Derribo genético

La desactivación de genes es una técnica experimental mediante la cual se reduce la expresión de uno o más genes de un organismo . La reducción puede ocurrir mediante modificación genética o mediante el tratamiento con un reactivo como un oligonucleótido corto de ADN o ARN que tenga una secuencia complementaria a cualquiera de los genes o a una transcripción de ARNm. [1]

Versus caída transitoria

Si se modifica genéticamente el ADN de un organismo, el organismo resultante se denomina "organismo knockdown". Si el cambio en la expresión génica es causado por la unión de un oligonucleótido a un ARNm o la unión temporal a un gen , esto conduce a un cambio temporal en la expresión génica que no modifica el ADN cromosómico y el resultado se denomina "knockdown transitorio". [1]

En un knockdown transitorio, la unión de este oligonucleótido al gen activo o sus transcripciones provoca una disminución de la expresión a través de una variedad de procesos. La unión puede ocurrir ya sea a través del bloqueo de la transcripción (en el caso de la unión del gen), la degradación de la transcripción del ARNm (por ejemplo, por ARN interferente pequeño ( siRNA )) o antisentido dependiente de la ARNasa -H, o a través del bloqueo de la traducción del ARNm , sitios de empalme del ARN pre-m o sitios de escisión de nucleasa utilizados para la maduración de otros ARN funcionales, incluido el miRNA (por ejemplo, por oligos morfolino u otros antisentido independientes de la ARNasa-H). [1] [2]

El uso más directo de los knockdowns transitorios es para aprender sobre un gen que ha sido secuenciado , pero que tiene una función desconocida o no se conoce por completo. Este enfoque experimental se conoce como genética inversa . Los investigadores extraen inferencias de cómo el knockdown difiere de los individuos en los que el gen de interés está operativo. Los knockdowns transitorios se utilizan a menudo en biología del desarrollo porque los oligos se pueden inyectar en cigotos unicelulares y estarán presentes en las células hijas de la célula inyectada durante el desarrollo embrionario . [3] El término knockdown genético apareció por primera vez en la literatura en 1994 [4]

Interferencia de ARN

La interferencia de ARN (ARNi) es un medio para silenciar genes mediante la degradación del ARNm. [5] La inhibición de genes mediante este método se logra introduciendo pequeños ARN interferentes de doble cadena (ARNip) en el citoplasma. Los ARN interferentes pequeños pueden originarse en el interior de la célula o pueden introducirse exógenamente en la célula. Una vez introducidos en la célula, los ARNip exógenos son procesados ​​por el complejo de silenciamiento inducido por ARN ( RISC ). [6] El ARNip es complementario al ARNm objetivo que se va a silenciar, y el RISC utiliza el ARNip como plantilla para localizar el ARNm objetivo. Después de que el RISC se localiza en el ARNm objetivo, el ARN es escindido por una ribonucleasa.

La interferencia de ARN se utiliza ampliamente como técnica de laboratorio para el análisis funcional genético. [7] La ​​interferencia de ARN en organismos como C. elegans y Drosophila melanogaster proporciona un medio rápido y económico de investigar la función genética. En la investigación de C. elegans , la disponibilidad de herramientas como la biblioteca de interferencia de ARN de Ahringer ofrece a los laboratorios una forma de probar muchos genes en una variedad de contextos experimentales. Los conocimientos obtenidos del uso experimental de la interferencia de ARN pueden ser útiles para identificar posibles objetivos terapéuticos, el desarrollo de fármacos u otras aplicaciones. [8] La interferencia de ARN es una herramienta de investigación muy útil, que permite a los investigadores realizar grandes exámenes genéticos en un esfuerzo por identificar objetivos para futuras investigaciones relacionadas con una vía, un fármaco o un fenotipo en particular. [9] [10]

CRISPR

Un medio diferente de silenciar el ADN exógeno que se ha descubierto en procariotas es un mecanismo que involucra loci llamados "Repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas" o CRISPRs . [11] Los genes asociados a CRISPR (cas) codifican la maquinaria celular que corta el ADN exógeno en pequeños fragmentos y los inserta en un locus de repetición CRISPR. Cuando esta región CRISPR del ADN es expresada por la célula, los pequeños ARN producidos a partir de los insertos de ADN exógeno sirven como una secuencia de plantilla que otras proteínas Cas usan para silenciar esta misma secuencia exógena. Las transcripciones de las secuencias exógenas cortas se usan como guía para silenciar estos ADN extraños cuando están presentes en la célula. Esto sirve como una especie de inmunidad adquirida, y este proceso es como un mecanismo de interferencia de ARN procariota. Las repeticiones CRISPR se conservan en muchas especies y se ha demostrado que se pueden utilizar en células humanas, [12] bacterias, [13] C. elegans , [14] pez cebra , [15] y otros organismos para la manipulación eficaz del genoma. El uso de CRISPR como herramienta de investigación versátil se puede ilustrar [16] con muchos estudios que lo utilizan para generar organismos con alteraciones del genoma.

TALEN

Otra tecnología que se hace posible gracias a la manipulación del genoma procariota es el uso de nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción ( TALEN ) para dirigirse a genes específicos. [17] Las TALEN son nucleasas que tienen dos componentes funcionales importantes: un dominio de unión al ADN y un dominio de escisión del ADN. El dominio de unión al ADN es una secuencia efectora similar a un activador de la transcripción específica de la secuencia, mientras que el dominio de escisión del ADN se origina a partir de una endonucleasa bacteriana y no es específico. Las TALEN se pueden diseñar para escindir una secuencia especificada por la secuencia de la porción efectora similar a un activador de la transcripción del constructo. Una vez diseñada, una TALEN se introduce en una célula como un plásmido o ARNm. La TALEN se expresa, se localiza en su secuencia objetivo y escinde un sitio específico. Después de la escisión de la secuencia de ADN objetivo por la TALEN, la célula utiliza la unión de extremos no homólogos como un mecanismo de reparación del ADN para corregir la escisión. El intento de la célula de reparar la secuencia escindida puede hacer que la proteína codificada deje de ser funcional, ya que este mecanismo de reparación introduce errores de inserción o eliminación en el sitio reparado.

Comercialización

Hasta ahora, los organismos knockdown con alteraciones permanentes en su ADN se han diseñado principalmente con fines de investigación. También conocidos simplemente como knockdowns , estos organismos se utilizan con mayor frecuencia para la genética inversa, especialmente en especies como ratones o ratas para las que las tecnologías de knockdown transitorio no se pueden aplicar fácilmente. [3] [18]

Hay varias empresas que ofrecen servicios comerciales relacionados con tratamientos de derribo genético.

Véase también

Referencias

  1. ^ abc Summerton JE (2007). "Comparación de morfolino, ARNi y ADN-S: impacto de la estructura y el mecanismo de acción en los efectos fuera del objetivo y la especificidad de la secuencia". Temas actuales en química medicinal . 7 (7): 651–60. doi :10.2174/156802607780487740. PMID  17430206. S2CID  12241724.
  2. ^ Summerton J (diciembre de 1999). "Oligómeros antisentido de morfolino: el caso de un tipo estructural independiente de la ARNasa H". Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Estructura y expresión génica . 1489 (1): 141–58. doi :10.1016/S0167-4781(99)00150-5. PMID  10807004.
  3. ^ ab Nasevicius A, Ekker SC (octubre de 2000). "Eliminación eficaz de genes específicos en el pez cebra". Nature Genetics . 26 (2): 216–20. doi :10.1038/79951. PMID  11017081. S2CID  21451111.
  4. ^ Wahlestedt, Claes (febrero de 1994). "Estrategias de oligonucleótidos antisentido en neurofarmacología". Trends Pharmacol Sci . 15 (2): 42–6. doi :10.1016/0165-6147(94)90107-4. PMID  8165722.
  5. ^ Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC (febrero de 1998). "Interferencia genética potente y específica por ARN bicatenario en Caenorhabditis elegans". Nature . 391 (6669): 806–11. Bibcode :1998Natur.391..806F. doi :10.1038/35888. PMID  9486653. S2CID  4355692.
  6. ^ Pratt AJ, MacRae IJ (julio de 2009). "El complejo silenciador inducido por ARN: una máquina versátil de silenciamiento de genes". The Journal of Biological Chemistry . 284 (27): 17897–901. doi : 10.1074/jbc.R900012200 . PMC 2709356 . PMID  19342379. 
  7. ^ Fraser AG, Kamath RS, Zipperlen P, Martinez-Campos M, Sohrmann M, Ahringer J (noviembre de 2000). "Análisis genómico funcional del cromosoma I de C. elegans mediante interferencia sistemática de ARN". Nature . 408 (6810): 325–30. Bibcode :2000Natur.408..325F. doi :10.1038/35042517. PMID  11099033. S2CID  4373444.
  8. ^ Aagaard L, Rossi JJ (marzo de 2007). "Terapéutica de ARNi: principios, perspectivas y desafíos". Advanced Drug Delivery Reviews . 59 (2–3): 75–86. doi :10.1016/j.addr.2007.03.005. PMC 1978219 . PMID  17449137. 
  9. ^ Kamath RS, Ahringer J (agosto de 2003). "Examen de detección de ARNi en todo el genoma en Caenorhabditis elegans". Métodos . 30 (4): 313–21. doi :10.1016/S1046-2023(03)00050-1. PMID  12828945.
  10. ^ Ghadakzadeh S, Mekhail M, Aoude A, Hamdy R, Tabrizian M (marzo de 2016). "Los pequeños jugadores dominan el juego difícil: ARNi en la regeneración ósea". Revista de investigación ósea y mineral . 31 (3): 475–87. doi : 10.1002/jbmr.2816 . PMID  26890411.
  11. ^ Gilbert LA, Larson MH, Morsut L, Liu Z, Brar GA, Torres SE, Stern-Ginossar N, Brandman O, Whitehead EH, Doudna JA, Lim WA, Weissman JS, Qi LS (julio de 2013). "Regulación de la transcripción guiada por ARN modular mediada por CRISPR en eucariotas". Cell . 154 (2): 442–51. doi :10.1016/j.cell.2013.06.044. PMC 3770145 . PMID  23849981. 
  12. ^ Esvelt KM, Mali P, Braff JL, Moosburner M, Yaung SJ, Church GM (noviembre de 2013). "Proteínas Cas9 ortogonales para la regulación y edición de genes guiada por ARN" (PDF) . Nature Methods . 10 (11): 1116–21. doi :10.1038/nmeth.2681. PMC 3844869. PMID  24076762 . 
  13. ^ Jiang W, Bikard D, Cox D, Zhang F, Marraffini LA (marzo de 2013). "Edición guiada por ARN de genomas bacterianos utilizando sistemas CRISPR-Cas". Nature Biotechnology . 31 (3): 233–9. doi :10.1038/nbt.2508. PMC 3748948 . PMID  23360965. 
  14. ^ Chen C, Fenk LA, de Bono M (noviembre de 2013). "Edición eficiente del genoma en Caenorhabditis elegans mediante recombinación homóloga dirigida por CRISPR". Nucleic Acids Research . 41 (20): e193. doi :10.1093/nar/gkt805. PMC 3814388 . PMID  24013562. 
  15. ^ Hisano Y, Ota S, Kawahara A (enero de 2014). "Edición genómica mediante nucleasas artificiales específicas de sitio en pez cebra". Desarrollo, crecimiento y diferenciación . 56 (1): 26–33. doi : 10.1111/dgd.12094 . PMID  24117409.
  16. ^ Gennequin B, Otte DM, Zimmer A (noviembre de 2013). "Las roturas de doble cadena inducidas por CRISPR/Cas aumentan la frecuencia de reemplazos de genes para humanizar el gen Cnr2 del ratón". Biochemical and Biophysical Research Communications . 441 (4): 815–9. doi :10.1016/j.bbrc.2013.10.138. PMID  24211574.
  17. ^ Sun N, Zhao H (julio de 2013). "Nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN): una herramienta altamente eficiente y versátil para la edición del genoma". Biotecnología y bioingeniería . 110 (7): 1811–21. doi :10.1002/bit.24890. PMID  23508559. S2CID  6214542.
  18. ^ "Células que inactivan genes adenovirales". Sirion Biotech. Archivado desde el original el 9 de julio de 2013. Consultado el 17 de abril de 2013 .
  • "Recursos de ingeniería genómica CRISPR". Broad Institute.
  • "Mojo Hand: diseña tus propios TALEN". Clínica Mayo.
  • "TALEN Effector Nucleotide Targeter 2.0". Universidad de Cornell.
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