Catecol oxidasa
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Catecol oxidasa
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N.º CE1.10.3.1
N.º CAS9002-10-2
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Instituto Nacional de BiologíaProteínas

La catecol oxidasa es una oxidasa de cobre que contiene un cofactor de di-cobre tipo 3 y cataliza la oxidación de orto- difenoles en orto- quinonas acoplada con la reducción de oxígeno molecular a agua. Está presente en una variedad de especies de plantas y hongos, incluyendo Ipomoea batatas ( batata ) [1] y Camellia sinensis (hoja de té de la India). [2] Las metaloenzimas con centros de cobre tipo 3 se caracterizan por su capacidad de unirse reversiblemente al dioxígeno en condiciones ambientales. [3] En las plantas, la catecol oxidasa juega un papel clave en el pardeamiento enzimático al catalizar la oxidación de catecol a o-quinona en presencia de oxígeno, que puede polimerizar rápidamente para formar la melanina que otorga a las frutas dañadas su coloración marrón oscura.

Función biológica

Reacción global catalizada por la catecol oxidasa: producción de dos o-quinonas y 2 moléculas de agua a partir de dos moléculas de catecol y una molécula de dioxígeno.

Las polifenol oxidasas son una familia de metaloenzimas de di-cobre que incluyen la tirosinasa y la catecol oxidasa. [4] En las plantas, ambas enzimas pueden catalizar la oxidación de sustratos orto-difenoles en sus orto-quinonas correspondientes. La diferencia clave entre las dos enzimas relacionadas es que la tirosinasa puede catalizar la hidroxilación de monofenoles a difenoles (actividad monofenolasa) así como la oxidación del o-difenol a la o-quinona (actividad difenolasa), mientras que la catecol oxidasa solo posee actividad difenolasa. [5]

Cuando el tejido vegetal se daña, el cloroplasto puede romperse y liberar catecol oxidasa en el citoplasma de la planta, y las vacuolas también pueden romperse, liberando la catecol almacenada en el citoplasma. El daño tisular también permite que el oxígeno penetre en la célula. Por lo tanto, el daño tisular facilita la interacción de la catecol oxidasa con su sustrato para producir o-benzoquinona, que puede polimerizarse de forma no enzimática para producir melaninas que forman una barrera insoluble para la protección de las heridas. [6]

Procesamiento proteolítico

La catecol oxidasa está codificada en el núcleo y su extremo N-terminal contiene un péptido señal que dirige la proteína al lumen del tilacoide del cloroplasto, donde puede ser soluble o estar asociada de forma vaga con la membrana del tilacoide. [7] Inicialmente transcrito como una proenzima , el precursor de la catecol oxidasa se somete a dos rondas de procesamiento proteolítico y transporte antes de entrar en el lumen del tilacoide.

Utilizando una proteína precursora marcada con [ 35S ] metionina, Sommer et al. dilucidaron una vía de procesamiento proteolítico común a una variedad de plantas, incluyendo el guisante ( Pisum sativum ), el tomate ( Lycopersicon esculentum ) y el maíz ( Zea mays ). [8] El precursor de 67 kD se importó al estroma de una manera dependiente de ATP donde una peptidasa estromal procesa el precursor en un intermedio de 62 kD. La translocación de este intermedio en el lumen del tilacoide fue dependiente de la luz y da como resultado la generación de la enzima madura de 59 kD. [9] Con base en el análisis del precursor y la catecol oxidasa madura purificada de Ipomoea batatas , el procesamiento proteolítico elimina tanto el péptido de tránsito N-terminal como un dominio C-terminal que cubre el sitio activo de la enzima. [10]

Estructura de la enzima

El sitio activo del di-cobre de la catecol oxidasa reducida (Cu(I)-Cu(I)) y nativa (Cu(II)-Cu(II)) de la estructura cristalina de Ipomoea batata (batata) (PDB: 1BT1, 1BT2).

La estructura cristalina de la catecol oxidasa purificada de Ipomoea batatas se ha resuelto en su forma activa tanto en el estado oxidado Cu(II)-Cu(II) como en el estado reducido Cu(I)-Cu(I). [11] Es una enzima monomérica globular de dominio único que tiene un tamaño aproximado de 55 por 45 por 45 Å y forma elipsoide. Un haz de cuatro hélices α comprende el núcleo de la enzima, que rodea el sitio activo que contiene el centro dicopper. [12] Los nitrógenos en las cadenas laterales de imidazol de His 88, His 109 e His 118 se coordinan con el primer cobre catalítico, mientras que los nitrógenos en las cadenas laterales de imidazol en His240, His244 e His274 se coordinan con el segundo ion de cobre catalítico. En el estado oxidado Cu(II)-Cu(II), cada ion de cobre posee una geometría piramidal trigonal de cuatro coordenadas, con los tres residuos de histidina y una molécula de hidróxido puente formando los cuatro ligandos en cada ion de cobre. Al comparar el estado reducido (Cu(I)-Cu(I)) con el estado nativo (Cu(II)-Cu(II)) de la enzima, la diferencia clave es la distancia entre los dos centros de cobre. En el estado oxidado Cu(II)-Cu(II), la distancia Cu-Cu es de 3,3 Å, mientras que en el estado reducido Cu(I)-Cu(I), la distancia aumenta a 4,4 Å. [1]

Si bien el sitio activo de la tirosinasa y la catecol oxidasa contiene el centro de di-cobre, las variaciones en la estructura respectiva de cada enzima dan como resultado una actividad diferente. En la catecol oxidasa, una cadena lateral de fenilalanina (Phe261) está por encima de uno de los centros de cobre e impide que el sustrato se coordine con ambos iones de cobre en el sitio activo. Esto impide el complejo de coordinación bidentado necesario para la hidroxilación del di-fenolato característica de la tirosinasa pero ausente en la catecol oxidasa. [13] Además, la His109 unida a uno de los centros de cobre también está unida covalentemente con Cys192 a través de un puente tioéter . [14] Esta reticulación cisteína-histidina puede restringir aún más que el sitio activo de la enzima asuma el complejo de coordinación bidentado que se forma fácilmente en la tirosinasa.

Ciclo y mecanismo catalítico

Ciclo catalítico propuesto de la catecol oxidasa purificada de Ipomoea batata .

Aunque se ha resuelto una estructura cristalina de la catecol oxidasa, quedan preguntas sobre el mecanismo exacto de la reacción. Un mecanismo propuesto por Eicken et al. se basa en la estructura cristalina de la catecol oxidasa purificada de Ipomoea batatas . [11] El ciclo catalítico comienza con la catecol oxidasa en su estado nativo oxidado Cu(II)-Cu(II) con un ion hidróxido coordinado que une los dos centros de cobre. A medida que el catecol ingresa al sitio activo , se abstrae un protón de uno de los alcoholes. El catecol se coordina con un centro Cu(II) de manera monodentada, desplazando uno de los residuos de histidina coordinantes. El ion hidróxido coordinado abstrae otro protón del catecol para formar agua, y el catecol se oxida a o-quinona. Los dos electrones resultantes reducen ambos centros de cobre a su estado Cu(I)-Cu(I). El dioxígeno se une entonces a un centro de cobre, desplazando la molécula de agua coordinada, y otra molécula de catecol se une al otro centro de cobre, desplazando otro residuo de histidina. Esto forma un complejo en el que un centro de cobre tiene una coordinación plana tetragonal con His240, His244 y la molécula de dioxígeno. El otro centro de cobre conserva su geometría piramidal tetragonal inicial con dioxígeno, His88 e His118 en las posiciones ecuatoriales, y His109 en una posición axial. [3] En este estado, el sitio activo de la enzima está en un complejo ternario catecol oxidasa–O 2 2− –catecol. Se transfieren dos electrones del sustrato al dioxígeno, seguido de la escisión del enlace O–O. Se libera agua y se forma el segundo producto o-quinona junto con la restauración del estado inicial Cu(II)-Cu(II) para completar el ciclo catalítico. [15]

Este ciclo catalítico propuesto está respaldado por la observación experimental de que se forman cantidades estequiométricas de o-quinona después de la adición de catecol a la enzima, incluso cuando el dioxígeno está ausente. [15] Además, tanto el estado oxidado Cu(II)-Cu(II) como el estado reducido Cu(I)-Cu(I) fueron los dos estados identificados por la estructura cristalina de Ipomoea batatas . La unión monodentada del catecol al centro de cobre fue respaldada por la estructura cristalina de la catecol oxidasa unida con el inhibidor análogo del sustrato unido feniltiourea , que también se une al centro de cobre de manera monodentada. [11] Sin embargo, un problema con este ciclo catalítico es que la carga del sitio activo cambia durante el ciclo catalítico de +1 a +3. Esto requiere la presencia de bases cercanas que puedan almacenar los protones; sin embargo, la estructura cristalina de rayos X no indica la presencia de ninguna de dichas bases, ya que los residuos de histidina están coordinados con los centros de cobre. [16] Se han propuesto otros ciclos catalíticos dilucidados con cálculos DFT y estructuras cristalinas que mantienen la misma carga en el sitio activo durante todo el ciclo y, por lo tanto, no requieren bases cercanas. [15] [16] Sin embargo, ciertos intermediarios en el ciclo propuesto no son consistentes con los hallazgos experimentales, como que se pueden formar cantidades estequiométricas de o-quinona después de la adición de catecol en ausencia de oxígeno. [16]

Relevancia económica e industrial

La oxidación de los sustratos fenólicos a sus quinonas correspondientes es la causa principal del pardeamiento de frutas y verduras durante la maduración, la manipulación y el procesamiento. [17] El pardeamiento enzimático afecta la calidad nutricional y la apariencia de las frutas y los productos. Se estima que más de la mitad de las pérdidas de fruta ocurren como resultado del pardeamiento enzimático, y los productos tropicales son particularmente vulnerables a esta reacción. [6] La pérdida de nutrientes puede ocurrir debido a la interacción de las quinonas, producidas por la oxidación de difenoles, con las cadenas laterales de aminoácidos esenciales derivados de proteínas vegetales. En particular, los grupos funcionales tiol y amina en las cadenas laterales de aminoácidos son altamente susceptibles a la unión de quinonas y alquilación. [18] El papel clave de la catecol oxidasa en el pardeamiento enzimático la convierte en un objetivo común para la inhibición. Si bien existen varias estrategias inhibidoras, como tratamientos a alta temperatura (70-90 °C) para eliminar la actividad catalítica de la catecol oxidasa, [6] una estrategia popular es disminuir el pH con ácido cítrico . La catecol oxidasa es más activa catalíticamente en el rango de pH 4-8 debido a la coordinación de los residuos de histidina con los centros catalíticos de cobre. El uso de ácidos como el ácido cítrico para disminuir el pH por debajo de este rango óptimo disminuye la unión de la enzima a su sitio activo, el cobre, porque la protonación de los residuos de histidina interfiere con su capacidad de coordinarse con los centros de cobre. [19]

Enzimas artificiales

Los nuevos enfoques para diseñar enzimas artificiales basadas en aminoácidos o péptidos como fracciones moleculares características han llevado a una expansión significativa del campo de las enzimas artificiales o imitadores de enzimas. Resultados recientes del grupo de Rob Liskamp han demostrado que los residuos de histidina andamiados se pueden utilizar como imitadores de ciertas metaloproteínas y β-enzimas. Se ha demostrado el mimetismo estructural de ciertas proteínas de cobre (por ejemplo, hemocianina , tirosinasa y catecol oxidasa), que contienen sitios de unión de cobre de tipo 3. Esta es una mejora significativa ya que el uso de residuos de histidina andamiados es un paso más hacia el mimetismo de enzimas por especies biológicamente relevantes. [20]

Referencias

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