagarse por toda la planta en un efecto sistémico y podría transferirse de las plantas de stock a las plantas de vástago a través del injerto . ^[77] Desde entonces, este fenómeno ha sido reconocido como una característica del sistema inmunológico de la planta que permite que toda la planta responda a un virus después de un encuentro localizado inicial. ^[78] En respuesta, muchos virus de plantas han desarrollado mecanismos elaborados para suprimir la respuesta del ARNi. ^[79] Estos incluyen proteínas virales que se unen a fragmentos cortos de ARN bicatenario con extremos salientes de cadena sencilla, como los producidos por Dicer. ^[80] Algunos genomas de plantas también expresan ARNi endógenos en respuesta a la infección por tipos específicos de bacterias . ^[81] Estos efectos pueden ser parte de una respuesta generalizada a los patógenos que regula negativamente cualquier proceso metabólico en el huésped que ayude al proceso de infección. ^[82]

Aunque los animales generalmente expresan menos variantes de la enzima Dicer que las plantas, el RNAi en algunos animales produce una respuesta antiviral. Tanto en Drosophila juvenil como adulta , el RNAi es importante en la inmunidad innata antiviral y es activo contra patógenos como el virus X de Drosophila . ^{[83] [84]} Un papel similar en la inmunidad puede operar en C. elegans , ya que las proteínas Argonaute se regulan positivamente en respuesta a virus y gusanos que sobreexpresan componentes de la vía RNAi son resistentes a la infección viral. ^{[85] [86]}

El papel del ARNi en la inmunidad innata de los mamíferos es poco conocido y hay relativamente pocos datos disponibles. Sin embargo, la existencia de virus que codifican genes capaces de suprimir la respuesta del ARNi en células de mamíferos puede ser una evidencia a favor de una respuesta inmune de los mamíferos dependiente del ARNi, ^{[87] [88]} aunque esta hipótesis ha sido cuestionada por estar poco fundamentada. ^[89] Se han presentado evidencias de la existencia de una vía antiviral funcional del ARNi en células de mamíferos. ^{[90] [91]}

También existen otras funciones del ARNi en virus de mamíferos, como los miRNA expresados ​​por el virus del herpes que pueden actuar como desencadenantes de la organización de la heterocromatina para mediar la latencia viral. ^[92]

Los miRNA expresados ​​endógenamente, incluyendo tanto los miRNA intrónicos como los intergénicos , son más importantes en la represión traduccional ^[65] y en la regulación del desarrollo, especialmente en el momento de la morfogénesis y el mantenimiento de tipos de células indiferenciadas o incompletamente diferenciadas como las células madre . ^[93] El papel de los miRNA expresados ​​endógenamente en la regulación negativa de la expresión génica se describió por primera vez en C. elegans en 1993. ^[94] En las plantas, esta función se descubrió cuando se demostró que el "microRNA JAW" de Arabidopsis estaba involucrado en la regulación de varios genes que controlan la forma de la planta. ^[95] En las plantas, la mayoría de los genes regulados por los miRNA son factores de transcripción ; ^[96] por lo tanto, la actividad de los miRNA es particularmente amplia y regula redes genéticas completas durante el desarrollo modulando la expresión de genes reguladores clave, incluyendo factores de transcripción así como proteínas F-box . ^[97] En muchos organismos, incluyendo los humanos, los miRNA están vinculados a la formación de tumores y la desregulación del ciclo celular . Aquí, los miRNA pueden funcionar como oncogenes y supresores de tumores . ^[98]

Con base en un análisis filogenético basado en la parsimonia , el ancestro común más reciente de todos los eucariotas probablemente ya poseía una vía temprana de RNAi; se piensa que la ausencia de la vía en ciertos eucariotas es una característica derivada. ^[99] Este sistema ancestral de RNAi probablemente contenía al menos una proteína similar a Dicer, una Argonauta, una proteína PIWI y una ARN polimerasa dependiente de ARN que también puede haber desempeñado otras funciones celulares. Un estudio de genómica comparativa a gran escala indica asimismo que el grupo corona eucariota ya poseía estos componentes, que pueden haber tenido entonces asociaciones funcionales más estrechas con sistemas generalizados de degradación de ARN como el exosoma . ^[100] Este estudio también sugiere que la familia de proteínas Argonauta de unión al ARN, que comparten los eucariotas, la mayoría de las arqueas y al menos algunas bacterias (como Aquifex aeolicus ), es homóloga y evolucionó originalmente a partir de componentes del sistema de iniciación de la traducción .

La desactivación de genes es un método utilizado para reducir la expresión de genes específicos de un organismo. Esto se logra mediante el proceso natural de RNAi. ^[6] Esta técnica de desactivación de genes utiliza una molécula de ARNi de doble cadena que se sintetiza con una secuencia complementaria al gen de interés. La cascada de RNAi comienza una vez que la enzima Dicer comienza a procesar el ARNi. El resultado final del proceso conduce a la degradación del ARNm y destruye cualquier instrucción necesaria para construir ciertas proteínas. Con este método, los investigadores pueden disminuir (pero no eliminar por completo) la expresión de un gen objetivo. El estudio de los efectos de esta disminución en la expresión puede mostrar el papel fisiológico o el impacto de los productos del gen objetivo. ^{[101] [102]}

Se han hecho grandes esfuerzos en biología computacional para diseñar reactivos de dsRNA exitosos que maximicen la eliminación de genes pero minimicen los efectos "fuera de objetivo". Los efectos fuera de objetivo surgen cuando un ARN introducido tiene una secuencia de bases que puede emparejarse con múltiples genes y, por lo tanto, reducir la expresión de estos. Dichos problemas ocurren con mayor frecuencia cuando el dsRNA contiene secuencias repetitivas. Se ha estimado a partir del estudio de los genomas de humanos, C. elegans y S. pombe que aproximadamente el 10% de los posibles siRNA tienen importantes efectos fuera de objetivo. ^[10] Se han desarrollado una multitud de herramientas de software que implementan algoritmos para el diseño de siRNA generales ^{[103] [104]} específicos de mamíferos, ^[105] y específicos de virus ^[106] que se verifican automáticamente para detectar una posible reactividad cruzada.

Dependiendo del organismo y del sistema experimental, el ARN exógeno puede ser una cadena larga diseñada para ser escindida por Dicer, o ARN cortos diseñados para servir como sustratos de ARNi . En la mayoría de las células de mamíferos, se utilizan ARN más cortos porque las moléculas de ARN bicatenario largo inducen la respuesta de interferón de mamíferos , una forma de inmunidad innata que reacciona de manera no específica al material genético extraño. ^[107] Los ovocitos de ratón y las células de embriones de ratón tempranos carecen de esta reacción al ARNbc exógeno y, por lo tanto, son un sistema modelo común para estudiar los efectos de la eliminación de genes de mamíferos. ^[108] También se han desarrollado técnicas de laboratorio especializadas para mejorar la utilidad del ARNi en sistemas de mamíferos al evitar la introducción directa de ARNi , por ejemplo, mediante la transfección estable con un plásmido que codifica la secuencia apropiada a partir de la cual se pueden transcribir los ARNi , ^[109] o mediante sistemas de vectores lentivirales más elaborados que permiten la activación o desactivación inducible de la transcripción, conocida como ARNi condicional . ^{[110] [111]}

La técnica de inactivación de genes mediante terapias de ARNi ha demostrado ser exitosa en estudios clínicos controlados aleatorizados. Estos medicamentos son una clase creciente de fármacos basados ​​en ARNi que disminuyen la expresión de proteínas codificadas por ciertos genes. Hasta la fecha, las autoridades regulatorias de los EE. UU. y Europa han aprobado cinco medicamentos de ARNi: patisiran (2018), givosiran (2019), lumasiran (2020), inclisiran (2020 en Europa con aprobación prevista en los EE. UU. en 2021) y vutrisiran (2022). ^{[112] [113] [114] [115]}

Si bien todas las terapias de ARNi aprobadas por los organismos reguladores actuales se centran en enfermedades que se originan en el hígado, otros medicamentos bajo investigación apuntan a una serie de áreas de enfermedades que incluyen enfermedades cardiovasculares, trastornos hemorrágicos, trastornos por consumo de alcohol, fibrosis quística, gota, carcinoma y trastornos oculares.

Patisiran es el primer medicamento basado en ARNi de doble cadena aprobado en 2018 y desarrollado por Alnylam Pharmaceuticals . Patisiran utiliza la cascada de ARNi para suprimir el gen que codifica para TTR (transtiretina). Las mutaciones en este gen pueden causar el plegamiento incorrecto de una proteína responsable de la amiloidosis ATTR hereditaria . Para lograr una respuesta terapéutica, patisiran está envuelto por una membrana de nanopartículas lipídicas que facilita el cruce hacia el citoplasma. Una vez dentro de la célula, el ARNi comienza a procesarse por la enzima Dicer. Patisiran es administrado por un profesional de la salud a través de una infusión intravenosa con una dosis basada en el peso corporal. Las advertencias y precauciones incluyen el riesgo de reacciones relacionadas con la infusión y niveles reducidos de vitamina A (suero). ^[116]

En 2019, la FDA y la EMA aprobaron givosiran para el tratamiento de adultos con porfiria hepática aguda (AHP). ^[117] La ​​FDA también otorgó a givosiran una designación de terapia innovadora , designación de revisión prioritaria y designación de medicamento huérfano para el tratamiento de la porfiria hepática aguda (AHP) en noviembre de 2019. ^[118] Para 2020, givosiran recibió la aprobación de la EMA. ^[119] Givosiran es un ARNi que descompone el ARNm de la sintasa del ácido aminolevulínico 1 (ALAS1) en el hígado. La descomposición del ARNm de ALAS1 evita que se acumulen toxinas (responsables de los ataques neuroviscerales y la enfermedad de AHP) como el ácido aminolevulínico (ALA) y el porfobilinógeno (PBG). ^{[120] [121] [122] [123]} Para facilitar la entrada al citoplasma, givosiran utiliza ligandos GalNAc y entra en las células del hígado. El medicamento se administra por vía subcutánea por un profesional sanitario y la dosis se establece en función del peso corporal. Las advertencias y precauciones incluyen el riesgo de reacciones anafilácticas, toxicidad hepática, toxicidad renal y reacciones en el lugar de la inyección. ^[124]

Lumasiran fue aprobado como un medicamento basado en ARNi en 2020 para su uso tanto en la Unión Europea como en los Estados Unidos. ^{[125] [126]} Este medicamento se utiliza para el tratamiento de la hiperoxaluria primaria tipo 1 (PH1) en poblaciones pediátricas y adultas. El fármaco está diseñado para reducir la producción de oxalato hepático y los niveles de oxalato urinario a través de RNAi al dirigirse al ARNm de la hidroxiácido oxidasa 1 (HAO1) ​​para su descomposición. La reducción de los niveles de la enzima HAO1 reduce la oxidación del glicolato a glioxilato (que es un sustrato para el oxalato). Lumasiran es administrado por vía subcutánea por un profesional de la salud con una dosis basada en el peso corporal. ^[127] Los datos de ensayos clínicos controlados aleatorizados indican que la reacción adversa más común que se notificó fueron reacciones en el lugar de la inyección. Estas reacciones fueron leves y estuvieron presentes en el 38 por ciento de los pacientes tratados con lumasiran. ^[128]

En 2022, la FDA y la EMA aprobaron el vutrisiran para el tratamiento de adultos con amiloidosis hereditaria mediada por transtiretina con polineuropatía en estadio 1 o 2. ^{[129] [130]} El vutrisiran está diseñado para descomponer el ARNm que codifica la transtiretina .

Otros fármacos en investigación que utilizan el ARNip están siendo desarrollados por compañías farmacéuticas como Arrowhead Pharmaceuticals , Dicerna, Alnylam Pharmaceuticals , Amgen y Sylentis. Estos medicamentos cubren una variedad de objetivos a través del ARNip y enfermedades.

Terapias de ARNi en investigación en desarrollo:

En la actualidad, tanto los miRNA como los siRNA se sintetizan químicamente y, por lo tanto, están legalmente clasificados dentro de la UE y en los EE. UU. como medicamentos "simples". Pero como los siRNA de bioingeniería (BERA) están en desarrollo, se clasificarían como medicamentos biológicos, al menos en la UE. El desarrollo de la tecnología de los BERA plantea la cuestión de la categorización de los medicamentos que tienen el mismo mecanismo de acción pero se producen química o biológicamente. Esta falta de coherencia debería abordarse. ^[131]

Para lograr el potencial clínico del ARNi, el ARNi debe transportarse de manera eficiente a las células de los tejidos objetivo. Sin embargo, hay varias barreras que deben solucionarse antes de que pueda usarse clínicamente. Por ejemplo, el ARNi "desnudo" es susceptible a varios obstáculos que reducen su eficacia terapéutica. ^[132] Además, una vez que el ARNi ha ingresado al torrente sanguíneo, el ARN desnudo puede degradarse por nucleasas séricas y puede estimular el sistema inmunológico innato. ^[132] Debido a su tamaño y naturaleza altamente polianiónica (que contiene cargas negativas en varios sitios), las moléculas de ARNi no modificadas no pueden ingresar fácilmente a las células a través de la membrana celular. Por lo tanto, se debe utilizar ARNi artificial o encapsulado en nanopartículas . Si el ARNi se transfiere a través de la membrana celular, pueden ocurrir toxicidades no deseadas si las dosis terapéuticas no se optimizan, y los ARNi pueden exhibir efectos fuera del objetivo (por ejemplo, regulación negativa no deseada de genes con complementariedad de secuencia parcial ). ^[133] Incluso después de ingresar a las células, se requiere una dosificación repetida ya que sus efectos se diluyen en cada división celular. En respuesta a estos posibles problemas y barreras, dos enfoques ayudan a facilitar la entrega de ARNi a las células objetivo: nanopartículas lipídicas y conjugados. ^[134]

Las nanopartículas lipídicas (LNP) se basan en estructuras similares a liposomas que generalmente están hechas de un centro acuoso rodeado por una capa lipídica. ^[135] Un subconjunto de estructuras liposomales utilizadas para administrar medicamentos a los tejidos descansan en vesículas unilamelares grandes (LUV) que pueden tener un tamaño de 100 nm. Los mecanismos de administración de LNP se han convertido en una fuente cada vez mayor de ácidos nucleicos envolventes y pueden incluir plásmidos , CRISPR y ARNm . ^[136]

El primer uso aprobado de nanopartículas lipídicas como mecanismo de administración de fármacos comenzó en 2018 con el fármaco de ARNi patisiran, desarrollado por Alnylam Pharmaceuticals. Dicerna Pharmaceuticals, Persomics , Sanofi y Sirna Therapeutics también trabajaron para llevar terapias de ARNi al mercado. ^{[137] [138]}

Otras aplicaciones recientes incluyen dos vacunas contra la COVID-19 aprobadas por la FDA: mRNA-1273, desarrollada por Moderna y BNT162b , desarrollada por una colaboración entre Pfizer y BioNtech . ^[139] Estas dos vacunas utilizan nanopartículas lipídicas para administrar el ARNm del antígeno. Encapsular la molécula de ARNm en nanopartículas lipídicas fue un avance fundamental para producir vacunas de ARNm viables, resolviendo una serie de barreras técnicas clave en la administración de la molécula de ARNm a la célula huésped, distribuida a través de la apolipoproteína E (apoE) en el receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR). En diciembre de 2020, Novartis anunció que los resultados positivos de los estudios de eficacia de fase III consideraron que el inclisirán era un tratamiento para la hipercolesterolemia familiar heterocigótica (HeFH) y la enfermedad cardiovascular aterosclerótica (ASCVD). ^[140]

Además de los LNP, las terapias de ARNi se han dirigido a la administración a través de conjugados de ARNi (por ejemplo, GalNAc, carbohidratos, péptidos, aptámeros, anticuerpos). ^[141] Se han desarrollado terapias que utilizan conjugados de ARNi para enfermedades raras o genéticas como la porfiria hepática aguda (AHP), la hemofilia , la hiperoxaluria primaria (PH) y la amiloidosis ATTR hereditaria , así como otras enfermedades cardiometabólicas como la hipertensión y la esteatohepatitis no alcohólica (NASH). ^[142]

El ARNi se ha utilizado para una variedad de otras aplicaciones, incluidos alimentos, cultivos e insecticidas. El uso de la vía del ARNi ha desarrollado numerosos productos, como alimentos como manzanas árticas , tabaco sin nicotina, café descafeinado, vegetación fortificada con nutrientes y cultivos hipoalergénicos. ^{[143] [144] [145]} El uso emergente del ARNi tiene el potencial de desarrollar muchos otros productos para uso futuro.

El tratamiento antiviral es una de las primeras aplicaciones médicas basadas en RNAi propuestas, y se han desarrollado dos tipos diferentes. El primer tipo es para dirigirse a los ARN virales. Muchos estudios han demostrado que dirigirse a los ARN virales puede suprimir la replicación de numerosos virus, incluidos el VIH , ^[146] VPH , ^[147] hepatitis A , ^[148] hepatitis B , ^[149] virus de la influenza , ^{[150] [151] [152] [153]} virus respiratorio sincitial (VSR), ^[153] coronavirus del SARS (SARS-CoV), ^[153] adenovirus ^[153] y virus del sarampión . ^[154] La otra estrategia es bloquear las entradas virales iniciales dirigiéndose a los genes de la célula huésped. ^[155] Por ejemplo, la supresión de los receptores de quimiocinas ( CXCR4 y CCR5 ) en las células huésped puede prevenir la entrada viral del VIH. ^[156]

Si bien la quimioterapia tradicional puede matar eficazmente las células cancerosas, la falta de especificidad para discriminar entre células normales y cancerosas en estos tratamientos suele causar efectos secundarios graves. Numerosos estudios han demostrado que el ARNi puede proporcionar un enfoque más específico para inhibir el crecimiento tumoral al dirigirse a los genes relacionados con el cáncer (es decir, el oncogén ). ^[157] También se ha propuesto que el ARNi puede mejorar la sensibilidad de las células cancerosas a los agentes quimioterapéuticos , lo que proporciona un enfoque terapéutico combinatorio con la quimioterapia. ^[158] Otro posible tratamiento basado en el ARNi es inhibir la invasión y la migración celular . ^[159]

En comparación con la quimioterapia u otros fármacos contra el cáncer, los fármacos de ARNi tienen muchas ventajas. ^[160] El ARNi actúa en la etapa postranscripcional de la expresión génica, por lo que no modifica ni cambia el ADN de forma perjudicial. ^[160] El ARNi también se puede utilizar para producir una respuesta específica de una determinada manera, como por ejemplo reduciendo la supresión de la expresión génica. ^[160] En una sola célula cancerosa, el ARNi puede provocar una supresión drástica de la expresión génica con solo unas pocas copias. ^[160] Esto sucede silenciando los genes que promueven el cáncer con ARNi, así como dirigiéndose a una secuencia de ARNm. ^[160]

Los fármacos de ARNi tratan el cáncer silenciando ciertos genes que lo promueven. ^[160] Esto se hace complementando los genes del cáncer con el ARNi, por ejemplo, manteniendo las secuencias de ARNm de acuerdo con el fármaco de ARNi. ^[160] Lo ideal sería inyectar o modificar químicamente el ARNi para que pueda llegar a las células cancerosas de manera más eficiente. ^[160] La captación y regulación del ARNi está controlada por los riñones. ^[160]

Las estrategias de RNAi también muestran potencial para tratar enfermedades neurodegenerativas . Estudios en células y en ratones han demostrado que la focalización específica en genes productores de beta amiloide (por ejemplo, BACE1 y APP) mediante RNAi puede reducir significativamente la cantidad de péptido Aβ que se correlaciona con la causa de la enfermedad de Alzheimer . ^{[161] [162] [163]} Además, estos enfoques basados ​​en el silenciamiento también proporcionan resultados prometedores en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Poliglutamina . ^{[164] [165] [166]}

El sistema inmunológico humano se divide en dos ramas separadas: el sistema inmunológico innato y el sistema inmunológico adaptativo. ^[167] El sistema inmunológico innato es la primera defensa contra las infecciones y responde a los patógenos de manera genérica. ^[167] Por otro lado, el sistema inmunológico adaptativo, un sistema que se desarrolló más tarde que el innato, está compuesto principalmente por células B y T altamente especializadas que están entrenadas para reaccionar a porciones específicas de moléculas patógenas. ^[167]

El desafío entre los patógenos antiguos y los nuevos ha ayudado a crear un sistema de células y partículas protegidas que se denominan marco seguro. ^[167] Este marco ha proporcionado a los humanos un ejército de sistemas que buscan y destruyen partículas invasoras, como patógenos, organismos microscópicos, parásitos e infecciones. ^[167] El marco seguro de los mamíferos se ha desarrollado para incorporar ARNi como una herramienta para indicar la contaminación viral, lo que ha permitido que el ARNi cree una intensa respuesta inmune innata. ^[167]

El ARNi está controlado por el sistema inmunológico innato, que puede dividirse en respuestas inflamatorias agudas y respuestas antivirales. ^[167] La ​​respuesta inflamatoria se crea con señales de pequeñas moléculas de señalización o citocinas. ^[167] Estas incluyen interleucina-1 (IL-1), interleucina-6 (IL-6), interleucina-12 (IL-12) y factor de necrosis tumoral α (TNF-α). ^[167] El sistema inmunológico innato genera inflamación y respuestas antivirales, que causan la liberación de receptores de reconocimiento de patrones (PRR). ^[167] Estos receptores ayudan a etiquetar qué patógenos son virus, hongos o bacterias. ^[167] Además, la importancia del ARNi y el sistema inmunológico innato es incluir más PRR para ayudar a reconocer diferentes estructuras de ARN. ^[167] Esto hace que sea más probable que el ARNi cause una respuesta inmunoestimulante en caso de que aparezca el patógeno. ^[167]

La RNAi se ha utilizado para modificar genéticamente plantas con el fin de que produzcan niveles más bajos de toxinas vegetales naturales. Estas técnicas aprovechan el fenotipo estable y hereditario de la RNAi en las plantas. Las semillas de algodón son ricas en proteínas dietéticas , pero contienen de forma natural el producto terpenoide tóxico gosipol , lo que las hace inadecuadas para el consumo humano. La RNAi se ha utilizado para producir plantas de algodón cuyas semillas contienen niveles reducidos de delta-cadineno sintasa , una enzima clave en la producción de gosipol, sin afectar la producción de la enzima en otras partes de la planta, donde el gosipol es en sí mismo importante para prevenir daños causados ​​por plagas de plantas. ^[168]

Los esfuerzos de desarrollo han reducido con éxito los niveles de alérgenos en las plantas de tomate ^[169] y la fortificación de plantas como los tomates con antioxidantes dietéticos . ^[170] El silenciamiento de la alfa-amilasa mediante ARNi también se ha utilizado para disminuir el crecimiento del hongo Aspergillus flavus en el maíz, que de otro modo habría contaminado los granos con aflatoxinas peligrosas . ^[171] El silenciamiento de la sintasa del factor lacrimógeno en las cebollas ha producido cebollas sin lágrimas y se ha utilizado ARNi en los genes BP1 de las semillas de colza para mejorar la fotosíntesis. ^[172] Los genes SBEIIa y SBEIIb del trigo se han utilizado en el trigo para producir niveles más altos de amilosa con el fin de mejorar la función intestinal, ^[173] y Travella et al. En 2006 se empleó RNAi para la genómica funcional en una investigación de razas de trigo hexaploide , mientras que Scofield et al. utilizaron el silenciamiento génico inducido por virus (VIGS, un subtipo de RNAi) en 2005 para investigar el mecanismo de resistencia proporcionado por Lr21 contra la roya de la hoja del trigo en el trigo hexaploide . ^[174]

El RNAi se está desarrollando como insecticida y se emplean múltiples enfoques, entre ellos la ingeniería genética y la aplicación tópica. ^[4] Las células del intestino medio de algunos insectos absorben las moléculas de dsRNA en un proceso conocido como RNAi ambiental. ^[175] En algunos insectos, el efecto es sistémico, ya que la señal se propaga por todo el cuerpo del insecto (lo que se conoce como RNAi sistémico). ^[176]

Los animales expuestos al ARNi en dosis millones de veces superiores a los niveles previstos de exposición humana no muestran efectos adversos. ^[177] El ARNi tiene efectos variables en diferentes especies de lepidópteros (mariposas y polillas). ^[178]

Drosophila spp., Bombyx mori , Locusta spp., Spodoptera spp., Tribolium castaneum , Nilaparvata lugens , Helicoverpa armigera y Apis mellifera son modelos que se han utilizado ampliamente para aprender cómo funciona el RNAi dentro de taxones particulares de insectos. Musca domestica tiene dosgenes Ago2 y Glossina morsitans tres, como encontraron Lewis et al. 2016 y Hain et al. 2010. ^{[179] [180]} En el caso de lavía miRNA, Diuraphis noxia tiene dos Ago1 , M. domestica dos Dcr1 , Acyrthosiphon pisum dos de Ago1 y Loqs y Dcr1 y cuatro de Pasha . Mientras que en el piRNA , G. morsitans y A. pisum tienen dos o tres Ago3 cada uno. ^[180] Esto ha llevado a la identificación de futurosobjetivos de desarrollo de insecticidas , y los modos de acción y las razones de la resistencia de otros insecticidas a los insecticidas. ^[180]

Se han creado cultivos transgénicos para expresar ARN de doble cadena, cuidadosamente seleccionados para silenciar genes cruciales en las plagas objetivo. Estos ARN de doble cadena están diseñados para afectar solo a los insectos que expresan secuencias genéticas específicas. Como prueba de principio , en 2009 un estudio mostró ARN que podrían matar a cualquiera de las cuatro especies de moscas de la fruta sin dañar a las otras tres. ^[4]

Otra posibilidad es suministrar dsRNA sin ingeniería genética. Una de ellas consiste en añadirlos al agua de riego . Las moléculas son absorbidas por el sistema vascular de las plantas y envenenan a los insectos que se alimentan de ellas. Otra posibilidad consiste en rociar dsRNA como un pesticida convencional. Esto permitiría una adaptación más rápida a la resistencia. Tales métodos requerirían fuentes de dsRNA de bajo coste que actualmente no existen. ^[4]

Los enfoques para el diseño de bibliotecas de ARNi de todo el genoma pueden requerir más sofisticación que el diseño de un solo ARNi para un conjunto definido de condiciones experimentales. Las redes neuronales artificiales se utilizan con frecuencia para diseñar bibliotecas de ARNi ^[181] y para predecir su probable eficiencia en la eliminación de genes. ^[182] El cribado genómico masivo se considera ampliamente como un método prometedor para la anotación del genoma y ha desencadenado el desarrollo de métodos de cribado de alto rendimiento basados ​​en microarreglos . ^{[183] ​​[184]}

La investigación de la interferencia del ARN a escala del genoma se basa en la tecnología de cribado de alto rendimiento (HTS, por sus siglas en inglés). La tecnología HTS de la interferencia del ARN permite el cribado de pérdida de función en todo el genoma y se utiliza ampliamente en la identificación de genes asociados con fenotipos específicos. Esta tecnología ha sido aclamada como una posible segunda ola genómica, después de la primera ola genómica de plataformas de descubrimiento de polimorfismos de nucleótidos únicos y microarrays de expresión génica . ^[185] Una de las principales ventajas del cribado de la interferencia del ARN a escala del genoma es su capacidad de interrogar simultáneamente miles de genes. Con la capacidad de generar una gran cantidad de datos por experimento, el cribado de la interferencia del ARN a escala del genoma ha llevado a una explosión de las tasas de generación de datos. Explotar conjuntos de datos tan grandes es un desafío fundamental, que requiere métodos estadísticos/bioinformáticos adecuados. El proceso básico del cribado de la interferencia del ARN basado en células incluye la elección de una biblioteca de interferencia del ARN, tipos de células robustos y estables, transfección con agentes de interferencia del ARN, tratamiento/incubación, detección de señales, análisis e identificación de genes importantes o dianas terapéuticas. ^[186]

El proceso de RNAi se denominó "co-supresión" y "supresión" cuando se observó antes del conocimiento de un mecanismo relacionado con el ARN. El descubrimiento de RNAi fue precedido primero por observaciones de inhibición transcripcional por ARN antisentido expresado en plantas transgénicas , ^[188] y más directamente por informes de resultados inesperados en experimentos realizados por científicos de plantas en los Estados Unidos y los Países Bajos a principios de la década de 1990. ^[189] En un intento de alterar los colores de las flores en petunias , los investigadores introdujeron copias adicionales de un gen que codifica la chalcona sintasa , una enzima clave para la pigmentación de las flores en plantas de petunias de color de flor normalmente rosa o violeta. Se esperaba que el gen sobreexpresado diera como resultado flores más oscuras, pero en cambio causó que algunas flores tuvieran pigmento púrpura menos visible, a veces en patrones abigarrados, lo que indica que la actividad de la chalcona sintasa había disminuido sustancialmente o se había suprimido de una manera específica del contexto. Esto se explicaría más tarde como el resultado de la inserción del transgén adyacente a los promotores en la dirección opuesta en varias posiciones a lo largo de los genomas de algunos transformantes, lo que conduce a la expresión de transcripciones antisentido y al silenciamiento de genes cuando estos promotores están activos. ^{[ cita requerida ]} Otra observación temprana de RNAi provino de un estudio del hongo Neurospora crassa , ^[190] aunque no se reconoció inmediatamente como relacionado. Una investigación adicional del fenómeno en plantas indicó que la regulación negativa se debía a la inhibición postranscripcional de la expresión génica a través de una mayor tasa de degradación del ARNm. ^[191] Este fenómeno se denominó cosupresión de la expresión génica , pero el mecanismo molecular siguió siendo desconocido. ^[192]

Poco tiempo después, los virólogos de plantas que trabajaban en mejorar la resistencia de las plantas a las enfermedades virales observaron un fenómeno inesperado similar. Si bien se sabía que las plantas que expresaban proteínas específicas de virus mostraban una mayor tolerancia o resistencia a la infección viral, no se esperaba que las plantas que solo portaban regiones cortas y no codificantes de secuencias de ARN viral mostraran niveles similares de protección. Los investigadores creían que el ARN viral producido por transgenes también podría inhibir la replicación viral. ^[193] El experimento inverso, en el que se introdujeron secuencias cortas de genes de plantas en virus, mostró que el gen objetivo se suprimía en una planta infectada. ^[194] Este fenómeno se denominó "silenciamiento génico inducido por virus" (VIGS), ^[174] y el conjunto de tales fenómenos se denominó colectivamente silenciamiento génico postranscripcional. ^[195]

Después de estas observaciones iniciales en plantas, los laboratorios buscaron este fenómeno en otros organismos. ^{[196] [197]} El primer caso de silenciamiento de ARN en animales se documentó en 1996, cuando Guo y Kemphues observaron que, al introducir ARN sentido y antisentido en el ARNm par-1 en Caenorhabditis elegans , se producía la degradación del mensaje par-1. ^[198] Se pensaba que esta degradación era provocada por el ARN monocatenario (ssRNA), pero dos años más tarde, en 1998, Fire y Mello descubrieron que esta capacidad de silenciar la expresión del gen par-1 era en realidad provocada por el ARN bicatenario (dsRNA). ^[198] El artículo de 1998 de Craig C. Mello y Andrew Fire en Nature informó de un potente efecto de silenciamiento genético tras inyectar ARN bicatenario en C. elegans . ^[199] Al investigar la regulación de la producción de proteínas musculares, observaron que ni las inyecciones de ARNm ni de ARN antisentido tenían efecto sobre la producción de proteínas, pero el ARN bicatenario silenciaba con éxito el gen objetivo. Como resultado de este trabajo, acuñaron el término RNAi . Este descubrimiento representó la primera identificación del agente causal del fenómeno. Fire y Mello recibieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 2006. ^{[6] [200]}

Justo después del descubrimiento revolucionario de Fire y Mello, Elbashir et al. descubrieron que, al utilizar ARN interferente pequeño (siRNA) fabricado sintéticamente, era posible silenciar secuencias específicas de un gen, en lugar de silenciar el gen entero. ^[201] Solo un año después, McCaffrey y sus colegas demostraron que este silenciamiento específico de secuencia tenía aplicaciones terapéuticas al apuntar a una secuencia del virus de la hepatitis C en ratones transgénicos . ^[202] Desde entonces, varios investigadores han estado intentando expandir las aplicaciones terapéuticas del RNAi, buscando específicamente apuntar a genes que causan varios tipos de cáncer . ^{[203] [204]} En 2006, las primeras aplicaciones que llegaron a los ensayos clínicos fueron en el tratamiento de la degeneración macular y el virus respiratorio sincitial . ^[205] Cuatro años más tarde se inició el primer ensayo clínico de fase I en humanos, utilizando un sistema de administración de nanopartículas para apuntar a tumores sólidos . ^[206]

La FDA aprobó el primer fármaco basado en ARNi ( patisiran ) en 2018. Givosiran y lumasiran obtuvieron posteriormente la aprobación de la FDA para el tratamiento de AHP y PH1 en 2019 y 2020, respectivamente. ^[112] Inclisiran recibió la aprobación de la EMA en 2020 para el tratamiento del colesterol alto y actualmente está bajo revisión por parte de la FDA. ^[207]

• Interferencia de ARN dirigida por ADN