Virus adenoasociado
Especies de virus

Virus adenoasociado
Estructura del virus adenoasociado de serotipo 2 de 1LP3. Se muestra un eje quíntuple en el centro.
Estructura del virus adenoasociado de serotipo 2 de 1LP3. Se muestra un eje quíntuple en el centro.
Clasificación científicaEditar esta clasificación
(sin clasificar):Virus
Reino :Monodnaviria
Reino:Shotokuvirae
Filo:Cosaviricota
Clase:Quintoviricetes
Orden:Piccovirus
Familia:Parvovirus
Subfamilia:Parvovirinae
Género:Dependoparvovirus
Virus incluidos:
  • Dependencia del parvovirus adenoasociado tipo A
  • Dependencia del parvovirus B adenoasociada

Los virus adenoasociados ( AAV ) son virus pequeños que infectan a los humanos y a algunas otras especies de primates . Pertenecen al género Dependoparvovirus , que a su vez pertenece a la familia Parvoviridae . Son virus pequeños (de aproximadamente 26 nm de diámetro) , defectuosos en la replicación , sin envoltura y con un genoma de ADN monocatenario lineal (ssDNA) de aproximadamente 4,8 kilobases (kb). [1] [2]

Varias características hacen que el AAV sea un candidato atractivo para crear vectores virales para terapia génica y para la creación de modelos isogénicos de enfermedades humanas . [3] Los vectores de terapia génica que utilizan AAV pueden infectar tanto células en división como células quiescentes y persistir en un estado extracromosómico sin integrarse en el genoma de la célula huésped. Sin embargo, en el virus nativo, sí se produce la integración de los genes transportados por el virus en el genoma del huésped. [4] La integración puede ser importante para ciertas aplicaciones, pero también puede tener consecuencias no deseadas. Los ensayos clínicos humanos recientes que utilizan AAV para terapia génica en la retina han demostrado ser prometedores. [5]

En marzo de 2023, una serie de artículos de Nature detectaron altos títulos de virus adenoasociado 2 (AAV2), junto con adenovirus y herpesvirus, en muestras de una ola de hepatitis infantil. [6] Un artículo sugirió que la coinfección con AAV2 puede contribuir a una enfermedad hepática más grave que la infección solo con adenovirus o herpesvirus y que el vínculo causal aún está por establecer. [7]

Historia

El virus adenoasociado (AAV), que anteriormente se consideraba un contaminante de las preparaciones de adenovirus, fue identificado por primera vez como un dependoparvovirus en la década de 1960 en los laboratorios de Bob Atchison en Pittsburgh y Wallace Rowe en el NIH . Estudios serológicos en humanos indicaron posteriormente que, a pesar de estar presente en personas infectadas por virus auxiliares como el adenovirus o el virus del herpes, el AAV en sí no causaba ninguna enfermedad. [8]

Uso en terapia génica

Ventajas y desventajas

El AAV de tipo salvaje ha atraído un interés considerable por parte de los investigadores de la terapia génica debido a una serie de características. La principal de ellas era la aparente falta de patogenicidad del virus. También puede infectar células que no se dividen y tiene la capacidad de integrarse de forma estable en el genoma de la célula huésped en un sitio específico (designado AAVS1) en el cromosoma humano 19. [ 9] [10] Esta característica lo hace algo más predecible que los retrovirus , que presentan la amenaza de una inserción aleatoria y de mutagénesis, que a veces es seguida por el desarrollo de un cáncer. El genoma del AAV se integra con mayor frecuencia en el sitio mencionado, mientras que las incorporaciones aleatorias en el genoma tienen lugar con una frecuencia insignificante. Sin embargo, el desarrollo de los AAV como vectores de terapia génica ha eliminado esta capacidad integradora mediante la eliminación de la rep y la cap del ADN del vector. El gen deseado junto con un promotor para impulsar la transcripción del gen se inserta entre las repeticiones terminales invertidas (ITR) que ayudan en la formación de concatémeros en el núcleo después de que el ADN del vector monocatenario se convierte por los complejos de ADN polimerasa de la célula huésped en ADN bicatenario. Los vectores de terapia génica basados ​​en AAV forman concatémeros episomales en el núcleo de la célula huésped. En las células que no se dividen, estos concatémeros permanecen intactos durante la vida de la célula huésped. En las células que se dividen, el ADN de AAV se pierde a través de la división celular, ya que el ADN episomal no se replica junto con el ADN de la célula huésped. [11] La integración aleatoria del ADN de AAV en el genoma del huésped es detectable, pero ocurre con una frecuencia muy baja. [11] Los AAV también presentan una inmunogenicidad muy baja , aparentemente restringida a la generación de anticuerpos neutralizantes , mientras que no inducen una respuesta citotóxica claramente definida . [12] [13] [14] Esta característica, junto con la capacidad de infectar células quiescentes , presenta su dominio sobre los adenovirus como vectores para la terapia génica humana . [ cita requerida ]

El uso del virus presenta algunas desventajas. La capacidad de clonación del vector es relativamente limitada y la mayoría de los genes terapéuticos requieren la sustitución completa del genoma de 4,8 kilobases del virus. Por lo tanto, los genes grandes no son adecuados para su uso en un vector AAV estándar. Actualmente se están explorando opciones para superar la capacidad de codificación limitada. [15] Los ITR de AAV de dos genomas pueden hibridarse para formar concatémeros de cabeza a cola, lo que casi duplica la capacidad del vector. La inserción de sitios de empalme permite la eliminación de los ITR de la transcripción. [ cita requerida ]

Debido a las ventajas de la terapia génica especializada del AAV, los investigadores han creado una versión alterada del AAV denominada virus adenoasociado autocomplementario (scAAV) . Mientras que el AAV empaqueta una sola cadena de ADN y debe esperar a que se sintetice su segunda cadena, el scAAV empaqueta dos cadenas más cortas que son complementarias entre sí. Al evitar la síntesis de la segunda cadena, el scAAV puede expresarse más rápidamente, aunque como advertencia, el scAAV solo puede codificar la mitad de la capacidad ya limitada del AAV. [16] Informes recientes sugieren que los vectores scAAV son más inmunogénicos que los vectores de adenovirus monocatenarios, lo que induce una activación más fuerte de los linfocitos T citotóxicos . [17]

Se cree que la inmunidad humoral instigada por la infección con el tipo salvaje es común. La actividad neutralizante asociada limita la utilidad del serotipo AAV2 más comúnmente utilizado en ciertas aplicaciones. En consecuencia, la mayoría de los ensayos clínicos en curso implican la administración de AAV2 en el cerebro, un órgano inmunológicamente relativamente privilegiado. En el cerebro, el AAV2 es fuertemente específico de las neuronas. [ cita requerida ]

Ensayos clínicos

A partir de 2019, los vectores AAV se han utilizado en más de 250 ensayos clínicos en todo el mundo, aproximadamente el 8,3% de los ensayos de terapia génica con vectores virales. [18] Recientemente, se han obtenido resultados prometedores de los ensayos de fase 1 y fase 2 para una serie de enfermedades, incluidas la amaurosis congénita de Leber , [5] [19] [20] la hemofilia , [21] la insuficiencia cardíaca congestiva , [22] la atrofia muscular espinal , [23] la deficiencia de lipoproteína lipasa , [24] y la enfermedad de Parkinson . [25]

Ensayos clínicos seleccionados que utilizan vectores basados ​​en AAV [26]
IndicaciónGeneVía de administraciónFaseNúmero de sujetoEstado
Fibrosis quísticaCFTRPulmón, vía aerosolI12Completo
CFTRPulmón, vía aerosolII38Completo
CFTRPulmón, vía aerosolII100Completo
Hemofilia BARREGLARIntramuscularI9Completo
ARREGLARArteria hepáticaI6Terminado
ArtritisTNFR:FcIntraarticularI1En curso
Enfisema hereditarioAATIntramuscularI12En curso
Amaurosis congénita de LeberRPE65SubretinianoYo-yoMúltipleVarios en curso y completos ( voretigene neparvovec )
Degeneración macular relacionada con la edadsFlt-1SubretinianoYo-yo24En curso
Distrofia muscular de DuchenneSGCIntramuscularI10En curso
Enfermedad de ParkinsonGAD65 , GAD67IntracranealI12Completa [27]
Enfermedad de CanavanCAAIntracranealI21En curso
Enfermedad de BattenCLN2IntracranealI10En curso
Enfermedad de AlzheimerFGNIntracranealI6En curso
Atrofia muscular espinalSMN1Intravenosa, intratecalYo–III150+Varios en curso y completos ( onasemnogene abeparvovec )
Insuficiencia cardíaca congestivaSERCA 2aIntracoronarioIIb250En curso

Biología fundamental

Dos partículas de adenovirus rodeadas de numerosos virus adenoasociados más pequeños (microscopía electrónica con tinción negativa, aumento de aproximadamente 200.000×)

Genómica, transcriptómica y proteómica

El genoma del AAV está formado por ácido desoxirribonucleico monocatenario (ss ADN ), de sentido positivo o negativo, que tiene una longitud de aproximadamente 4,7 kilobases. El genoma comprende ITR en ambos extremos de la cadena de ADN y dos marcos de lectura abiertos (ORF): rep y cap . El primero está compuesto por cuatro genes superpuestos que codifican las proteínas Rep necesarias para el ciclo de vida del AAV, y el segundo contiene secuencias de nucleótidos superpuestas de proteínas de la cápside : VP1, VP2 y VP3, que interactúan para formar una cápside con simetría icosaédrica. [28]

Secuencias ITR

Las secuencias de repetición terminal invertida (ITR) comprenden 145 bases cada una. Se denominaron así debido a su simetría, que se demostró que es necesaria para la multiplicación eficiente del genoma de AAV. [29] La característica de estas secuencias que les da esta propiedad es su capacidad para formar una horquilla , que contribuye al llamado autocebado que permite la síntesis independiente de primasa de la segunda cadena de ADN. También se demostró que las ITR son necesarias tanto para la integración del ADN de AAV en el genoma de la célula huésped (cromosoma 19 en humanos) como para el rescate de este, [30] [31] así como para la encapsidación eficiente del ADN de AAV combinada con la generación de partículas de AAV completamente ensambladas y resistentes a la desoxirribonucleasa . [32]

En lo que respecta a la terapia génica, las ITR parecen ser las únicas secuencias necesarias en cis junto al gen terapéutico: las proteínas estructurales ( cap ) y de empaquetamiento ( rep ) pueden administrarse en trans . Con esta suposición se establecieron muchos métodos para la producción eficiente de vectores AAV recombinantes (rAAV) que contienen un gen reportero o terapéutico. Sin embargo, también se publicó que las ITR no son los únicos elementos necesarios en cis para la replicación y encapsidación efectivas. Algunos grupos de investigación han identificado una secuencia denominada elemento dependiente de Rep que actúa en cis (CARE) dentro de la secuencia codificante del gen rep . Se demostró que CARE aumenta la replicación y la encapsidación cuando está presente en cis . [33] [34] [35] [36]

repsGen y proteínas Rep

En el "lado izquierdo" del genoma hay dos promotores llamados p5 y p19, a partir de los cuales se pueden producir dos ácidos ribonucleicos mensajeros ( ARNm ) superpuestos de diferente longitud. Cada uno de ellos contiene un intrón que puede ser eliminado o no. Dadas estas posibilidades, se pueden sintetizar cuatro ARNm diferentes y, en consecuencia, cuatro proteínas Rep diferentes con secuencia superpuesta. Sus nombres representan sus tamaños en kilodaltons (kDa): Rep78, Rep68, Rep52 y Rep40. [37] Rep78 y 68 pueden unirse específicamente a la horquilla formada por el ITR en el acto de autocebado y escindirse en una región específica, designada sitio de resolución terminal, dentro de la horquilla. También se demostró que son necesarios para la integración específica de AAVS1 del genoma de AAV. Se demostró que las cuatro proteínas Rep se unen al ATP y poseen actividad helicasa . También se demostró que regulan positivamente la transcripción del promotor p40 (mencionado a continuación), pero regulan negativamente los promotores p5 y p19. [31] [37] [38] [39] [40] [41]

tapaGen y proteínas VP

El lado derecho de un genoma de AAV con detección positiva codifica secuencias superpuestas de tres proteínas de la cápside, VP1, VP2 y VP3, y dos proteínas accesorias, MAAP y AAP, que comienzan a partir de un promotor, designado p40. Los pesos moleculares de estas proteínas son 87, 72 y 62 kiloDaltons, respectivamente. [42] La cápside de AAV está compuesta por una mezcla de VP1, VP2 y VP3 que suman 60 monómeros dispuestos en simetría icosaédrica en una proporción de 1:1:10, [43] con una masa vacía de aproximadamente 3,8 MDa . [44] La estructura cristalina de la proteína VP3 fue determinada por Xie, Bue, et al. [45]

Cápside de AAV2, mostrada como un diagrama de cinta , con la mitad posterior oculta para mayor claridad. Se muestra un eje de simetría quíntuple en el centro.

El gen cap produce una proteína adicional no estructural llamada proteína activadora del ensamblaje (AAP). Esta proteína se produce a partir de ORF2 y es esencial para el proceso de ensamblaje de la cápside. [46] La función exacta de esta proteína en el proceso de ensamblaje y su estructura no se han resuelto hasta la fecha. [ cita requerida ]

Los tres VP se traducen a partir de un ARNm. Después de sintetizar este ARNm, se puede empalmar de dos maneras diferentes: se puede escindir un intrón más largo o más corto, lo que da como resultado la formación de dos grupos de ARNm: un grupo de ARNm de 2,3 kb y otro de 2,6 kb de longitud. Por lo general, especialmente en presencia de adenovirus, se prefiere el intrón más largo, por lo que el ARNm de 2,3 kb de longitud representa el llamado "empalme mayor". En esta forma, se corta el primer codón AUG , a partir del cual comienza la síntesis de la proteína VP1, lo que da como resultado un nivel general reducido de síntesis de la proteína VP1. El primer codón AUG que permanece en el empalme mayor es el codón de iniciación de la proteína VP3. Sin embargo, aguas arriba de ese codón en el mismo marco de lectura abierto se encuentra una secuencia ACG (que codifica treonina) que está rodeada por un contexto Kozak óptimo . Esto contribuye a un bajo nivel de síntesis de la proteína VP2, que en realidad es la proteína VP3 con residuos N terminales adicionales, al igual que VP1. [47] [48] [49] [50]

Dado que se prefiere el intrón más grande para ser empalmado, y dado que en el empalme mayor el codón ACG es una señal de inicio de la traducción mucho más débil, la proporción en la que las proteínas estructurales de AAV se sintetizan in vivo es de aproximadamente 1:1:20, que es la misma que en la partícula de virus madura. [51] Se ha demostrado que el fragmento único en el extremo N de la proteína VP1 posee la actividad de fosfolipasa A2 (PLA2), que probablemente se requiere para la liberación de partículas de AAV de los endosomas tardíos . [52] Muralidhar et al. informaron que VP2 y VP3 son cruciales para el ensamblaje correcto del virión. [49] Más recientemente, sin embargo, Warrington et al. demostraron que VP2 es innecesario para la formación completa de partículas de virus y una infectividad eficiente, y también presentaron que VP2 puede tolerar grandes inserciones en su extremo N, mientras que VP1 no puede, probablemente debido a la presencia del dominio PLA2. [53]

Modificaciones postraduccionales

Descubrimientos recientes realizados mediante el uso de enfoques 'ómicos de alto rendimiento incluyen el hecho de que las cápsides de AAV se modifican postraduccionalmente (PTM) durante la producción, como la acetilación, metilación, fosforilación, desamidación, O-glicanilación [54] y sumoilación en las proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3. Estas PTM difieren según la plataforma de producción de fabricación. Otro de estos descubrimientos es el hecho de que los genomas de AAV se metilan epigenéticamente durante la producción. Además del precio, estos hallazgos podrían afectar la cinética de expresión, la unión al receptor de rAAV, el tráfico, la inmunogenicidad del vector y la durabilidad de la expresión. [55] [56]

Clasificación, serotipos, receptores y tropismo nativo

En humanos
SerotipoTropismo tisular [57]Pasar la barrera hematoencefálicaTropismo celularSintéticoComentarioLímite publicado / reputación
2músculo liso, SNC, hígadoNoNo
5SNC, músculo lisoNoNo
8SNC, cerebro, hígado, músculo lisoNoNo
9SNC, hígado, músculo lisoSíNo
PAL2Sistema nervioso centralSíSíLa expresión hepática es 1/4 de AAV9No
9P1/AAVMYOSistema nervioso centralSíastrocitosSíMusculatura alta que incluye músculo esquelético, corazón y diafragma. Transducción esquelética.No

En 2013, el Comité Internacional de Taxonomía de Virus reconoció dos especies de AAV : el dependoparvovirus adenoasociado A (anteriormente AAV-1, −2, −3 y −4) y el dependoparvovirus adenoasociado B (anteriormente AAV-5). [58]

Hasta la década de 1990, prácticamente toda la biología del AAV se estudiaba utilizando el serotipo 2 del AAV. Sin embargo, el AAV es muy prevalente en humanos y otros primates y se han aislado varios serotipos de varias muestras de tejido. Los serotipos 2, 3, 5 y 6 se descubrieron en células humanas, los serotipos 1, 4 y 7-11 del AAV en muestras de primates no humanos. [59] Hasta 2006 se han descrito 11 serotipos de AAV , el undécimo en 2004. [60] Las proteínas de la cápside del AAV contienen 12 regiones de superficie hipervariables, y la mayor parte de la variabilidad se produce en los picos proximales triples, pero el genoma del parvovirus en general presenta genes estructurales y de replicación altamente conservados en todos los serotipos. [59] Todos los serotipos conocidos pueden infectar células de múltiples tipos de tejidos diversos. La especificidad del tejido está determinada por el serotipo de la cápside y la pseudotipificación de los vectores AAV para alterar su rango de tropismo probablemente será importante para su uso en terapia.

Serotipo 2

El serotipo 2 (AAV2) ha sido el más ampliamente examinado hasta ahora. [61] [62] [63] [64] [65] [66] AAV2 presenta tropismo natural hacia los músculos esqueléticos , [67] neuronas , [61] células musculares lisas vasculares [68] y hepatocitos . [69]

Se han descrito tres receptores celulares para AAV2: el proteoglicano de heparán sulfato (HSPG), una integrina V β 5 y el receptor 1 del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR-1). El primero funciona como un receptor primario, mientras que los dos últimos tienen una actividad de correceptor y permiten que AAV entre en la célula por endocitosis mediada por receptor . [70] [71] [72] Estos resultados del estudio han sido cuestionados por Qiu, Handa, et al. [73] HSPG funciona como el receptor primario, aunque su abundancia en la matriz extracelular puede eliminar partículas de AAV y perjudicar la eficiencia de la infección. [74]

Los estudios han demostrado que el serotipo 2 del virus (AAV-2) aparentemente mata las células cancerosas sin dañar las sanas. "Nuestros resultados sugieren que el virus adenoasociado tipo 2, que infecta a la mayoría de la población pero no tiene efectos nocivos conocidos, mata múltiples tipos de células cancerosas pero no tiene efecto sobre las células sanas", dijo Craig Meyers, [75] profesor de inmunología y microbiología en la Facultad de Medicina de Penn State en Pensilvania en 2005. [76] Esto podría conducir al desarrollo de un nuevo agente anticanceroso.

En marzo de 2023, una serie de artículos de Nature vincularon la infección del virus adenoasociado 2 (AAV2) con una ola de hepatitis infantil. [6]

Otros serotipos

Aunque el AAV2 es el serotipo más popular en diversas investigaciones basadas en AAV, se ha demostrado que otros serotipos pueden ser más eficaces como vectores de administración de genes. El AAV9 pasa la barrera hematoencefálica en humanos, el AAV6 parece ser mucho mejor en la infección de células epiteliales de las vías respiratorias, [77] [78] El AAV7 presenta una tasa de transducción muy alta de células musculares esqueléticas murinas (similar al AAV1 y AAV5), el AAV8 transduce hepatocitos [79] [80] [81] y se ha demostrado que el AAV1 y el 5 son muy eficientes en la administración de genes a las células endoteliales vasculares. [82] En el cerebro, la mayoría de los serotipos de AAV muestran tropismo neuronal, mientras que el AAV5 también transduce astrocitos. [83] El AAV6, un híbrido de AAV1 y AAV2, [81] también muestra una inmunogenicidad menor que el AAV2. [80]

Los serotipos pueden diferir en cuanto a los receptores a los que se unen. Por ejemplo, la transducción de AAV4 y AAV5 puede ser inhibida por ácidos siálicos solubles (de forma diferente para cada uno de estos serotipos), [84] y se ha demostrado que AAV5 ingresa a las células a través del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas . [85]

Serotipos sintéticos

Se han hecho muchos esfuerzos para diseñar y mejorar nuevas variantes de AAV tanto para fines clínicos como de investigación. Dichas modificaciones incluyen nuevos tropismos para dirigirse a tejidos específicos y residuos superficiales modificados para evadir la detección por parte del sistema inmunológico. Además de optar por cepas particulares de AAV recombinante (rAAV) para dirigirse a células particulares, los investigadores también han explorado la pseudotipificación de AAV, la práctica de crear híbridos de ciertas cepas de AAV para acercarse a un objetivo aún más refinado. El híbrido se crea tomando una cápside de una cepa y el genoma de otra cepa. Por ejemplo, la investigación con AAV2/5, un híbrido con el genoma de AAV2 y la cápside de AAV5, pudo lograr más precisión y rango en las células cerebrales de lo que AAV2 podría lograr sin hibridar. Los investigadores han seguido experimentando con la pseudotipificación mediante la creación de cepas con cápsides híbridas. AAV-DJ tiene una cápside híbrida de ocho cepas diferentes de AAV; Como tal, puede infectar diferentes células en muchas áreas del cuerpo, una propiedad que una sola cepa de AAV con un tropismo limitado no tendría. [86] Otros esfuerzos para diseñar y mejorar nuevas variantes de AAV han involucrado la reconstrucción ancestral de variantes del virus para generar nuevos vectores con propiedades mejoradas para aplicaciones clínicas y el estudio de la biología de AAV. [87]

Inmunología

El AAV es de particular interés para los terapeutas genéticos debido a su aparente capacidad limitada para inducir respuestas inmunes en humanos, un factor que debería influir positivamente en la eficiencia de la transducción del vector al tiempo que reduce el riesgo de cualquier patología asociada al sistema inmunológico .

No se considera que el AAV tenga ningún papel conocido en la enfermedad. [88] Sin embargo, la respuesta del sistema inmunitario del huésped y la tolerancia inmunitaria reducen la eficacia de la terapia génica mediada por AAV. Se ha demostrado que la respuesta inmunitaria del huésped responde a los vectores AAV, las células transducidas y las proteínas transducidas. [89] La respuesta inmunitaria se puede subdividir en dos categorías: innata y adaptativa, la última de las cuales se divide en humoral y mediada por células. [90] [91]

Innato

La respuesta inmunitaria innata a los vectores AAV se ha caracterizado en modelos animales. La administración intravenosa en ratones provoca la producción transitoria de citocinas proinflamatorias y cierta infiltración de neutrófilos y otros leucocitos en el hígado, lo que parece secuestrar un gran porcentaje de las partículas virales inyectadas. Tanto los niveles de factor soluble como la infiltración celular parecen volver a los valores basales en seis horas. Por el contrario, los virus más agresivos producen respuestas innatas que duran 24 horas o más. [92]

Los estudios in vivo indican que los vectores AAV interactúan con las vías del receptor tipo Toll (TLR)9 y TLR2-MyD88 para desencadenar la respuesta inmunitaria innata estimulando la producción de interferones. [93] Se ha demostrado que los ratones deficientes en TLR9 son más receptivos al tratamiento con AAV y demuestran niveles más altos de expresión transgénica [94].

Humorístico

Debido a una infección natural previa, muchas personas tienen anticuerpos neutralizantes (NAb) preexistentes contra los AAV, lo que puede dificultar significativamente su aplicación en la terapia génica. [95] Aunque los AAV son muy variables entre las variantes de tipo salvaje y sintéticas, los sitios de reconocimiento de anticuerpos pueden estar conservados evolutivamente. [96]

Se sabe que el virus genera una inmunidad humoral robusta en modelos animales y en la población humana, donde se cree que hasta el 80% de los individuos son seropositivos para AAV2. Se sabe que los anticuerpos son neutralizantes y, para aplicaciones de terapia génica, estos afectan la eficiencia de la transducción del vector a través de algunas vías de administración. Además de los niveles persistentes de anticuerpos específicos de AAV, parece que, tanto en estudios de sensibilización y refuerzo en animales como en ensayos clínicos, la memoria de las células B también es fuerte. [97] En humanos seropositivos, los anticuerpos IgG circulantes para AAV2 parecen estar compuestos principalmente por las subclases IgG1 e IgG2, con poca o ninguna presencia de IgG3 o IgG4. [98]

Mediada por células

La respuesta mediada por células al virus y a los vectores está poco caracterizada y ha sido ampliamente ignorada en la literatura hasta 2005. [97] Los ensayos clínicos que utilizan un vector basado en AAV2 para tratar la hemofilia B parecen indicar que puede estar ocurriendo una destrucción dirigida de las células transducidas. [99] Combinado con datos que muestran que las células T CD8+ pueden reconocer elementos de la cápside de AAV in vitro , [100] parece que puede haber una respuesta de linfocitos T citotóxicos a los vectores de AAV. Las respuestas citotóxicas implicarían la participación de las células T auxiliares CD4+ en la respuesta a AAV y los datos in vitro de estudios humanos sugieren que el virus puede de hecho inducir tales respuestas, incluidas las respuestas de memoria Th1 y Th2. [98] Se han identificado varios epítopos candidatos estimulantes de células T dentro de la proteína VP1 de la cápside de AAV, que pueden ser objetivos atractivos para la modificación de la cápside si el virus se va a utilizar como vector para terapia génica. [98] [99]

Ciclo de infección

Hay varios pasos en el ciclo de infección del AAV, desde la infección de una célula hasta la producción de nuevas partículas infecciosas: [ cita requerida ]

  1. Adhesión a la membrana celular
  2. endocitosis mediada por receptores
  3. tráfico endosómico
  4. escapar del endosoma tardío o lisosoma
  5. translocación al núcleo
  6. Sin revestimiento
  7. Formación de la forma replicativa del ADN bicatenario del genoma del AAV
  8. expresión de genes rep
  9. replicación del genoma
  10. Expresión de genes cap , síntesis de partículas de ssDNA de progenie
  11. ensamblaje de viriones completos , y
  12. liberación de la célula infectada.

Algunos de estos pasos pueden ser diferentes en distintos tipos de células, lo que, en parte, contribuye al tropismo nativo definido y bastante limitado del AAV. La replicación del virus también puede variar en un tipo de célula, dependiendo de la fase actual del ciclo celular de la célula . [101]

La característica característica del virus adenoasociado es una deficiencia en la replicación y, por lo tanto, su incapacidad para multiplicarse en células no afectadas. El virus adenoasociado se propaga mediante la coinfección de una célula con un virus auxiliar. El primer virus auxiliar que se describió como generador de nuevas partículas de AAV fue el adenovirus, del que se originó el nombre AAV. Luego se demostró que la replicación de AAV puede ser facilitada por proteínas seleccionadas derivadas del genoma del adenovirus, [102] [103] por otros virus como HSV [104] o vaccinia, o por agentes genotóxicos, como la irradiación UV o la hidroxiurea . [105] [106] [107] Dependiendo de la presencia o ausencia de un virus auxiliar, el ciclo de vida del AAV sigue una vía lítica o lisogénica, respectivamente. [108] Si hay un virus auxiliar, la expresión génica del AAV se activa, lo que permite que el virus se replique utilizando la polimerasa de la célula huésped. Cuando el virus auxiliar mata a la célula huésped, se liberan los nuevos viriones del AAV. Si no hay un virus auxiliar presente, el AAV exhibe un comportamiento lisogénico. Cuando el AAV infecta una célula solo, su expresión genética se reprime (el AAV no se replica) y su genoma se incorpora al genoma del huésped (en el cromosoma humano 19). En casos raros, la lisis puede ocurrir sin un virus auxiliar, pero por lo general el AAV no puede replicarse y matar una célula por sí solo. [109]

Matsushita, Ellinger et al. descubrieron el conjunto mínimo de genes adenovirales necesarios para la generación eficiente de partículas de AAV progenie. [102] Este descubrimiento permitió nuevos métodos de producción de AAV recombinantes, que no requieren coinfección adenoviral de las células productoras de AAV. En ausencia de virus auxiliares o factores genotóxicos, el ADN de AAV puede integrarse en el genoma del huésped o persistir en forma episomal . En el primer caso, la integración está mediada por las proteínas Rep78 y Rep68 y requiere la presencia de ITR que flanqueen la región que se está integrando. En ratones, se ha observado que el genoma de AAV persiste durante largos períodos de tiempo en tejidos inactivos, como los músculos esqueléticos, en forma episomal (una conformación circular de cabeza a cola). [110]

Véase también

Referencias

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