Morfolino

Un morfolino , también conocido como oligómero de morfolino y como fosforodiamidato El oligómero de morfolino ( PMO ), es un tipo de molécula de oligómero (coloquialmente, un oligo ) utilizado en biología molecular para modificar la expresión genética . Su estructura molecular contiene bases de ADN unidas a una cadena principal de anillos de metilenmorfolina unidos a través de grupos fosforodiamidato . Los morfolinos bloquean el acceso de otras moléculas a secuencias específicas pequeñas (~25 bases) de las superficies de apareamiento de bases del ácido ribonucleico (ARN). Los morfolinos se utilizan como herramientas de investigación para la genética inversa al anular la función genética.

Este artículo analiza únicamente los oligómeros antisentido de morfolino, que son análogos de ácidos nucleicos . La palabra "morfolino" puede aparecer en otros nombres químicos, refiriéndose a sustancias químicas que contienen un anillo de morfolina de seis miembros . Para evitar confusiones con otras moléculas que contienen morfolina, al describir oligos, "morfolino" suele escribirse con mayúscula inicial como nombre comercial , pero este uso no es uniforme en la literatura científica. A veces, los oligos de morfolino se denominan PMO (oligómero de morfolino fosforodiamidato), especialmente en la literatura médica. Los vivomorfolinos y los PPMO son formas modificadas de morfolinos con grupos químicos unidos covalentemente para facilitar la entrada a las células.

La inhibición de genes se logra reduciendo la expresión de un gen particular en una célula. En el caso de los genes que codifican proteínas, esto generalmente conduce a una reducción en la cantidad de la proteína correspondiente en la célula. La inhibición de la expresión de genes es un método para aprender sobre la función de una proteína particular; de manera similar, hacer que un exón específico se empalme fuera de la transcripción de ARN que codifica una proteína puede ayudar a determinar la función de la fracción de proteína codificada por ese exón o, a veces, puede inhibir la actividad de la proteína por completo. Estas moléculas se han aplicado a estudios en varios organismos modelo , incluidos ratones , peces cebra , ranas y erizos de mar . ^[1] Los morfolinos también pueden modificar el empalme de pre-ARNm ^[2] o inhibir la maduración y la actividad de miRNA. ^[3] Las técnicas para dirigir los morfolinos a los ARN y administrarlos a las células se han revisado recientemente en un artículo de revista ^[4] y en forma de libro. ^[5]

Los morfolinos se encuentran en desarrollo como terapias farmacéuticas dirigidas contra organismos patógenos como bacterias ^[6] o virus ^[7] y enfermedades genéticas . ^[8] Un fármaco basado en morfolino, eteplirsen de Sarepta Therapeutics, recibió la aprobación acelerada de la Administración de Alimentos y Medicamentos de los EE. UU. en septiembre de 2016 para el tratamiento de algunas mutaciones que causan distrofia muscular de Duchenne , ^[9] aunque el proceso de aprobación estuvo plagado de controversias. Otros fármacos basados ​​en morfolino, golodirsen , viltolarsen y casimersen (también para la distrofia muscular de Duchenne), fueron aprobados por la FDA en 2019-2021. ^{[10] [11] [12]}

Los oligos morfolinos fueron concebidos por Summerton ( Gene Tools ) en AntiVirals Inc. (ahora Sarepta Therapeutics) y desarrollados originalmente en colaboración con Weller. ^[13]

Los morfolinos son moléculas sintéticas que son el producto de un rediseño de la estructura natural de los ácidos nucleicos . ^[14] Por lo general, tienen una longitud de 25 bases y se unen a secuencias complementarias de ARN o ADN monocatenario mediante el apareamiento de bases de ácidos nucleicos estándar . En términos de estructura, la diferencia entre los morfolinos y el ADN es que, mientras que los morfolinos tienen bases de ácidos nucleicos estándar, esas bases están unidas a anillos de metileno morfolina unidos a través de grupos fosforodiamidato en lugar de fosfatos . ^[14] La figura compara las estructuras de las dos hebras representadas allí, una de ARN y la otra de un morfolino. La sustitución de los fosfatos aniónicos por los grupos fosforodiamidato sin carga elimina la ionización en el rango de pH fisiológico habitual , por lo que los morfolinos en organismos o células son moléculas sin carga. Toda la estructura de un morfolino está hecha de estas subunidades modificadas.

Los morfolinos no desencadenan la degradación de sus moléculas de ARN objetivo, a diferencia de muchos tipos estructurales antisentido (p. ej., fosforotioatos , ARNi ). En cambio, los morfolinos actúan mediante "bloqueo estérico", uniéndose a una secuencia objetivo dentro de un ARN, inhibiendo moléculas que de otro modo podrían interactuar con el ARN. ^[15] Los oligos de morfolino se utilizan a menudo para investigar el papel de una transcripción de ARNm específica en un embrión . Los biólogos del desarrollo inyectan oligos de morfolino en huevos o embriones de pez cebra , ^[16] rana africana con pinzas ( Xenopus ), ^[17] erizo de mar ^[18] y pez killi ( F. heteroclitus ) produciendo embriones morfantes , o electroporan morfolinos en embriones de pollo ^[19] en etapas posteriores del desarrollo. Con los sistemas de administración citosólica adecuados, los morfolinos son eficaces en el cultivo celular . ^{[20] [21]} Los vivo-morfolinos, en los que el oligo está unido covalentemente a un dendrímero de administración , ingresan a las células cuando se administran sistémicamente en animales adultos o en cultivos de tejidos. ^[22]

En los organismos eucariotas , el pre-ARNm se transcribe en el núcleo, los intrones se eliminan y luego el ARNm maduro se exporta desde el núcleo al citoplasma . La subunidad pequeña del ribosoma generalmente comienza uniéndose al extremo 5' del ARNm y se une allí mediante varios otros factores de iniciación eucariotas , formando el complejo de iniciación. El complejo de iniciación explora a lo largo de la cadena de ARNm hasta que alcanza un codón de inicio , y luego la subunidad grande del ribosoma se une a la subunidad pequeña y comienza la traducción de una proteína . Todo este proceso se conoce como expresión génica; es el proceso por el cual la información en un gen , codificada como una secuencia de bases en el ADN , se convierte en la estructura de una proteína. Un morfolino puede modificar el splicing, bloquear la traducción o bloquear otros sitios funcionales en el ARN dependiendo de la secuencia de bases del morfolino.

Los morfolinos, unidos a la región 5' no traducida del ARN mensajero (ARNm), pueden interferir con la progresión del complejo de iniciación ribosómica desde la tapa 5' hasta el codón de inicio. Esto impide la traducción de la región codificante de la transcripción específica (lo que se denomina " eliminación " de la expresión génica ). Esto es útil experimentalmente cuando un investigador desea conocer la función de una proteína en particular; los morfolinos proporcionan un medio conveniente para eliminar la expresión de la proteína y aprender cómo esa eliminación cambia las células o el organismo. Algunos morfolinos eliminan la expresión de manera tan eficaz que, después de la degradación de proteínas preexistentes, las proteínas específicas se vuelven indetectables mediante Western blot .

En 2016, se descubrió que un PMO conjugado con péptidos sintéticos (PPMO) inhibe la expresión de la metalo-beta-lactamasa de Nueva Delhi , una enzima que muchas bacterias resistentes a los fármacos utilizan para destruir los carbapenémicos. ^{[23] [24]}

Los morfolinos pueden interferir con los pasos de procesamiento del pre-ARNm ya sea al evitar que los complejos de ribonucleoproteínas nucleares pequeñas ( snRNP ) que dirigen el empalme se unan a sus objetivos en los límites de los intrones en una cadena de pre-ARNm, o al bloquear la base de adenina nucleófila y evitar que forme la estructura de lazo de empalme, o al interferir con la unión de proteínas reguladoras del empalme, como los silenciadores de empalme ^[25] y los potenciadores de empalme . ^[26] La prevención de la unión de snRNP U1 (en el sitio donante) o U2 / U5 (en la fracción de polipirimidina y el sitio aceptor) puede causar un empalme modificado , que comúnmente excluye exones del ARNm maduro. La selección de algunos objetivos de empalme da como resultado inclusiones de intrones, mientras que la activación de sitios de empalme crípticos puede conducir a inclusiones o exclusiones parciales. ^[27] Los objetivos de los snRNP U11 / U12 también se pueden bloquear. ^[28] La modificación del empalme se puede analizar fácilmente mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa ( RT-PCR ) y se observa como un cambio de banda después de la electroforesis en gel de los productos de la RT-PCR. ^[2]

Los morfolinos se han utilizado para bloquear la actividad de miRNA ^{[29] [30]} y la maduración. ^{[3] Los morfolinos marcados con} fluoresceína combinados con anticuerpos específicos de fluoresceína se pueden utilizar como sondas para la hibridación in situ con miRNA. ^[31] Los morfolinos pueden bloquear la actividad de las ribozimas . ^[32] Los morfolinos han inhibido las funciones de snRNP U2 y U12. ^[33] Los morfolinos dirigidos a secuencias de ARNm "resbaladizas" dentro de las regiones codificantes de proteínas pueden inducir cambios de marco de traducción . ^[34] Los morfolinos pueden bloquear la edición de ARN, ^[35] la cola de poli(A) ^[36] y las secuencias de translocación. ^[37] Las actividades de morfolino contra esta variedad de objetivos sugieren que los morfolinos se pueden utilizar como una herramienta de propósito general para bloquear las interacciones de proteínas o ácidos nucleicos con ARNm.

Los morfolinos se han convertido en una herramienta estándar de knockdown en sistemas embrionarios animales , que tienen un rango más amplio de expresión génica que las células adultas y pueden verse fuertemente afectados por una interacción fuera del objetivo. Después de las inyecciones iniciales en embriones de rana o pez en las etapas de una sola célula o de pocas células, los efectos de Morpholino se pueden medir hasta cinco días después, ^[38] después de que la mayoría de los procesos de organogénesis y diferenciación hayan pasado, con fenotipos observados consistentes con el knockdown del gen objetivo. Los oligos de control con secuencias irrelevantes generalmente no producen cambios en el fenotipo embrionario, evidencia de la especificidad de secuencia del oligo de Morpholino y falta de efectos no antisentido. La dosis requerida para un knockdown se puede reducir mediante la coinyección de varios oligos de Morpholino dirigidos al mismo ARNm, que es una estrategia eficaz para reducir o eliminar interacciones de ARN fuera del objetivo dependientes de la dosis. ^[39]

Los experimentos de rescate de ARNm a veces pueden restaurar el fenotipo de tipo salvaje a los embriones y proporcionar evidencia de la especificidad de un Morfolino. En un rescate de ARNm, un Morfolino se coinyecta con un ARNm que codifica para la proteína del Morfolino. Sin embargo, el ARNm de rescate tiene un 5'-UTR (región no traducida) modificado de modo que el ARNm de rescate no contiene ningún objetivo para el Morfolino. La región codificante del ARNm de rescate codifica la proteína de interés. La traducción del ARNm de rescate reemplaza la producción de la proteína que fue inactivada por el Morfolino. Dado que el ARNm de rescate no afectaría los cambios fenotípicos debido a la modulación de la expresión génica fuera del objetivo del Morfolino, este regreso al fenotipo de tipo salvaje es una prueba más de la especificidad del Morfolino. ^[38] En algunos casos, la expresión ectópica del ARN de rescate hace imposible la recuperación del fenotipo de tipo salvaje.

En los embriones, los morfolinos se pueden probar en mutantes nulos para verificar interacciones inesperadas del ARN, y luego se pueden usar en un embrión de tipo salvaje para revelar el fenotipo de knockdown agudo. El fenotipo de knockdown es a menudo más extremo que el fenotipo mutante; en el mutante, los efectos de la pérdida del gen nulo se pueden ocultar mediante compensación genética. ^[40]

Debido a que sus cadenas principales son completamente artificiales, las proteínas celulares no reconocen a los morfolinos. Las nucleasas no los degradan ^[41] , ni tampoco se degradan en el suero o en las células. ^[42]

Hasta el 18% de los Morfolinos parecen inducir fenotipos no relacionados con el objetivo, incluida la muerte celular en el sistema nervioso central y los tejidos somitas de embriones de pez cebra. ^[43] La mayoría de estos efectos se deben a la activación de la apoptosis mediada por p53 y pueden suprimirse mediante la coinyección de un Morfolino anti-p53 junto con el Morfolino experimental. Además, el efecto apoptótico mediado por p53 de una inhibición de Morfolino se ha fenocopiado utilizando otro tipo estructural antisentido, lo que demuestra que la apoptosis mediada por p53 es una consecuencia de la pérdida de la proteína objetivo y no una consecuencia del tipo de oligo de inhibición. ^[44] Parece que estos efectos son específicos de la secuencia; como en la mayoría de los casos, si un Morfolino está asociado con efectos no objetivo, el desajuste de 4 bases del Morfolino no desencadenará estos efectos.

Un motivo de preocupación en el uso de Morpholinos es el potencial de efectos "fuera de objetivo". Si un fenotipo morfante observado se debe a la eliminación intencional o a una interacción con un ARN fuera de objetivo, a menudo se puede abordar en embriones realizando otro experimento para confirmar que el fenotipo morfante observado es resultado de la eliminación del objetivo esperado. Esto se puede hacer recapitulando el fenotipo morfante con un segundo Morpholino no superpuesto que se dirige al mismo ARNm, ^[38] mediante la confirmación de los fenotipos observados comparándolos con una cepa mutante (aunque la compensación oscurecerá un fenotipo en algunos mutantes), probando el Morpholino en un fondo mutante nulo para detectar cambios fenotípicos adicionales o mediante métodos dominantes negativos. Como se mencionó anteriormente, el rescate de fenotipos observados mediante coinyección de un ARNm de rescate es, cuando es posible, una prueba confiable de especificidad de un Morpholino. ^{[38] [40]}

Para que un morfolino sea eficaz, debe ser administrado a través de la membrana celular hacia el citosol de una célula. Una vez en el citosol, los morfolinos se difunden libremente entre el citosol y el núcleo, como lo demuestra la actividad modificadora del empalme nuclear de los morfolinos observada después de la microinyección en el citosol de las células. Se utilizan diferentes métodos para la administración a embriones, a células cultivadas o a animales adultos. Por lo general, se utiliza un aparato de microinyección para la administración a un embrión, y las inyecciones se realizan más comúnmente en la etapa de una sola célula o de pocas células; ^[45] un método alternativo para la administración embrionaria es la electroporación , que puede administrar oligos a tejidos de etapas embrionarias posteriores. ^[46] Las técnicas comunes para la administración a células cultivadas incluyen el péptido Endo-Porter (que hace que el morfolino se libere de los endosomas ), ^{[21] el sistema de administración especial (ya no está disponible comercialmente, utiliza un} heterodúplex de morfolino-ADN y un reactivo de administración de polietilenimina etoxilada ), ^[20] la electroporación, ^[47] o la carga por raspado. ^[48]

La administración a los tejidos adultos suele ser difícil, aunque existen algunos sistemas que permiten una captación útil de oligos de Morfolino no modificados (incluida la captación en células musculares con distrofia muscular de Duchenne ^[49] o las células endoteliales vasculares estresadas durante la angioplastia con balón ^[50] ). Aunque permean eficazmente a través de los espacios intercelulares en los tejidos, los PMO no conjugados tienen una distribución limitada en el citosol y los espacios nucleares dentro de los tejidos sanos después de la administración intravenosa. La administración sistémica a muchas células en organismos adultos se puede lograr mediante el uso de conjugados covalentes de oligos de Morfolino con péptidos que penetran en las células y, aunque la toxicidad se ha asociado con dosis moderadas de los conjugados peptídicos, ^{[51] [52]} se han utilizado in vivo para la administración eficaz de oligos en dosis inferiores a las que causan la toxicidad observada. ^{[7] [53]} Un dendrímero de octa-guanidinio unido al extremo de un Morfolino puede administrar el oligo modificado (llamado Vivo-Morfolino) desde la sangre al citosol. ^{[22] [54]} Los morfolinos de administración habilitada, como los conjugados peptídicos y los vivo-morfolinos, se muestran prometedores como terapias para enfermedades virales y genéticas. ^[55]

• Síntesis de oligonucleótidos
• Análogo de ácido nucleico