Granada mediana

El medio Granada es un medio de cultivo selectivo y diferencial diseñado para aislar selectivamente Streptococcus agalactiae (estreptococo del grupo B, GBS) y diferenciarlo de otros microorganismos. El medio Granada fue desarrollado por Manuel Rosa-Fraile et al. en el Servicio de Microbiología del Hospital Virgen de las Nieves de Granada (España). [1]

La identificación del SGB en el medio de granada es sencilla y se basa en la detección de granadaene , un pigmento poliénico rojo específico del SGB. [2] [3] [4]

Streptococcus agalactiae en agar granada, incubación anaeróbica
Streptococcus agalactiae en caldo de granada

El medio Granada se comercializa en los EE. UU. por Hardy Diagnostics [5] y en la Unión Europea y el Reino Unido como marca comercial (®) por Biomerieux [6] y Becton Dickinson. [7]

Composición

Ingrediente [1]CantidadFunción
Agar10 gAgente gelificante
Peptona proteosa n.º 3 Bacto™, (Difco) BD25 gramosNutriente específico, no puede sustituirse por ninguna peptona alternativa.
Almidón20 gramosEstabilizador de pigmentos
Glucosa2,5 gNutritivo
Suero de caballo15 mlNutritivo
Sal hemisódica del ácido MOPS (3-(N-morfolino)propanosulfónico)11 gEl buffer del bien
Fosfato disódico de hidrógeno8,5 gBuffer
Piruvato de sodio1 gramoFuente adicional de energía, efectos protectores contra especies reactivas de oxígeno.
Sulfato de magnesio0,2 g------
Metotrexato6 mgPotenciador de pigmentos
Violeta cristal0,2 mgInhibe el crecimiento de bacterias grampositivas.
Sulfato de colistina5 mgInhibe el crecimiento de bacterias gramnegativas.
Metronidazol1 mgInhibe el crecimiento de bacterias anaeróbicas.
Agua1000 ml

pH 7,45 ± 0,1

Antecedentes y principios

El medio de Granada se desarrolló para el aislamiento selectivo y la identificación de GBS a partir de muestras clínicas. [1] La producción de un pigmento rojo ( granadaene ) en el medio de Granada es exclusiva de los estreptococos del grupo B β -hemolíticos aislados de humanos. [8]

El granadoeno es un pigmento poliénico no isoprenoide (ornitinaramnododecaeno) con un sistema conjugado de 12 dobles enlaces. [3] [9] [10]

La β-hemólisis y la producción de pigmento están codificadas en el SGB por un grupo de 12 genes, el grupo cyl . [11] [12] Además, se ha sugerido que el pigmento del SGB y la hemolisina son moléculas idénticas o estrechamente relacionadas y también se ha informado que son factores importantes que contribuyen a la virulencia del SGB. [8] [13] [14]

Componentes

El agar Granada consiste principalmente en un agar de almidón de peptona de proteosa tamponado con MOPS (un tampón de Good ) y fosfato y suplementado con metotrexato y antibióticos. [1] La peptona de proteosa, el suero de caballo, la glucosa y el piruvato de sodio proporcionan nutrientes para el crecimiento de Streptococcus agalactiae , el piruvato de sodio también proporciona un efecto protector contra las especies reactivas de oxígeno (ROS). MOPS y fosfato tamponan el medio. El metotrexato desencadena la producción de pigmento [8] y el almidón estabiliza el pigmento. [8] El suplemento selectivo contiene los antibióticos, colistina (inhibidor de bacterias gramnegativas) y metronidazol (inhibidor de bacterias anaeróbicas), y violeta de cristal para suprimir las bacterias grampositivas acompañantes.

Granada

Un componente clave del medio de granada es la proteosa peptona N3 (Difco & BD). Esta peptona péptica fue desarrollada por DIFCO (Digestive Ferments Company) durante la Primera Guerra Mundial para producir toxinas bacterianas para la producción de vacunas. [15]

Para el desarrollo de colonias de GBS en medio granada en red-brick es necesaria la presencia en el medio de cultivo del péptido Ile-Ala-Arg-Arg-His-Pro-Tyr-Phe, que sólo se produce durante la hidrólisis con pepsina de la albúmina de mamífero. [16]

Para una producción óptima del pigmento también es necesaria la presencia en la peptona de otras sustancias (no caracterizadas actualmente) procedentes de los tejidos de la pared gastrointestinal de los mamíferos que se utilizan para preparar algunas peptonas. [17]

La presencia de almidón es un requisito básico para estabilizar el pigmento permitiendo el desarrollo de colonias rojas de GBS. [8]

Sin embargo, si se utiliza almidón soluble se obtiene un medio de cultivo que se deteriora rápidamente a temperatura ambiente porque el almidón soluble es hidrolizado por la amilasa sérica (añadida como suplemento). Este inconveniente se puede solucionar no utilizando suero o utilizando almidones no modificados para preparar el medio de cultivo, porque los almidones no modificados son más resistentes a la acción hidrolítica de la amilasa. [18]

Usos

El GBS crece en agar granada como colonias de color rosa-rojo después de 18 a 48 horas de incubación (35 a 37 °C), se obtienen mejores resultados en anaerobiosis (cultivo en un ambiente anaeróbico). [1]

El agar Granada se utiliza para el aislamiento primario, la identificación y el cribado del SGB β-hemolítico a partir de muestras clínicas. [2] [4] Este medio de cultivo es selectivo para el SGB, sin embargo otros microorganismos (como enterococos y levaduras ), resistentes a los agentes selectivos utilizados, pueden desarrollarse como colonias incoloras o blancas. [2]

Colonias rojas de Streptococcus agalactiae en agar granada. Cultivo vagino-rectal, incubación 18 h, anaerobiosis 36°C

El agar Granada es útil para la detección de colonización vaginal y rectal por SGB en mujeres embarazadas y para utilizar profilaxis antibiótica intraparto para evitar la aparición temprana de la infección por SGB en el recién nacido. [19] [20] [21] [22] También se ha sugerido que la pigmentación por SGB en agar Granada puede ayudar a identificar a mujeres embarazadas y recién nacidos con mayor riesgo de desarrollar enfermedad por SGB invasiva [23]

Procedimiento

Las muestras se pueden sembrar directamente en una placa de agar granada o después de un paso de enriquecimiento para obtener el máximo aislamiento. [20] Las muestras se deben sembrar lo antes posible después de su recepción en el laboratorio. Si el material se cultiva a partir de un hisopo (por ejemplo, de un hisopo vaginal o vaginorrectal), haga rodar el hisopo directamente sobre la placa de agar para proporcionar una exposición adecuada del hisopo al medio para una transferencia máxima de organismos. Coloque el cultivo en un entorno anaeróbico, incube a 35-37 °C y examine después de la incubación durante la noche y nuevamente después de aproximadamente 48 horas. [1]

Para aumentar la recuperación de GBS, los hisopos también se pueden inocular previamente en un medio de enriquecimiento selectivo, como el caldo Todd-Hewitt suplementado con gentamicina o colistina y ácido nalidíxico e incubar durante 18-24 horas a 35-37 °C. [20] [21] [22]

Resultados

Las colonias de GBS β-hemolítico aparecen en el medio de Granada como colonias rosadas o rojas, y se distinguen fácilmente de otros microorganismos que también pueden haber crecido en la placa. Cualquier grado de desarrollo anaranjado debe considerarse indicativo de una colonia de GBS, y no son necesarias más pruebas de identificación. [2] El GBS no β-hemolítico se desarrolla en agar Granada como colonias blancas que, si es necesario, pueden analizarse más a fondo mediante aglutinación de látex o la prueba CAMP . [4] [20]

Variante

Colonias de Streptococcus agalactiae en agar granada, aerobiosis, técnica del cubreobjetos

Las placas de agar Granada también se pueden incubar aeróbicamente siempre que se coloque un cubreobjetos sobre el inóculo en la placa. [2]

El medio de granada también se puede utilizar como medio líquido (caldo de granada) [24] como el caldo de zanahoria Strep B [25]. Cuando se utilizan medios de granada líquidos, no es necesaria la incubación anaeróbica. [2]

Granada yEstreptococo agalactiae

La β-hemólisis y la producción de pigmento (granadaene) están codificadas en el síndrome de Guillain-Barré mediante un grupo de 12 genes, el grupo cyl . [11] [12]

Además, se ha sugerido que el pigmento del SGB y la hemolisina son moléculas idénticas o estrechamente relacionadas y también se ha informado que son factores importantes que contribuyen a la virulencia del SGB. [8] [13] [14]

Sin embargo, entre el 1 y el 5 % de las cepas de SGB no son hemolíticas y no producen pigmento. [8] Sin embargo, estas cepas de SGB no hemolíticas y no pigmentadas (que carecen de pigmento y hemolisina) se consideran menos virulentas. [13] [14] [26] [27] [28] [29]

Referencias

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