Especificación del ectodermo
Etapa del desarrollo embrionario

En Xenopus laevis , la especificación de las tres capas germinales ( endodermo , mesodermo y ectodermo ) ocurre en la etapa de blástula . [1] Se han realizado grandes esfuerzos para determinar los factores que especifican el endodermo y el mesodermo. Por otro lado, solo se han descrito unos pocos ejemplos de genes que se requieren para la especificación del ectodermo en la última década. La primera molécula identificada como necesaria para la especificación del ectodermo fue la ubiquitina ligasa Ectodermina (Ecto, TIF1-γ, TRIM33); más tarde, se encontró que la enzima desubiquitinante, FAM/USP9x , es capaz de superar los efectos de la ubiquitinación realizada por la ectodermina en Smad4 (Dupont et al., 2009). Se han propuesto dos factores de transcripción para controlar la expresión génica de genes específicos del ectodermo: POU91/Oct3/4 [2] y FoxIe1/Xema . [3] [4] Se ha demostrado que un nuevo factor específico del ectodermo, XFDL156 , es esencial para la supresión de la diferenciación del mesodermo a partir de células pluripotentes. [5]

Proteínas necesarias para la especificación ectodérmica.

Ectodermina y FAM

Papel biológico de la ectodermina y FAM

La proteína Ectodermina, identificada por primera vez en embriones de Xenopus , promueve el destino ectodérmico y suprime la formación del mesodermo mediada por la señalización del Factor de Crecimiento Transformante β (TGFβ) y las Proteínas Morfogénicas Óseas (BMP), miembros de la superfamilia TGFβ. [6] Cuando los ligandos TGFβ se unen a los receptores TGFβ, causan la activación de los transductores de señal R-Smads ( Smad2 , Smad3 ). Smad4 forma un complejo con R-Smads activados y activa la transcripción de genes específicos en respuesta a la señal TGFβ. La vía BMP transmite sus señales de manera similar pero a través de otros tipos de R-Smads ( Smad1 , Smad5 y Smad8). El factor de transcripción Smad4 es el único mediador común compartido entre las vías TGFβ y BMP. [7] Durante la especificación del ectodermo, la función de Smad4 está regulada por la ubiquitinación y desubiquitinación realizadas por la ectodermina y FAM, respectivamente. El estado de ubiquitinación de Smad4 determinará si es capaz de responder a las señales derivadas de TGFβ y BMP. [6] [8] El equilibrio de la actividad, la localización y el momento de los transductores de TGFβ y BMP, Smad4, FAM y de la ectodermina debe lograrse para poder modular la expresión génica de los genes necesarios para la formación de la capa germinal.

Identificación de ectodermina y FAM

Una biblioteca de ADNc de la etapa de blástula de un embrión de rana se clonó en plásmidos de expresión de ARN para generar ARNm sintético. Luego, el ARNm se inyectó en varios embriones de Xenopus en una etapa de cuatro células y se buscó en embriones de blástula tempranos una expansión de la región del marcador ectodérmico Sox2 y una disminución de la expresión del marcador mesodérmico Xbra . La ectodermina fue uno de los 50 clones que presentó este fenotipo cuando se inyectó en embriones. [6] La identificación de FAM se realizó a través de una pantalla de ARNi para encontrar desubiquitinasas que regulan la respuesta a TGFβ.

Localización de ectodermina y FAM

El ARNm de la ectodermina se deposita por vía materna en el polo animal del huevo. En la etapa temprana de la blástula del embrión, el ARNm y la proteína de la ectodermina forman un gradiente que va desde el polo animal (concentración más alta) hasta la zona marginal (concentración más baja) para evitar que las señales TGFβ y nodales que inducen el mesodermo se originen en el polo vegetal. El ARNm de la ectodermina se enriquece en el lado dorsal del embrión y al final de esta etapa la expresión desaparece gradualmente. [6] Smad4 es ubiquitinado por la ectodermina en el núcleo y exportado al citoplasma donde puede ser desubiquitinado por FAM; de esta manera Smad4 puede reciclarse y ser funcional nuevamente. Aunque no existe un perfil de expresión de FAM en embriones tempranos en Xenopus , en el pez cebra, el homólogo de FAM se expresa de manera ubicua en una etapa de dos células, pero a medida que avanza el desarrollo, solo se expresa en el sistema nervioso central cefálico. [9]

Funciones de la ectodermina y FAM

La ectodermina es una ligasa de ubiquitina E3 que inhibe las vías de señalización de TGFβ y BMP mediante la inhibición de Smad4 a través de la ubiquitinación de la lisina 519 y también mediante la unión directa a fosfo-Smad2. [6] [8] La inyección de ARNm de Ecto en la zona marginal conduce a una expansión del marcador ectodérmico temprano, Sox2, y una reducción de los marcadores mesodérmicos (Xbra, Eomes, Vent-1, Mix-1 y Mixer). Lo opuesto sucede en experimentos de eliminación de Ectodermina mediante el uso de una estrategia de morfolino; los embriones se vuelven más sensibles a la respuesta de activina, muestran un aumento y expansión de la expresión de genes específicos mesodérmicos y regulan a la baja la expresión de la placa neural y el marcador de la epidermis (Sox2 y citoqueratina respectivamente). En consonancia con una actividad de ubiquitina-ligasa dependiente de RING-finger de Ectodermina, un mutante de Ecto RING-finger (C97A/C100A) es inactivo en la ganancia de función. [6] La ganancia de función de FAM aumenta las respuestas de BMP y TGFβ y su pérdida de función por mutación en un residuo crítico para su actividad provocó la inhibición de la respuesta de TGFβ.

Conservación de ectodermina y FAM en otras especies

La función molecular de la ectodermina humana para actuar como un regulador negativo de Smad4 sugiere que esta función específica se conserva entre el linaje de vertebrados. [6] La identidad de secuencia entre los homólogos de FAM es superior al 90% al comparar los homólogos de Xenopus , pez cebra, ratón y humano, lo que sugiere que esto también podría conservarse entre otros organismos. [9] De hecho, la inactivación del gen knockout en embriones de ratón mostró que la función de la ectodermina como inhibidor de la señalización de TGF-beta se conserva. [10] Los embriones que carecen de ectodermina muestran un desarrollo defectuoso del endodermo visceral anterior (AVE), que es el primer tejido que es inducido por señales de TGF-beta en embriones de ratón; de acuerdo con la pérdida de un inhibidor, los embriones ectodermina-/- mostraron una inducción de AVE agrandada. Como el AVE es una fuente natural de antagonistas secretados de TGF-beta, esta expansión primaria del AVE causó secundariamente, en etapas posteriores, una inhibición de los ligandos extracelulares de TGF-beta, lo que resultó en embriones sin desarrollo del mesodermo. Este modelo fue confirmado por el hallazgo de que los embriones ectodermina-/- fueron rescatados al tipo salvaje (AVE normal, desarrollo normal del mesodermo) al reducir la dosis genética del principal ligando de TGF-beta del embrión, Nodal. Apoyando aún más su papel como inhibidor de TGF-beta, la eliminación selectiva de tejido de la ectodermina del epiblasto (del cual se deriva el mesodermo, pero no el AVE) dejó intacto al AVE pero causó esta vez una expansión de los destinos mesodérmicos anteriores, indicativo de una mayor capacidad de respuesta a las señales de TGF-beta. En conjunto, estos datos confirmaron con herramientas genéticas un papel autónomo de la célula para la ectodermina como inhibidor de las respuestas de Smad4 previamente identificadas en embriones de Xenopus y líneas celulares humanas.

FOXI1e

Papel biológico de FOXI1e

Durante las primeras etapas del desarrollo en Xenopus , el factor de transcripción FoxI1e/Xema activa la diferenciación epidérmica y reprime genes específicos del endodermo y el mesodermo en los casquetes animales (Suri et al., 2005). Se sugiere que FoxI1e está activo antes de que el ectodermo se diferencie en epidermis y sistema nervioso central.

Identificación de FoxI1e

Mir et al., 2005 identificaron FoxI1e (Xema) seleccionando genes que estaban regulados a la baja bajo señales inductoras del mesodermo en el ectodermo en comparación con la región vegetal de un embrión de blástula temprana . Además, se observó una alta expresión de este gen en los casquetes animales en embriones que carecen de VegT en comparación con el tipo salvaje.

Localización en la célula

El ARNm de FoxI1e se expresa cigóticamente (estadio 8.5) y alcanza un nivel más alto de expresión temprano en la gastrulación y mantiene ese nivel en la neurula, el brote de la cola hasta los primeros estadios de renacuajo. [4] FoxI1e tiene un patrón de expresión en mosaico peculiar, se expresa primero en el ectodermo dorsal y mientras la gástrula progresa, la expresión pasa por el lado ventral y su expresión se regula a la baja en el lado dorsal cuando se está formando la placa neural. [11] FoxI1e depende de señales BMP en el estadio de neurula, lo que limita la localización de FoxI1e al lado ventral del ectodermo.

Función y regulación de las proteínas

FoxI1e/Xema pertenece a la clase FoxI1 de la familia de factores de transcripción de cabeza de horquilla, conocidos por participar en la formación del mesodermo, el desarrollo del ojo [12] y la especificación de la cabeza ventral. [13] Se ha propuesto que Notch y/o NODAL , expresados ​​en la región vegetal/mesodermo del embrión de blástula temprana , podrían ser potencialmente los inhibidores de FoxI1e. [3] [11]

Pérdida y ganancia de función

La inhibición de la maduración del ARNm de FoxI1e por un morfolino que bloquea el empalme muestra malformaciones en el desarrollo de la epidermis y el sistema permeable y regula a la baja los genes específicos del ectodermo, mientras que la sobreexpresión de FoxI1e inhibe la formación del mesodermo y el endodermo. Las estructuras vegetales forman masas de blástula tardías que normalmente darían lugar al endodermo y al mesodermo, cuando se inyectan con el ARNm de FoxI1e, pueden expresar marcadores específicos del ectodermo (E-cadherina panectodérmica, citoqueratina epitelial, marcador de cresta neural Slug y marcador neural Sox-2) mientras que los marcadores endodérmicos (endodermina, Xsox17a) disminuyeron en expresión. [3] [4]

XFDL156

Función biológica de XFDL156

La proteína p53 se une a los promotores de los genes mesodérmicos tempranos. [14] p53 es una transcripción depositada maternamente que forma un complejo de factores de transcripción con Smad2 e impulsa la expresión de genes involucrados en la inducción del mesodermo y la activación de los genes diana de TGFβ. [15] La proteína nuclear de dedo de zinc (Zn) XFDL159, expresada en el casquete animal, actúa como un factor de ectodermo que especifica el ectodermo al inhibir que p53 active los genes para la diferenciación del mesodermo. [5]

Identificación de XFDL156

Construcción de una biblioteca de ADNc a partir de casquetes animales en un estadio de 11,5, clonados en un vector de expresión y ARNm generado. El ARN sintético se inyectó luego en embriones y se obtuvieron los casquetes animales de estos embriones recolectados y se sometieron a un tratamiento con activina . Xbra se recuperó seleccionando el clon que reprime el marcador mesodérmico Xbra. [5]

Localización de XFDL156

Dado que XFDL156 es un factor que interactúa con p53, la localización de esta proteína está en el núcleo (Sasai et al., 2008). El ARNm de XFDL156 se deposita en la madre y luego se expresa en el cigoto. La cronología de la expresión génica muestra un nivel más alto de expresión en la gástrula temprana y una disminución de la mitad de la expresión en la mitad de la gástrula y en la etapa 20 la expresión se desvanece. [5]

Función proteica de XFDL156

El dedo de zinc de XFDR se une a la región reguladora de p53 ubicada en el dominio C-terminal y su expresión no se ve afectada por la presencia de los factores de transcripción activina, FoxI1e o XLPOU91.

Pérdida y ganancia de función en XFDL156

La pérdida de función por morfolino provoca una diferenciación mesodérmica incorrecta en las regiones ectodérmicas; esto es causado por la desupresión de los marcadores mesodérmicos (Xbra, VegT y Mix.2). La ganancia de funciones provoca una disminución en la expresión de los marcadores mesodérmicos. [5]

Conservación de homólogos de XFDL en otras especies

Los homólogos humanos y de ratón de XFDR156 pueden complementar la función de XFDR de interactuar con p53 e inhibirlo para que actúe como factor de transcripción. [5]

  • Inducción de ectodermo en la blástula temprana en embriones de Xenopus.
    Inducción de ectodermo en la blástula temprana en embriones de Xenopus .

Referencias

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  2. ^ Snir, M., Ofir, R., Elias, S. y Frank, D. (2006). La proteína POU91 de Xenopus laevis, un homólogo de Oct3/4, regula las transiciones de competencia desde el mesodermo hasta los destinos de las células neuronales. EMBO J 25, 3664-3674.
  3. ^ abc Mir, A., Kofron, M., Zorn, AM, Bajzer, M., Haque, M., Heasman, J. y Wylie, CC (2007). FoxI1e activa la formación del ectodermo y controla la posición celular en la blástula de Xenopus. Development 134, 779-788.
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