Aislamiento (microbiología)

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En microbiología, el término aislamiento se refiere a la separación de una cepa de una población natural y mixta de microbios vivos , tal como están presentes en el medio ambiente, por ejemplo en el agua o el suelo , o de seres vivos con flora cutánea , flora oral o flora intestinal , con el fin de identificar el microbio o los microbios de interés. ^[1] Históricamente, las técnicas de laboratorio de aislamiento se desarrollaron primero en el campo de la bacteriología y la parasitología (durante el siglo XIX), antes que las de la virología durante el siglo XX.

Las técnicas de laboratorio para aislar microbios se desarrollaron por primera vez durante el siglo XIX en el campo de la bacteriología y la parasitología utilizando microscopía óptica . En 1860, Louis Pasteur introdujo con éxito el medio líquido . El cultivo líquido desarrollado por Pasteur permitió visualizar el crecimiento de bacterias específicas, ya sea promoviéndolas o inhibiéndolas. Esta misma técnica se utiliza hoy en día a través de varios medios, como el agar con sal de manitol , un medio sólido. Los cultivos sólidos se desarrollaron en 1881 cuando Robert Koch solidificó el medio líquido mediante la adición de agar ^[2].

Antes del siglo XX no existían técnicas adecuadas de aislamiento en virología . Los métodos de aislamiento microbiano han cambiado drásticamente en los últimos 50 años, desde una perspectiva laboral con la creciente mecanización y en lo que respecta a las tecnologías involucradas, y con ello la velocidad y la precisión.

Para aislar un microbio de una población natural y mixta de microbios vivos , tal como los presentes en el medio ambiente, por ejemplo en el agua o en la flora del suelo , o de seres vivos con flora cutánea , flora bucal o flora intestinal , hay que separarlo de la mezcla.

Tradicionalmente, los microbios se han cultivado para identificar el microbio o los microbios de interés en función de sus características de crecimiento. Según la densidad y la viabilidad esperadas de los microbios presentes en una muestra líquida, se pueden elegir métodos físicos para aumentar el gradiente, como por ejemplo la dilución en serie o la centrifugación . Para aislar organismos en materiales con alto contenido microbiano, como aguas residuales, tierra o heces, las diluciones en serie aumentarán la posibilidad de separar una mezcla.

En un medio líquido con pocos o ningún organismo esperado, de un área que normalmente es estéril (como el LCR , la sangre dentro del sistema circulatorio), la centrifugación, la decantación del sobrenadante y el uso solo del sedimento aumentarán la posibilidad de crecer y aislar bacterias o los virus generalmente asociados a las células.

Si se espera o se busca un organismo particularmente exigente , las técnicas de cultivo y aislamiento microbiológicos deberán estar orientadas hacia ese microbio. Por ejemplo, una bacteria que muere cuando se expone al aire, solo se puede aislar si la muestra se transporta y procesa en condiciones anaeróbicas o sin aire. Una bacteria que muere cuando se expone a temperatura ambiente (termófila) requiere un recipiente de transporte precalentado, y un microbio que se seca y muere cuando se transporta en un hisopo de algodón necesitará un medio de transporte viral antes de que se pueda cultivar con éxito.

Los técnicos de laboratorio inoculan la muestra en determinadas placas de agar sólido con el método de estría en placa o en medio de cultivo líquido , dependiendo de cuál sea el objetivo del aislamiento:

• Si se desea aislar solo un grupo particular de bacterias, como Streptococcus del grupo A de un frotis de garganta, se puede utilizar un medio selectivo que suprimirá el crecimiento de las bacterias concomitantes esperadas en la mezcla (por los antibióticos presentes en el agar), de modo que solo los estreptococos sean "seleccionados", es decir, se destaquen visiblemente. ^[3] Para aislar hongos, se puede utilizar agar Sabouraud . Alternativamente, las condiciones letales para los estreptococos y las bacterias gramnegativas, como las altas concentraciones de sal en el agar salino de manitol, favorecen la supervivencia de cualquier estafilococo presente en una muestra de bacterias intestinales, y el rojo fenol en el agar actúa como un indicador de pH que muestra si las bacterias pueden fermentar el manitol excretando ácido en el medio. En otros agares se añaden sustancias para explotar la capacidad de un organismo de producir un pigmento visible (por ejemplo, medio de granada para Streptococcus del grupo B ) que cambia el color de la colonia bacteriana , o para disolver el agar sangre por hemólisis para que se puedan detectar más fácilmente. Algunas bacterias, como las especies de Legionella, requieren nutrientes particulares o la unión de toxinas como el carbón para crecer y, por lo tanto, se deben utilizar medios como el agar de extracto de levadura y carbón tamponado .
• Si se desea aislar la mayor cantidad posible de cepas, es necesario inocular diferentes medios nutritivos, así como medios enriquecidos, como agar sangre y agar chocolate , y medios de cultivo anaeróbicos, como caldo tioglicolato . Para enumerar el crecimiento, las bacterias se pueden suspender en agar fundido antes de que se solidifique y luego verter en placas de Petri , el llamado "método de vertido en placa", que se utiliza en microbiología ambiental y microbiología de alimentos (por ejemplo, análisis de productos lácteos) para establecer el llamado "recuento en placa aeróbica".

Después de que la muestra se inocula en o sobre el medio elegido, se incuban en las condiciones atmosféricas apropiadas, como condiciones aeróbicas, anaeróbicas o microaerófilas o con dióxido de carbono agregado (5%), a diferentes temperaturas, por ejemplo 37 °C en una incubadora o en un refrigerador para enriquecimiento en frío, bajo la luz apropiada, por ejemplo estrictamente sin luz envuelta en papel o en una botella oscura para micobacterias escotocromógenas , y durante diferentes períodos de tiempo, porque diferentes bacterias crecen a una velocidad diferente, que varía desde horas ( Escherichia coli ) hasta semanas (por ejemplo, micobacterias ).

A intervalos regulares y consecutivos, los técnicos de laboratorio y los microbiólogos inspeccionan los medios para detectar signos de crecimiento visible y registran los resultados. La inspección debe realizarse nuevamente en condiciones que favorezcan la supervivencia del aislado, es decir, en una "cámara anaeróbica" para bacterias anaeróbicas, por ejemplo, y en condiciones que no pongan en peligro la infección de la persona que mira las placas por un microbio particularmente infeccioso, es decir, en una cabina de seguridad biológica para Yersinia pestis (peste) o Bacillus anthracis (ántrax), por ejemplo.

Cuando las bacterias han crecido visiblemente, a menudo todavía están mezcladas. La identificación de un microbio depende del aislamiento de una colonia individual , ya que las pruebas bioquímicas de un microbio para determinar sus diferentes características fisiológicas dependen de un cultivo puro . Para hacer un subcultivo , se trabaja nuevamente con una técnica aséptica en microbiología , levantando una sola colonia de la superficie de agar con un asa y esparciendo el material en los 4 cuadrantes de una placa de agar o en toda la superficie si la colonia era única y no parecía mezclada.

La tinción de Gram permite visualizar la composición de la pared celular de las bacterias en función del color que adquieren después de una serie de pasos de tinción y decoloración. ^[4] Este proceso de tinción permite identificar bacterias gramnegativas y grampositivas . Las bacterias gramnegativas se tiñen de un color rosa debido a la fina capa de peptidoglicano. Si una bacteria se tiñe de color púrpura, debido a la gruesa capa de peptidoglicano, se trata de una bacteria grampositiva. ^[4]

En microbiología clínica se utilizan muchas otras técnicas de tinción para organismos específicos (tinción de bacterias acidorresistentes para micobacterias). Se han desarrollado técnicas de tinción inmunológica, como la inmunofluorescencia directa, para patógenos de importancia médica que crecen lentamente ( tinción de auramina-rodamina para micobacterias ) o son difíciles de cultivar (como las especies de Legionella pneumophila ) y en los que el resultado de la prueba alteraría el tratamiento estándar y la terapia empírica .

Las pruebas bioquímicas de bacterias implican un conjunto de agares en viales para separar las bacterias móviles de las inmóviles . En 1970 se desarrolló una versión miniaturizada, llamada índice de perfil analítico .

La identificación exitosa mediante, por ejemplo, la secuenciación del genoma y la genómica depende de cultivos puros.

Aunque el método más rápido para identificar bacterias es mediante la secuenciación de su gen 16S rRNA , que se ha amplificado por PCR de antemano, este método no requiere aislamiento. Dado que la mayoría de las bacterias no se pueden cultivar con métodos convencionales (en particular las bacterias ambientales o del suelo), se utilizan la metagenómica o la metatranscriptómica , la secuenciación shotgun o la secuenciación dirigida por PCR del genoma . La secuenciación con espectrometría de masas , como en la desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS), se utiliza en el análisis de muestras clínicas para buscar patógenos. La secuenciación del genoma completo es una opción para un organismo singular que no se puede caracterizar lo suficiente para su identificación. También se pueden utilizar pequeños microarreglos de ADN para la identificación.