Tinción de Gram
Procedimiento de investigación en microbiología
Micrografía de un coco grampositivo y un bacilo gramnegativo .
Una tinción de Gram de una mezcla de Staphylococcus aureus ( S. aureus ATCC 25923, cocos grampositivos , en violeta) y Escherichia coli ( E. coli ATCC 11775, bacilos gramnegativos , en rojo), las bacterias de referencia de tinción de Gram más comunes.

La tinción de Gram ( tinción de Gram o método de Gram ) es un método de tinción que se utiliza para clasificar las especies bacterianas en dos grandes grupos: bacterias grampositivas y bacterias gramnegativas . También puede utilizarse para diagnosticar una infección fúngica . [1] El nombre proviene del bacteriólogo danés Hans Christian Gram , quien desarrolló la técnica en 1884. [2]

La tinción de Gram diferencia las bacterias por las propiedades químicas y físicas de sus paredes celulares . Las células grampositivas tienen una capa gruesa de peptidoglicano en la pared celular que retiene el colorante primario, el violeta cristal . Las células gramnegativas tienen una capa más fina de peptidoglicano que permite que el violeta cristal se elimine al añadir etanol . Se tiñen de rosa o rojo con el colorante de contraste , [3] comúnmente safranina o fucsina . La solución de yodo de Lugol siempre se añade después de la adición del violeta cristal para fortalecer los enlaces del colorante con la membrana celular .

La tinción de Gram es casi siempre el primer paso para identificar un grupo bacteriano. Si bien la tinción de Gram es una herramienta de diagnóstico valiosa tanto en el ámbito clínico como en el de la investigación, no todas las bacterias pueden clasificarse definitivamente mediante esta técnica. Esto da lugar a grupos de bacterias gram-variables y gram-indeterminadas .

Historia

El método recibe el nombre de su inventor, el científico danés Hans Christian Gram (1853-1938), quien desarrolló la técnica mientras trabajaba con Carl Friedländer en la morgue del hospital de la ciudad de Berlín en 1884. Gram ideó su técnica no con el propósito de distinguir un tipo de bacteria de otro, sino para hacer que las bacterias fueran más visibles en secciones teñidas de tejido pulmonar. [4] Gram notó que algunas células bacterianas poseían una notable resistencia a la decoloración. Basándose en estas observaciones, Gram desarrolló el procedimiento inicial de tinción de Gram, haciendo uso inicialmente de violeta de genciana-anilina de Ehrlich, yodo de Lugol, alcohol absoluto para la decoloración y marrón de Bismarck para la contratinción. [5] Publicó su método en 1884 e incluyó en su breve informe la observación de que el bacilo del tifus no retenía la tinción. [6] Gram inicialmente no hizo la distinción entre bacterias gramnegativas y grampositivas utilizando su procedimiento. [5]

Usos

Tinción de Gram de Candida albicans de un hisopado vaginal. Las clamidosporas pequeñas y ovaladas tienen un diámetro de entre 2 y 4 μm .

La tinción de Gram es una técnica de laboratorio bacteriológica [7] que se utiliza para diferenciar las especies bacterianas en dos grandes grupos ( grampositivas y gramnegativas ) en función de las propiedades físicas de sus paredes celulares . [8] [ página necesaria ] La tinción de Gram también se puede utilizar para diagnosticar una infección fúngica . [1] La tinción de Gram no se utiliza para clasificar las arqueas , ya que estos microorganismos producen respuestas muy variables que no siguen sus grupos filogenéticos . [9]

Algunos organismos son gram-variables (lo que significa que pueden teñirse de forma negativa o positiva); algunos no se tiñen con ninguno de los colorantes utilizados en la técnica de Gram y no se observan. [ cita requerida ]

Médico

Las tinciones de Gram se realizan en el líquido corporal o en la biopsia cuando se sospecha una infección . Las tinciones de Gram arrojan resultados mucho más rápidamente que el cultivo y son especialmente importantes cuando la infección marcaría una diferencia importante en el tratamiento y el pronóstico del paciente; ejemplos son el líquido cefalorraquídeo para la meningitis y el líquido sinovial para la artritis séptica . [10] [11]

Mecanismo de tinción

Bacterias grampositivas teñidas de púrpura (izquierda) y gramnegativas teñidas de rosa (derecha)

Las bacterias grampositivas tienen una pared celular gruesa y reticular formada por peptidoglicano (50-90% de la envoltura celular) y, como resultado, se tiñen de violeta con el violeta cristal, mientras que las bacterias gramnegativas tienen una capa más fina (10% de la envoltura celular), por lo que no retienen la tinción violeta y se tiñen de rosa con la safranina. Hay cuatro pasos básicos de la tinción de Gram:

  1. Aplicación de un colorante primario ( violeta cristal ) a un frotis de cultivo bacteriano fijado con calor. La fijación con calor mata algunas bacterias, pero se utiliza principalmente para fijar las bacterias al portaobjetos de modo que no se eliminen durante el procedimiento de tinción.
  2. La adición de yodo , que se une al cristal violeta y lo atrapa en la célula.
  3. Decoloración rápida con etanol o acetona.
  4. Contratinción con safranina . [12] La fucsina carbol a veces se sustituye por safranina ya que tiñe más intensamente las bacterias anaeróbicas, pero se usa con menos frecuencia como contratinción. [13]
Resumen de la tinción de Gram
Aplicación deReactivoColor de la celda
Gram-positivoGram-negativo
Tinte primariovioleta cristalpúrpurapúrpura
Tramperoyodopúrpurapúrpura
Decolorantealcohol / acetonapúrpuraincoloro
Contramanchassafranina / fucsina carbolpúrpurarosa o rojo

El violeta cristal (CV) se disocia en soluciones acuosas en CV+
y cloruro ( Cl−
) iones. Estos iones penetran la pared celular tanto de las células grampositivas como de las gramnegativas. El CV+
El ion interactúa con los componentes cargados negativamente de las células bacterianas y tiñe las células de color púrpura. [14]

Yoduro ( I−
o yo−
3) interactúa con CV+
y forma grandes complejos de violeta cristal y yodo (CV–I) dentro de las capas internas y externas de la célula. El yodo se suele denominar mordiente , pero es un agente atrapante que impide la eliminación del complejo CV–I y, por lo tanto, colorea la célula. [15]

Cuando se añade un decolorante como el alcohol o la acetona, éste interactúa con los lípidos de la membrana celular. [16] Una célula gramnegativa pierde su membrana lipopolisacárida externa y la capa interna de peptidoglicano queda expuesta. Los complejos CV-I se eliminan de la célula gramnegativa junto con la membrana externa. [17] Por el contrario, una célula grampositiva se deshidrata a partir de un tratamiento con etanol. Los grandes complejos CV-I quedan atrapados dentro de la célula grampositiva debido a la naturaleza multicapa de su peptidoglicano. [17] El paso de decoloración es crítico y debe cronometrarse correctamente; la tinción de violeta cristal se elimina tanto de las células grampositivas como de las negativas si el agente decolorante se deja demasiado tiempo (en cuestión de segundos). [18]

Después de la decoloración, la célula grampositiva permanece morada y la célula gramnegativa pierde su color morado. [18] La contratinción, que suele ser safranina con carga positiva o fucsina básica, se aplica al final para dar a las bacterias gramnegativas decoloradas un color rosa o rojo. [3] [19] Tanto las bacterias grampositivas como las gramnegativas absorben la contratinción. Sin embargo, la contratinción no se ve en las bacterias grampositivas debido a que la tinción de violeta cristal es más oscura. [ cita requerida ]

Ejemplos

Bacterias grampositivas

Tinción de Gram de estreptococos grampositivos rodeados de células de pus.

Las bacterias grampositivas generalmente tienen una sola membrana ( monodermo ) rodeada por un peptidoglicano grueso. Esta regla es seguida por dos filos: Bacillota (excepto las clases Mollicutes y Negativicutes ) y Actinomycetota . [8] [20] Por el contrario, los miembros de Chloroflexota (bacterias verdes no azufradas) son monodermos pero poseen un peptidoglicano delgado o ausente (clase Dehalococcoidetes ) y pueden teñirse de forma negativa, positiva o indeterminada; los miembros de Deinococcota se tiñen de forma positiva pero son didermos con un peptidoglicano grueso. [8] [ página necesaria ] [20]

La resistencia de la pared celular se ve reforzada por los ácidos teicoicos, sustancias glicopoliméricas embebidas en el peptidoglicano. Los ácidos teicoicos desempeñan múltiples funciones, como generar la carga neta negativa de la célula, contribuir a la rigidez de la pared celular y al mantenimiento de la forma, y ​​ayudar a la división celular y a la resistencia a diversos factores estresantes, incluidos el calor y la sal. A pesar de la densidad de la capa de peptidoglicano, sigue siendo relativamente porosa, lo que permite que la mayoría de las sustancias penetren. Para los nutrientes más grandes, las bacterias grampositivas utilizan exoenzimas, secretadas extracelularmente para descomponer las macromoléculas fuera de la célula. [21]

Históricamente , las formas grampositivas componían el filo Firmicutes , un nombre que ahora se utiliza para el grupo más grande. Incluye muchos géneros bien conocidos como Lactobacillus, Bacillus , Listeria , Staphylococcus , Streptococcus , Enterococcus y Clostridium . [22] También se ha ampliado para incluir a los Mollicutes, bacterias como Mycoplasma y Thermoplasma que carecen de paredes celulares y, por lo tanto, no pueden teñirse con Gram, pero que derivan de dichas formas. [23]

Algunas bacterias tienen paredes celulares que son especialmente aptas para retener las tinciones. Estas bacterias aparecerán positivas en la tinción de Gram aunque no estén estrechamente relacionadas con otras bacterias grampositivas. Se las llama bacterias acidorresistentes y solo se pueden diferenciar de otras bacterias grampositivas mediante procedimientos de tinción especiales . [24]

Bacterias gramnegativas

Neisseria gonorrhoeae gramnegativa y células de pus

Las bacterias gramnegativas generalmente poseen una fina capa de peptidoglicano entre dos membranas ( diderm ). [25] El lipopolisacárido (LPS) es el antígeno más abundante en la superficie celular de la mayoría de las bacterias gramnegativas, contribuyendo hasta el 80% de la membrana externa de E. coli y Salmonella . [26] Estas moléculas de LPS, que consisten en el antígeno O u O-polisacárido, el polisacárido central y el lípido A, cumplen múltiples funciones, incluida la contribución a la carga negativa de la célula y la protección contra ciertas sustancias químicas. El papel del LPS es fundamental en las interacciones huésped-patógeno, ya que el antígeno O provoca una respuesta inmunitaria y el lípido A actúa como una endotoxina. [21]

Además, la membrana externa actúa como una barrera selectiva, regulada por porinas, proteínas transmembrana que forman poros que permiten el paso de moléculas específicas. El espacio entre la membrana celular y la membrana externa, conocido como periplasma, contiene enzimas periplásmicas para el procesamiento de nutrientes. Un componente estructural significativo que une la capa de peptidoglicano y la membrana externa es la lipoproteína de Braun, que proporciona estabilidad y resistencia adicionales a la pared celular bacteriana. [21]

La mayoría de los filos bacterianos son gramnegativos, incluidas las cianobacterias , las bacterias verdes del azufre y la mayoría de los Pseudomonadota (con excepción de algunos miembros de las Rickettsiales y los insectos endosimbiontes de las Enterobacteriales ). [8] [ página necesaria ] [20]

Bacterias gram-variables y gram-indeterminadas

Algunas bacterias, después de teñirse con la tinción de Gram, producen un patrón gram-variable: se observa una mezcla de células rosadas y púrpuras. [17] [27] En cultivos de Bacillus, Butyrivibrio y Clostridium , una disminución en el espesor del peptidoglicano durante el crecimiento coincide con un aumento en el número de células que se tiñen como gramnegativas. [27] Además, en todas las bacterias teñidas con la tinción de Gram, la edad del cultivo puede influir en los resultados de la tinción. [27]

Las bacterias gram-indeterminadas no responden de manera predecible a la tinción de Gram y, por lo tanto, no se pueden determinar como gram-positivas o gram-negativas. Los ejemplos incluyen muchas especies de Mycobacterium , incluyendo Mycobacterium bovis , Mycobacterium leprae y Mycobacterium tuberculosis , las dos últimas de las cuales son los agentes causantes de la lepra y la tuberculosis, respectivamente. [28] [29] Las bacterias del género Mycoplasma carecen de una pared celular alrededor de sus membranas celulares , [10] lo que significa que no se tiñen por el método de Gram y son resistentes a los antibióticos que tienen como objetivo la síntesis de la pared celular. [30] [31]

Nota ortográfica

El término tinción de Gram se deriva del apellido de Hans Christian Gram ; por lo tanto, el epónimo (Gram) se escribe con mayúscula, pero no el sustantivo común (mancha), como es habitual en los términos científicos. [32] Las letras iniciales de gram-positivo y gram-negativo , que son adjetivos epónimos , pueden ser G mayúscula o g minúscula , según la guía de estilo (si la hay) que rija el documento que se está escribiendo. El estilo en minúsculas lo utilizan los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de EE. UU. y otros regímenes de estilo como el estilo AMA . [33] Los diccionarios pueden usar minúsculas, [34] [35] mayúsculas, [36] [37] [38] [39] o ambas. [40] [41] El uso de Gram-positivo o Gram-negativo en mayúsculas también es común en muchos artículos y publicaciones de revistas científicas . [41] [42] [43] Cuando se envían artículos a revistas, cada revista puede o no aplicar el estilo de la casa a la versión post-impresión . Las versiones pre-impresión contienen el estilo que el autor haya usado. Incluso los regímenes de estilo que usan minúsculas para los adjetivos gram-positivo y gram-negativo todavía suelen usar mayúsculas para la tinción de Gram . [ cita requerida ]

Véase también

Referencias

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  • Vídeo de la técnica de tinción de Gram
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