Microbiología de impedancia

La microbiología de impedancia es una técnica microbiológica utilizada para medir la densidad numérica microbiana (principalmente bacterias pero también levaduras ) de una muestra mediante el monitoreo de los parámetros eléctricos del medio de crecimiento . La capacidad del metabolismo microbiano para cambiar la conductividad eléctrica del medio de crecimiento fue descubierta por Stewart ^[1] y estudiada más a fondo por otros científicos como Oker-Blom, ^[2] Parson ^[3] y Allison ^[4] en la primera mitad del siglo XX. Sin embargo, fue solo a fines de la década de 1970 que, gracias a los sistemas controlados por computadora utilizados para monitorear la impedancia , la técnica mostró todo su potencial, como se analiza en los trabajos de Fistenberg-Eden y Eden, ^[5] Ur y Brown ^[6] y Cady. ^[7]

Cuando un par de electrodos se sumergen en el medio de crecimiento, el sistema compuesto de electrodos y electrolito se puede modelar con el circuito eléctrico de la Fig. 1, donde R _m y C _m son la resistencia y la capacitancia del medio a granel, mientras que R _i y C _i son la resistencia y la capacitancia de la interfaz electrodo-electrolito. ^[8] Sin embargo, cuando la frecuencia de la señal de prueba sinusoidal aplicada a los electrodos es relativamente baja (inferior a 1 MHz), la capacitancia a granel C _m se puede descuidar y el sistema se puede modelar con un circuito más simple que consiste solo en una resistencia R _s y una capacitancia C _s en serie. La resistencia R _s explica la conductividad eléctrica del medio a granel, mientras que la capacitancia C _s se debe a la doble capa capacitiva en la interfaz electrodo-electrolito. ^[9] Durante la fase de crecimiento, el metabolismo bacteriano transforma compuestos no cargados o débilmente cargados del medio a granel en compuestos altamente cargados que cambian las propiedades eléctricas del medio. Esto produce una disminución de la resistencia R _s y un aumento de la capacitancia C _s .

En la microbiología de impedancia la técnica funciona de esta manera: la muestra con la concentración bacteriana inicial desconocida (C ₀ ) se coloca a una temperatura que favorece el crecimiento bacteriano (en el rango de 37 a 42 °C si la población microbiana mesófila es el objetivo) y los parámetros eléctricos R _s y C _s se miden a intervalos de tiempo regulares de unos pocos minutos por medio de un par de electrodos en contacto directo con la muestra. ^{[ cita requerida ]}

Hasta que la concentración bacteriana sea inferior a un umbral crítico C _TH, los parámetros eléctricos R _s y C _s permanecen prácticamente constantes (en sus valores de referencia). C _TH depende de diversos parámetros como la geometría del electrodo, la cepa bacteriana, la composición química del medio de crecimiento, etc., pero siempre se encuentra en el rango de 10 ⁶ a 10 ⁷ ufc/ml.

Cuando la concentración bacteriana aumenta por encima de C _TH , los parámetros eléctricos se desvían de sus valores basales (generalmente en el caso de las bacterias hay una disminución de R _s y un aumento de C _s , lo contrario ocurre en el caso de las levaduras).

El tiempo necesario para que los parámetros eléctricos R _s y C _s se desvíen de su valor de referencia se denomina Tiempo de Detección (DT) y es el parámetro utilizado para estimar la concentración bacteriana desconocida inicial C ₀ .

En la Fig. 2 se representa una curva típica de R _s, así como la concentración bacteriana correspondiente en función del tiempo. La Fig. 3 muestra curvas típicas de R _s en función del tiempo para muestras caracterizadas por diferentes concentraciones bacterianas. Dado que DT es el tiempo necesario para que la concentración bacteriana crezca desde el valor inicial C ₀ hasta C _TH , las muestras altamente contaminadas se caracterizan por valores de DT más bajos que las muestras con baja concentración bacteriana. Dado C ₁ , C ₂ y C ₃ la concentración bacteriana de tres muestras con C ₁ > C ₂ > C ₃ , es DT ₁ < DT ₂ < DT ₃ . Los datos de la literatura muestran cómo DT es una función lineal del logaritmo de C ₀ : ^{[10] [11]}

${\displaystyle DT=A\cdot \log _{10}(C_{0})+B}$

donde los parámetros A y B dependen del tipo particular de muestras que se están analizando, las cepas bacterianas, el tipo de medio de enriquecimiento utilizado, etc. Estos parámetros se pueden calcular calibrando el sistema utilizando un conjunto de muestras cuya concentración bacteriana se conoce y calculando la línea de regresión lineal que se utilizará para estimar la concentración bacteriana a partir del DT medido.

La microbiología de impedancia tiene diferentes ventajas sobre la técnica estándar de recuento en placa para medir la concentración bacteriana. Se caracteriza por un tiempo de respuesta más rápido. En el caso de las bacterias mesófilas, el tiempo de respuesta varía de 2 a 3 horas para muestras altamente contaminadas (10 ⁵ - 10 ⁶ ufc/ml) a más de 10 horas para muestras con una concentración bacteriana muy baja (menos de 10 ufc/ml). A modo de comparación, para las mismas cepas bacterianas, la técnica de recuento en placa se caracteriza por tiempos de respuesta de 48 a 72 horas. ^{[ cita requerida ]}

La microbiología de impedancia es un método que puede automatizarse fácilmente e implementarse como parte de una máquina industrial o realizarse como un sensor portátil integrado, mientras que el recuento en placa es un método manual que debe llevarse a cabo en un laboratorio por personal capacitado durante mucho tiempo.

En las últimas décadas se han construido diferentes instrumentos (construidos en laboratorio o disponibles comercialmente) para medir la concentración bacteriana mediante microbiología de impedancia. Uno de los instrumentos más vendidos y aceptados en la industria es el Bactómetro ^[12] de Biomerieux. El instrumento original de 1984 cuenta con un sistema de incubación múltiple capaz de monitorear hasta 512 muestras simultáneamente con la capacidad de establecer 8 temperaturas de incubación diferentes. Otros instrumentos con un rendimiento comparable al Bactómetro son Malthus de Malthus Instruments Ltd (Bury, Reino Unido), ^[13] RABIT de Don Whitley Scientific (Shipley, Reino Unido) ^[14] y Bac Trac de Sy-Lab (Purkensdorf, Austria). ^[15] Recientemente se ha propuesto un sistema integrado portátil para la medición de la concentración microbiana en medios líquidos y semilíquidos mediante microbiología de impedancia. ^{[16] [17]} El sistema está compuesto por una cámara de incubación termorregulada donde se almacena la muestra bajo prueba y un controlador para mediciones de termorregulación e impedancia.

La microbiología de impedancia se ha utilizado ampliamente en las últimas décadas para medir la concentración de bacterias y levaduras en diferentes tipos de muestras, principalmente para el aseguramiento de la calidad en la industria alimentaria. Algunas aplicaciones son la determinación de la vida útil de la leche pasteurizada ^[18] y la medida de la concentración bacteriana total en leche cruda, ^{[19] [20]} verduras congeladas, ^[21] productos de granos, ^[22] productos cárnicos ^[23] y cerveza. ^{[24] [25]} La técnica también se ha utilizado en el monitoreo ambiental para detectar la concentración de coliformes en muestras de agua, así como otros patógenos bacterianos como E. coli presente en cuerpos de agua, ^{[26] [27] [28]} en la industria farmacéutica para probar la eficiencia de nuevos agentes antibacterianos ^[29] y la prueba de productos finales.