Eos (proteína)

EosFP es una proteína fluorescente verde a roja fotoactivable . Su fluorescencia verde (516 nm) cambia a roja (581 nm) tras la irradiación UV de ~390 nm (luz violeta/azul) debido a una modificación fotoinducida resultante de una rotura en la cadena principal del péptido cerca del cromóforo . ^[1] Eos se descubrió por primera vez como una proteína tetramérica en el coral pétreo Lobophyllia hemprichii ^[2] . Al igual que otras proteínas fluorescentes, Eos permite aplicaciones como el seguimiento de proteínas de fusión, el etiquetado multicolor y el seguimiento del movimiento celular. ^[3] Se han diseñado varias variantes de Eos para su uso en sistemas de estudio específicos, incluidos mEos2, mEos4 y CaMPARI.

La EosFP se descubrió por primera vez en 2005 durante un estudio a gran escala de PAFP (proteínas fluorescentes fotoactivables) en el coral pétreo Lobophyllia hemprichii . ^[2] Desde entonces, se ha clonado con éxito en Escherichia coli y se han desarrollado construcciones de fusión para su uso en células humanas. ^[2] Eos recibió su nombre de la diosa griega del amanecer . ^[2]

A diferencia de las proteínas fluorescentes tetraméricas derivadas del coral antozoario , que pueden interferir con la función celular normal debido a las interacciones entre las subunidades de proteínas, EosFP se ha dividido en variantes diméricas y monoméricas mediante la introducción de mutaciones puntuales únicas . ^[4] Estas variantes han tenido éxito en el seguimiento de los componentes celulares sin alterar la función en la célula huésped y mantienen las mismas propiedades fotofísicas que el Eos de tipo salvaje. ^[5]

Desde su descubrimiento, se ha demostrado que las sondas monoméricas Eos (mEos) se localizan en el citosol , la membrana plasmática , los endosomas , las vesículas prevacuolares , las vacuolas , el retículo endoplasmático , los cuerpos de Golgi , los peroxisomas , las mitocondrias , las invaginaciones, la actina filamentosa y los microtúbulos corticales. ^[6] Las proteínas de fusión mEos permiten el etiquetado de color diferencial en células individuales o grupos de células en órganos en desarrollo. También se pueden utilizar para comprender las interacciones espaciales/temporales entre orgánulos y vesículas. Las dos formas fluorescentes de mEosFP (verde y roja) son compatibles con CFP, GFP, YFP y RFP para el etiquetado multicolor. ^[6]

EosFP emite una fuerte fluorescencia verde (516 nm) que cambia irreversiblemente a roja (581 nm) cuando se irradia con luz ultravioleta de 390 nm. Esta modificación se produce debido a una ruptura en la cadena principal del péptido junto al cromóforo. ^[2] Este mecanismo permite el etiquetado localizado de la proteína y convierte a EosFP en una herramienta adecuada para rastrear el movimiento de proteínas dentro de las células vivas. ^[7] La ​​formación del cromóforo rojo implica la escisión de la cadena principal del péptido, pero casi no incluye otros cambios en la estructura de la proteína. ^[8]

Según la espectroscopia de fluorescencia de molécula única , EosFP es tetramérica y exhibe un fuerte acoplamiento de resonancia de Forster dentro de fluoróforos individuales. ^[2] Al igual que otras proteínas fluorescentes, Eos se puede utilizar para informar diversas señales en células , tejidos y órganos sin alterar la maquinaria biológica compleja. Si bien el uso de proteínas fluorescentes alguna vez se limitó a la proteína fluorescente verde ( GFP ), en los últimos años se han clonado muchas otras proteínas fluorescentes. A diferencia de las GFP, que se derivan de la medusa luminiscente Aequorea victoria, las proteínas fluorescentes derivadas de los antozoos , incluido Eos, emiten fluorescencia en el rango espectral rojo. La nueva propiedad de conversión de verde a rojo fotoinducida en Eos es útil porque permite el seguimiento localizado de proteínas en células vivas. ^[2] EosFP es único porque tiene una gran separación en las longitudes de onda que puede emitir, lo que permite una fácil identificación de los colores pico. ^[5] Todas las proteínas fluorescentes fotoinducibles de verde a rojo, incluida la Eos, contienen una unidad cromófora derivada del tripéptido his-tyr-gly. Esta conversión de verde a rojo se completa mediante luz en lugar de oxidación química como en otras proteínas fluorescentes fotoinducibles. ^[5]

EosFP consta de 226 aminoácidos . Tiene una masa molecular de 25,8 kDa y su pI es 6,9. Eos tiene un 84% de residuos idénticos a Kaede , una proteína fluorescente que se originó en un coral escleractinio diferente Trachyphyllia geoffroyi , pero también puede convertirse irreversiblemente de una forma emisora ​​de verde a roja utilizando luz UV. ^[8] Excluyendo los residuos Phe-61 y His-62, el entorno del cromóforo y el cromóforo en sí no se ven afectados por la modificación fotoquímica. ^[7] El EosFP de tipo salvaje tiene una disposición tetramérica de subunidades donde cada subunidad tiene la misma estructura β-can que GFP. Esta estructura incluye un barril de 11 hebras y, a lo largo del eje central, la hélice que contiene el fluoróforo.

En su forma aniónica, el cromóforo verde tiene un máximo de absorción a 506 nm y un máximo de emisión a 516 nm. Se forma autocatalíticamente a partir de los aminoácidos His-62, Tyr-63 y Gly-64. Inmediatamente alrededor del cromóforo hay un grupo de aminoácidos cargados o polares, así como moléculas de agua estructurales. Por encima del plano del cromóforo, hay una red de interacciones de enlaces de hidrógeno entre Glu-144, His-194, Glu-212 y Gln-38. Arg-66 y Arg-91 participan en la unión de enlaces de hidrógeno con el oxígeno carbonílico de la fracción imidazolinona de Eos verde. La cadena lateral His-62 se encuentra en un entorno no polar. ^[7] La ​​conversión de la forma verde a roja depende de la presencia de una histidina en la primera posición del tripéptido HYG que forma el cromóforo. Cuando este residuo de histidina se sustituye con M, S, T o L, Eos solo emite luz verde brillante y ya no actúa como una proteína fluorescente fotoconvertible. ^[2]

El cromóforo rojo, que se genera por la escisión de la cadena principal del péptido, tiene un máximo de absorción a 571 nm y un máximo de emisión a 581 nm, en su forma aniónica. La ruptura de la cadena principal del péptido que conduce a este cromóforo se encuentra entre His-62 Nα y Cα. ^[5] La fluorescencia roja observada se produce debido a una extensión de la conjugación π del cromóforo, donde el anillo de imidazol His-62 se conecta a la imidazolinona. Los patrones de enlaces de hidrógeno de los cromóforos rojo y verde son casi idénticos. ^[7]

La conversión fotoquímica se produce debido a las interacciones entre la unidad cromófora y los residuos en su vecindad. Glu-212 funciona como una base que elimina un protón de His-62 ayudando en la escisión del enlace His-62-Nα-Cα. Reemplazar Glu-212 con glutamina previene la fotoconversión. A un pH bajo, el rendimiento de Eos involucrado en la fotoconversión aumenta considerablemente a medida que aumenta la fracción de moléculas en la forma protonada. El espectro de acción para la fotoconversión está estrechamente relacionado con el espectro de acción para la forma protonada de Eos. Estas observaciones sugieren que la forma neutra del cromóforo verde, que incluye una cadena lateral Tyr-63 protonada, es la estructura de entrada para la fotoconversión. La expulsión de protones de la cadena lateral Tyr-63 fenil es un evento importante en el mecanismo de conversión donde un protón se transfiere desde el imidazol His-62, que está unido por puentes de hidrógeno al carbonilo Phe-61. El protón adicional hace que la His-62 done un protón al carbonilo de la Phe-61, formando un grupo saliente a partir del enlace peptídico entre la His y la Phe en la reacción de eliminación. La cadena lateral de la His-62 se protona durante la fotoexcitación y ayuda a la reacción donando un protón al carbonilo de la Phe-61 en el grupo saliente. Después de que se escinde la cadena principal, se reforma el enlace de hidrógeno entre la His-62 y la Phe-61. Cuando la His-62 se reemplaza con otros aminoácidos, la EosFP pierde su capacidad de fotoconversión, lo que proporciona evidencia de que la His-62 es un componente necesario del mecanismo de fotoconversión. ^[7] La ​​distribución de carga interna del cromóforo verde se altera durante la fotoexcitación para ayudar en la reacción de eliminación. ^[5]

Tanto el espectro de excitación como el de emisión de fluorescencia de la EosFP de tipo salvaje se desplazan ~65 nm hacia la derecha tras la excitación hacia el extremo rojo del espectro. Este cambio espectral se debe a una extensión del cromóforo acompañada de una ruptura de la cadena principal del péptido entre Phe-61 e His-62 en un mecanismo irreversible. ^[1] La presencia de un punto isosbéstico nítido a 432 nm también sugiere una interconversión entre dos especies. Se puede ver un pico de absorción a 280 nm debido a los aminoácidos aromáticos que transfieren su energía de excitación al cromóforo verde. El rendimiento cuántico de la forma emisora ​​de verde de la Eos es 0,7. ^[2] En las especies desplazadas al rojo, hay bandas laterales vibrónicas pronunciadas separadas del pico principal a 533 nm y 629 nm en el espectro de excitación y el espectro de emisión respectivamente. Hay otro pico en el espectro de excitación rojo a 502 nm probablemente debido a la excitación FRET del fluoróforo rojo. ^[1] El rendimiento cuántico de la forma emisora ​​de luz roja es 0,55. ^[2]

Las variantes de EosFP casi no muestran diferencias en las propiedades espectroscópicas, por lo tanto, es probable que las modificaciones estructurales que surgen de la separación de las interfaces tengan poco o ningún efecto en la estructura del sitio de unión del fluoróforo. ^[4]

Se han creado muchas proteínas de fusión diferentes utilizando EosFP y sus variantes diseñadas. Estas proteínas de fusión permiten el seguimiento de las proteínas dentro de las células vivas al tiempo que conservan funciones biológicas complejas como las interacciones proteína-proteína y las interacciones proteína-ADN. Las construcciones de fusión de Eos incluyen aquellas con proteína de unión a señal de recombinación (RBP) y citoqueratina . ^[2] Los estudios han demostrado que es favorable unir la proteína de interés al lado N-terminal de la etiqueta de EosFP. ^[3] Estas construcciones de fusión se han utilizado para visualizar la translocación nuclear con receptores de andrógenos , la dinámica del citoesqueleto con actina y vinculina y el movimiento intranuclear de proteínas con RBP. ^[3]

Dado que EosFP se puede utilizar en construcciones de fusión manteniendo al mismo tiempo la funcionalidad de la proteína de interés, es una opción popular para estudios de etiquetado multicolor. ^[3] En un experimento de etiquetado de dos colores para mapear las etapas de la mitosis , las células HEK293 se transfectaron primero de forma estable con ADNc de proteína de unión a tubulina fusionado a EGFP para visualizar el aparato del huso . Luego, se utilizó la transfección transitoria de la proteína de unión a la señal de recombinación (RBP) fusionada a d2EosFP para visualizar el comienzo de la mitosis. La fotoconversión se completó mediante microscopía fluorescente y destacó la separación entre dos conjuntos de cromosomas durante la anafase , la telofase y la citocinesis . ^[4]

Se ha utilizado EosFP para rastrear los movimientos celulares durante el desarrollo embrionario de Xenopus laevis. En la etapa de dos células/gástrula temprana, se inyectó en las células ARNm con capuchón que codificaba para un EosFP dímero (d2EosFP) y se fotoconvirtió localmente mediante microscopía de fluorescencia. ^[3] Estos embriones fluorescentes demostraron la dinámica del movimiento celular durante la neurulación. Se encontró EosFP en parte de la notocorda, lo que muestra la posibilidad de utilizar EosFP en experimentos de mapeo del destino . ^[4]

Se han desarrollado muchas nuevas versiones monoméricas de EosFP que ofrecen ventajas sobre la EosFP de tipo salvaje. Desarrollada por un equipo del Janelia Farm Research Campus en el Howard Hughes Medical Institute, mEos4 tiene mayor fotoestabilidad y capacidades de formación de imágenes más prolongadas que EosFP. También es muy resistente a fijadores químicos como PFA, glutaraldehído y OsO4 que se utilizan para conservar las muestras. mEos4 es eficaz a temperaturas más altas que EosFP, se fotoconvierte a una velocidad mayor y tiene una amplitud de emisión más alta tanto en estados fluorescentes verdes como rojos. Las aplicaciones para la proteína mEos4 incluyen microscopía de localización por fotoactivación (PALM), microscopía óptica/electrónica correlativa (CLEM), indicación de actividad proteica e integración de actividad (imágenes post-hoc para la actividad proteica a lo largo del tiempo). ^[10]

mEosFP es otra variante monomérica de Eos que se pliega eficazmente a 37 grados Celsius. Mientras que tdEos (dímero en tándem) no puede fusionarse con objetivos como histonas , tubulina , filamentos intermedios y uniones en hendidura , y mEos (monomérico) que solo se puede utilizar con éxito a 30 grados Celsius, mEos2 es una variante diseñada que puede plegarse eficazmente a 37 grados Celsius y etiquetar con éxito objetivos intolerantes a la fusión de otros dímeros de proteínas fluorescentes. mEos2 muestra propiedades espectrales, brillo, pKa, fotoconversión, contraste y propiedades de maduración casi idénticas a WT Eos. La precisión de localización de mEos2 es el doble de grande que otras proteínas fluorescentes monoméricas. ^[10]

También en el Campus de Investigación Janelia, se desarrolló una nueva molécula fluorescente conocida como CaMPARI (integrador radiométrico fotoactivable modulado por calcio) utilizando EosFP. ^[11] La señal de conversión permanente de verde a rojo se acopló con una proteína sensible al calcio, calmodulina , de modo que el cambio de color en la construcción de fusión dependía de la liberación de calcio acompañada de actividad neuronal . CaMPARI puede marcar permanentemente las neuronas que están activas en cualquier momento y también puede dirigirse a las sinapsis . ^[12] Esta visualización es posible en una amplia cantidad de tejido cerebral en contraposición a la visión limitada disponible con el uso de un microscopio. También permite la visualización de la actividad neuronal durante comportamientos complicados, ya que se permite que el organismo en estudio se mueva libremente, en lugar de bajo un microscopio. También permite la observación de neuronas durante períodos de comportamiento específicos. CaMPARI, hasta ahora, se ha utilizado para marcar circuitos neuronales activos en ratones , peces cebra y moscas de la fruta . ^[13]