Imágenes de calcio

La obtención de imágenes de calcio es una técnica de microscopía para medir ópticamente el estado del calcio (Ca ^{2+ ) de una} célula , tejido o medio aislado. La obtención de imágenes de calcio aprovecha los indicadores de calcio, moléculas fluorescentes que responden a la unión de iones Ca ²⁺ mediante propiedades de fluorescencia. Existen dos clases principales de indicadores de calcio: indicadores químicos e indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI). ^[1] Esta técnica ha permitido realizar estudios de la señalización del calcio en una amplia variedad de tipos de células. En las neuronas, la generación de potenciales de acción siempre va acompañada de una rápida afluencia de iones Ca ²⁺ . Por tanto, la obtención de imágenes de calcio se puede utilizar para monitorizar la actividad eléctrica en cientos de neuronas en cultivos celulares o en animales vivos, lo que ha hecho posible observar la actividad de los circuitos neuronales durante el comportamiento en curso. ^[2]

Los indicadores químicos son pequeñas moléculas que pueden quelar iones de calcio. Todas estas moléculas se basan en un homólogo de EGTA llamado BAPTA , con alta selectividad para iones de calcio (Ca ²⁺ ) frente a iones de magnesio (Mg ²⁺ ).

Este grupo de indicadores incluye fura-2 , indo-1 , fluo-3 , fluo-4 y Calcium Green-1.

Estos colorantes se utilizan a menudo con los grupos carboxilo quelantes enmascarados como ésteres de acetoximetilo , para hacer que la molécula sea lipófila y permitir una fácil entrada en la célula. Una vez que esta forma del indicador está en la célula, las esterasas celulares liberarán los grupos carboxilo y el indicador podrá unirse al calcio. La forma de ácido libre de los colorantes (es decir, sin la modificación del éster de acetoximetilo) también se puede inyectar directamente en las células a través de un microelectrodo o micropipeta que elimina las incertidumbres en cuanto al compartimento celular que contiene el colorante (el éster de acetoximetilo también puede entrar en el retículo endoplasmático y las mitocondrias ). La unión de un ion Ca ²⁺ a una molécula indicadora fluorescente conduce a un aumento en el rendimiento cuántico de fluorescencia o un cambio de longitud de onda de emisión/ excitación . Los indicadores fluorescentes químicos individuales de Ca ²⁺ se utilizan para mediciones de calcio citosólico en una amplia variedad de preparaciones celulares. La primera obtención de imágenes de Ca ²⁺ en tiempo real (frecuencia de vídeo) se realizó en 1986 en células cardíacas utilizando cámaras de vídeo intensificadas. ^[3] El desarrollo posterior de la técnica utilizando microscopios confocales de barrido láser reveló señales subcelulares de Ca ²⁺ en forma de chispas de Ca ²⁺ y destellos de Ca ²⁺ . Las respuestas relativas de una combinación de indicadores fluorescentes químicos de Ca ²⁺ también se utilizaron para cuantificar los transitorios de calcio en orgánulos intracelulares como las mitocondrias . ^[4]

La obtención de imágenes de calcio, también denominada mapeo de calcio, también se utiliza para realizar investigaciones sobre el tejido miocárdico. ^[5] El mapeo de calcio es una técnica omnipresente que se utiliza en corazones enteros y aislados, como los de especies de ratón, rata y conejo.

Los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECIs) son herramientas poderosas útiles para la obtención de imágenes in vivo de procesos celulares, de desarrollo y fisiológicos. ^{[6] [7] [8] [9]} Los GECI no necesitan cargarse de forma aguda en las células; en cambio, los genes que codifican estas proteínas se pueden introducir en células individuales o líneas celulares mediante varios métodos de transfección . También es posible crear animales transgénicos que expresen el indicador en todas las células o de forma selectiva en ciertos subtipos celulares. Los GECI se utilizan para estudiar neuronas, ^{[10] [11]} células T , ^[12] cardiomiocitos , ^[13] y otros tipos de células. Algunos GECI informan sobre el calcio mediante la emisión directa de fotones ( luminiscencia ), pero la mayoría se basan en proteínas fluorescentes como reporteros, incluida la proteína fluorescente verde GFP y sus variantes (eGFP, YFP, CFP).

De los reporteros fluorescentes, los sistemas indicadores de calcio se pueden clasificar en sistemas de proteína fluorescente simple (FP) y sistemas de proteína fluorescente pareada. Los camgaroos fueron una de las primeras variantes desarrolladas que involucraban un sistema de proteína simple. Los camgaroos aprovechan la calmodulina (CaM), una proteína de unión al calcio. En estas estructuras, la CaM se inserta en el medio de la proteína fluorescente amarilla (YFP) en Y145. Estudios previos de mutagénesis revelaron que las mutaciones en esta posición conferían estabilidad del pH mientras mantenían las propiedades fluorescentes, lo que hace que Y145 sea un punto de inserción de interés. Además, los extremos N y C de YFP están unidos por un enlace peptídico (GGTGGS). Cuando la CaM se une a Ca2+, el pKa efectivo se reduce, lo que permite la desprotonación del cromóforo. ^[14] Esto da como resultado un aumento de la fluorescencia tras la unión del calcio de forma intensiométrica. Dicha detección contrasta con los sistemas raciométricos, en los que hay un cambio en los espectros de absorbancia/emisión como resultado de la unión de Ca2+. ^[15] Un sistema de FP único desarrollado posteriormente, denominado G-CaMP , también invoca GFP permutado circularmente. Uno de los extremos está fusionado con CaM y el otro extremo está fusionado con M13 (el dominio de unión de calmodulina de la quinasa ligera de miosina) ^[16] La proteína está diseñada de tal manera que los extremos están cerca en el espacio, lo que permite que la unión de Ca2+ cause cambios conformacionales y modulación del cromóforo, lo que permite una mayor fluorescencia. G-CaMP y sus variantes refinadas tienen afinidades de unión nanomolares. ^[17] Una variante final de proteína única es CatchER, que generalmente se considera un indicador de afinidad más baja. Su bolsillo de unión de calcio es bastante negativo; la unión del catión ayuda a proteger la gran concentración de carga negativa y permite recuperar la fluorescencia. ^[18]

En contraste con estos sistemas, existen sistemas de proteínas fluorescentes pareadas, que incluyen los prototípicos Cameleons . Los Cameleons constan de dos proteínas fluorescentes diferentes, CaM, M13 y un enlace de glicilglicina. ^[15] En ausencia de Ca2+, solo la proteína fluorescente desplazada al azul del donante será fluorescente. Sin embargo, un cambio conformacional causado por la unión de calcio reposiciona la proteína fluorescente desplazada al rojo, lo que permite que se produzca FRET (transferencia de energía de resonancia de Förster). Los indicadores de Cameleon producen una señal raciométrica (es decir, la eficiencia de FRET medida depende de la concentración de calcio). Las variantes originales de Cameleons eran originalmente más sensibles al Ca2+ y se extinguían con ácido. ^[19] Estas deficiencias fueron anuladas por las mutaciones Q69K y V68L. Ambos residuos estaban cerca del cromóforo aniónico enterrado y estas mutaciones probablemente dificultan la protonación, confiriendo una mayor resistencia al pH.

Los GECI de infrarrojo cercano (NIR) tienen una importancia creciente en la detección de calcio, ya que pueden abrir vías para la multiplexación de diferentes sistemas indicadores y permitir una penetración más profunda en los tejidos. Los GECI de infrarrojo cercano se basan en proteínas fluorescentes que se unen a la biliverdina, que se derivan en gran medida de fitocromos bacterianos . Los sistemas de NIR son similares a los pericams inversos en que ambos experimentan una disminución de la fluorescencia al unirse al Ca2+. Los RCaMP y los RGECO son funcionales a más de 700 nm, pero son bastante tenues. ^[20] También se ha construido con éxito un análogo de Cameleon que implica FRET de NIR. ^[21]

Una clase especial de GECI está diseñada para formar una etiqueta fluorescente permanente en las neuronas activas. Se basan en la proteína fotoconmutable Eos , que cambia de verde a rojo mediante la escisión de la cadena principal fotocatalizada (con luz violeta). ^[22] Combinada con la CaM, la luz violeta fotoconvierte solo las neuronas que tienen niveles elevados de calcio. SynTagMA es una versión de CaMPARI2 dirigida a las sinapsis. ^[23]

Aunque los sistemas fluorescentes se utilizan ampliamente, los reporteros bioluminiscentes de Ca2+ también pueden tener potencial debido a su capacidad para anular la autofluorescencia, el fotoblanqueo [no se necesita longitud de onda de excitación], la degradación biológica y la toxicidad, además de mayores relaciones señal-ruido. ^[24] Dichos sistemas pueden depender de la aequorina y la coelenterazina luciferina. La unión de Ca2+ provoca un cambio conformacional que facilita la oxidación de la coelenterazina. El fotoproducto resultante emite luz azul a medida que regresa al estado fundamental. La colocalización de la aequorina con GFP facilita BRET/CRET (transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia o quimioluminiscencia), ^[18] lo que resulta en un aumento de brillo de 19 a 65. Dichas estructuras se pueden utilizar para sondear concentraciones de calcio milimolares a nanomolares. Un sistema similar invoca la obelina y su coelenteramida luciferina, que pueden poseer un tiempo de respuesta al calcio más rápido e insensibilidad al Mg2+ que su contraparte aqueorina. ^[25] Estos sistemas también pueden aprovechar el autoensamblaje de los componentes de la luciferasa. En un sistema denominado “nano-linterna”, la luciferasa RLuc8 se divide y se coloca en diferentes extremos de la CaM. La unión del calcio acerca los componentes de RLuc8, reformando la luciferasa y permitiéndole transferirse a una proteína fluorescente aceptora.

Para minimizar el daño a las células visualizadas, a menudo se recurre a la microscopía de dos fotones para detectar la fluorescencia de los reporteros. ^[26] El uso de longitudes de onda cercanas al infrarrojo y la minimización de la dispersión axial de la función puntual ^[27] permite una resolución nanométrica y una penetración profunda en el tejido. El rango dinámico se determina a menudo a partir de dichas mediciones. Para los indicadores no raciométricos (normalmente indicadores de proteína única), es la relación de las intensidades de fluorescencia obtenidas en condiciones de saturación y agotamiento de Ca2+, respectivamente. Sin embargo, para los indicadores raciométricos, el rango dinámico es la relación entre la relación de eficiencia máxima de FRET (calcio saturado) y la relación de eficiencia mínima de FRET (calcio agotado). Otra cantidad común utilizada para medir las señales producidas por los flujos de concentración de calcio es la relación señal-línea base (SBR), que es simplemente la relación del cambio en la fluorescencia (F - F0) sobre la fluorescencia de línea base. Esto se puede relacionar con la SNR (relación señal/ruido) multiplicando la SBR por la raíz cuadrada del número de fotones contados. ^[18]

Se ha diseñado una clase especial de indicadores de calcio codificados genéticamente para formar una etiqueta fluorescente permanente en las neuronas activas. Se basan en la proteína fotoconmutable mEos , que cambia de verde a rojo cuando se ilumina con luz violeta. Combinada con el sensor de calcio calmodulina , la luz violeta fotoconvierte únicamente las neuronas que tienen niveles elevados de calcio. SynTagMA es una versión de CaMPARI2 dirigida a las sinapsis.

Independientemente del tipo de indicador utilizado, el procedimiento de obtención de imágenes es generalmente muy similar. Las células cargadas con un indicador, o que lo expresan en el caso de un GECI, ^[42] se pueden ver utilizando un microscopio de fluorescencia y capturadas por una cámara Scientific CMOS (sCMOS) ^[43] o una cámara CCD . Los microscopios confocales y de dos fotones proporcionan capacidad de seccionamiento óptico para que las señales de calcio se puedan resolver en microdominios como espinas dendríticas o botones sinápticos , incluso en muestras gruesas como cerebros de mamíferos. Las imágenes se analizan midiendo los cambios de intensidad de fluorescencia para una sola longitud de onda o dos longitudes de onda expresadas como una relación (indicadores raciométricos). Si es necesario, las intensidades y relaciones de fluorescencia derivadas se pueden graficar contra valores calibrados para niveles conocidos de Ca ²⁺ para medir concentraciones absolutas de Ca ²⁺ . Los métodos de microscopía de campo claro ^[44] amplían la lectura funcional de las capacidades de actividad neuronal en volúmenes 3D.

Métodos como la fotometría de fibra , ^{[45] [46]} los miniscopios ^[47] y la microscopía de dos fotones ^{[48] [49]} ofrecen imágenes de calcio en modelos animales de comportamiento libre y con la cabeza fija.