Microscopio electrónico de barrido
Microscopio electrónico en el que se hace pasar un pequeño haz a través de una muestra.

La imagen de granos de polen tomada con un SEM muestra la profundidad de campo característica de las micrografías SEM.
El primer microscopio electrónico de barrido de M. von Ardenne
SEM con cámara de muestra abierta
SEM de tipo analógico

Un microscopio electrónico de barrido ( SEM ) es un tipo de microscopio electrónico que produce imágenes de una muestra escaneando la superficie con un haz de electrones enfocado . Los electrones interactúan con los átomos de la muestra, produciendo varias señales que contienen información sobre la topografía de la superficie y la composición de la muestra. El haz de electrones se escanea en un patrón de barrido de trama , y ​​la posición del haz se combina con la intensidad de la señal detectada para producir una imagen. En el modo SEM más común, los electrones secundarios emitidos por átomos excitados por el haz de electrones se detectan utilizando un detector de electrones secundarios ( detector Everhart-Thornley ). La cantidad de electrones secundarios que se pueden detectar, y por lo tanto la intensidad de la señal, depende, entre otras cosas, de la topografía de la muestra. Algunos SEM pueden lograr resoluciones mejores que 1 nanómetro.

Las muestras se observan en alto vacío en un SEM convencional, o en bajo vacío o en condiciones húmedas en un SEM de presión variable o ambiental, y en una amplia gama de temperaturas criogénicas o elevadas con instrumentos especializados. [1]

Historia

McMullan ha presentado un relato de la historia temprana de la microscopía electrónica de barrido. [2] [3] Aunque Max Knoll produjo una foto con un ancho de campo de objeto de 50 mm que mostraba el contraste de canalización mediante el uso de un escáner de haz de electrones, [4] fue Manfred von Ardenne quien en 1937 inventó [5] un microscopio de alta resolución al escanear una trama muy pequeña con un haz de electrones demagnificado y finamente enfocado. En el mismo año, Cecil E. Hall también completó la construcción del primer microscopio de emisión en América del Norte, solo dos años después de que se lo encomendara su supervisor, EF Burton en la Universidad de Toronto. [6] Ardenne aplicó el escaneo del haz de electrones en un intento de superar la resolución del microscopio electrónico de transmisión (TEM), así como para mitigar problemas sustanciales con la aberración cromática inherente a la imagen real en el TEM. Además, analizó los diversos modos de detección, posibilidades y teoría del SEM, [7] junto con la construcción del primer SEM de alta resolución . [8] El grupo de Zworykin informó sobre trabajos posteriores , [9] seguidos por los grupos de Cambridge en los años 1950 y principios de los años 1960 [10] [11] [12] [13] encabezados por Charles Oatley , todos los cuales finalmente llevaron a la comercialización del primer instrumento comercial por parte de Cambridge Scientific Instrument Company como "Stereoscan" en 1965, que fue entregado a DuPont .

Principios y capacidades

Fuente de electrones de emisor Schottky
Volumen de interacción electrón-materia y tipos de señales generadas

Las señales que utiliza un microscopio electrónico de barrido para producir una imagen son el resultado de las interacciones del haz de electrones con átomos a distintas profundidades dentro de la muestra. Se producen varios tipos de señales, incluidos electrones secundarios (SE), electrones reflejados o retrodispersados ​​(BSE), rayos X y luz característicos ( catodoluminiscencia ) (CL), corriente absorbida (corriente de la muestra) y electrones transmitidos. Los detectores de electrones secundarios son equipos estándar en todos los microscopios electrónicos de barrido, pero es raro que una sola máquina tenga detectores para todas las demás señales posibles. [ cita requerida ]

Los electrones secundarios tienen energías muy bajas, del orden de 50 eV , lo que limita su trayectoria libre media en materia sólida. En consecuencia, los SE solo pueden escapar de los primeros nanómetros de la superficie de una muestra. La señal de los electrones secundarios tiende a estar muy localizada en el punto de impacto del haz de electrones primarios, lo que permite recopilar imágenes de la superficie de la muestra con una resolución inferior a 1 nm . Los electrones retrodispersados ​​(BSE) son electrones del haz que se reflejan desde la muestra por dispersión elástica . Dado que tienen una energía mucho mayor que los SE, emergen de ubicaciones más profundas dentro de la muestra y, en consecuencia, la resolución de las imágenes BSE es menor que las imágenes SE. Sin embargo, los BSE se utilizan a menudo en SEM analítico, junto con los espectros realizados a partir de los rayos X característicos, porque la intensidad de la señal BSE está fuertemente relacionada con el número atómico (Z) de la muestra. Las imágenes BSE pueden proporcionar información sobre la distribución, pero no sobre la identidad, de los diferentes elementos de la muestra. En muestras compuestas predominantemente de elementos ligeros, como especímenes biológicos, la imagenología BSE puede generar imágenes de inmunomarcadores de oro coloidal de 5 o 10 nm de diámetro, que de otra manera serían difíciles o imposibles de detectar en imágenes de electrones secundarios. [14] Los rayos X característicos se emiten cuando el haz de electrones elimina un electrón de la capa interna de la muestra, lo que hace que un electrón de mayor energía llene la capa y libere energía. La energía o longitud de onda de estos rayos X característicos se puede medir mediante espectroscopia de rayos X de energía dispersiva o espectroscopia de rayos X de longitud de onda dispersiva y se puede utilizar para identificar y medir la abundancia de elementos en la muestra y mapear su distribución.

Debido al haz de electrones muy estrecho, las micrografías SEM tienen una gran profundidad de campo que produce una apariencia tridimensional característica útil para comprender la estructura de la superficie de una muestra. [15] Esto se ejemplifica con la micrografía de polen que se muestra arriba. Es posible una amplia gama de aumentos, desde aproximadamente 10 veces (aproximadamente equivalente al de una lupa de mano potente) hasta más de 500.000 veces, aproximadamente 250 veces el límite de aumento de los mejores microscopios ópticos .

Preparación de muestras

Una araña recubierta de oro, preparada para ser observada con un microscopio electrónico de barrido (SEM).
Micrografía de bajo voltaje (300 V) de la distribución de gotitas de adhesivo sobre una nota adhesiva . No se aplicó ningún recubrimiento conductor: un recubrimiento de este tipo alteraría esta frágil muestra.

Las muestras de SEM deben ser lo suficientemente pequeñas para caber en la platina de la muestra y pueden necesitar una preparación especial para aumentar su conductividad eléctrica y estabilizarlas, de modo que puedan soportar las condiciones de alto vacío y el haz de electrones de alta energía. Las muestras generalmente se montan rígidamente en un portamuestras o un soporte utilizando un adhesivo conductor. El SEM se utiliza ampliamente para el análisis de defectos de obleas semiconductoras y los fabricantes crean instrumentos que pueden examinar cualquier parte de una oblea semiconductora de 300 mm. Muchos instrumentos tienen cámaras que pueden inclinar un objeto de ese tamaño a 45° y proporcionar una rotación continua de 360°. [ cita requerida ]

Las muestras no conductoras acumulan carga cuando son escaneadas por el haz de electrones, y especialmente en el modo de obtención de imágenes con electrones secundarios, lo que provoca fallos de escaneo y otros artefactos de imagen. Para la obtención de imágenes convencionales en el SEM, las muestras deben ser eléctricamente conductoras , al menos en la superficie, y conectadas a tierra eléctricamente para evitar la acumulación de carga electrostática . Los objetos metálicos requieren poca preparación especial para el SEM, excepto para la limpieza y el montaje conductivo en un trozo de muestra. Los materiales no conductores suelen estar recubiertos con una capa ultrafina de material conductor de electricidad, depositado sobre la muestra mediante recubrimiento por pulverización catódica a bajo vacío , deposición sin corriente eléctrica [ cita requerida ] o mediante evaporación a alto vacío . Los materiales conductores que se utilizan actualmente para el recubrimiento de muestras incluyen oro , aleación de oro/ paladio , platino , iridio , tungsteno , cromo , osmio [14] y grafito . El recubrimiento con metales pesados ​​puede aumentar la relación señal/ruido para muestras de bajo número atómico (Z). La mejora surge porque se mejora la emisión de electrones secundarios para materiales de alto Z. [ cita requerida ]

Una alternativa al recubrimiento de algunas muestras biológicas es aumentar la conductividad en masa del material mediante la impregnación con osmio utilizando variantes del método de tinción OTO (O- tetróxido de osmio , T- tiocarbohidrazida , O- osmio ). [16] [17]

Las muestras no conductoras pueden ser fotografiadas sin recubrimiento utilizando un SEM ambiental (ESEM) o un modo de operación de SEM de bajo voltaje. En los instrumentos ESEM, la muestra se coloca en una cámara de presión relativamente alta y la columna óptica de electrones se bombea diferencialmente para mantener el vacío adecuadamente [ aclaración necesaria ] bajo en el cañón de electrones. La región de alta presión alrededor de la muestra en el ESEM neutraliza la carga y proporciona una amplificación de la señal de electrones secundarios. [ cita requerida ] El SEM de bajo voltaje generalmente se lleva a cabo en un instrumento con cañones de emisión de campo (FEG) que es capaz de producir un alto brillo de electrones primarios y un tamaño de punto pequeño incluso a potenciales de aceleración bajos. Para evitar la carga de muestras no conductoras, las condiciones de operación deben ajustarse de manera que la corriente del haz entrante sea igual a la suma de las corrientes de electrones secundarios y retrodispersados ​​salientes, una condición que se cumple con mayor frecuencia a voltajes de aceleración de 0,3 a 4 kV. [ cita requerida ]

La incrustación en una resina con pulido posterior hasta obtener un acabado tipo espejo se puede utilizar tanto para muestras biológicas como de materiales cuando se obtienen imágenes de electrones retrodispersados ​​o cuando se realiza un microanálisis cuantitativo de rayos X.

Las principales técnicas de preparación no son necesarias en el SEM ambiental que se describe a continuación, pero algunas muestras biológicas pueden beneficiarse de la fijación.

Muestras biológicas

Tradicionalmente, se requiere que una muestra de SEM esté completamente seca, ya que la cámara de muestras está bajo alto vacío. Los materiales duros y secos, como madera, hueso, plumas, insectos secos o cáscaras (incluidas las cáscaras de huevo [18] ) se pueden examinar con poco tratamiento adicional, pero las células y tejidos vivos y los organismos completos de cuerpo blando requieren fijación química para preservar y estabilizar su estructura.

La fijación se realiza generalmente por incubación en una solución de un fijador químico tamponado , como glutaraldehído , a veces en combinación con formaldehído [19] [20] [21] y otros fijadores, [22] y opcionalmente seguido de posfijación con tetróxido de osmio. [19] El tejido fijado se deshidrata luego. Debido a que el secado al aire causa colapso y encogimiento, esto se logra comúnmente mediante el reemplazo de agua en las células con solventes orgánicos como etanol o acetona , y el reemplazo de estos solventes a su vez con un fluido de transición como dióxido de carbono líquido por secado de punto crítico . [23] El dióxido de carbono finalmente se elimina mientras está en un estado supercrítico, de modo que no haya una interfaz gas-líquido dentro de la muestra durante el secado.

La muestra seca se suele montar en un trozo de muestra utilizando un adhesivo como resina epoxi o cinta adhesiva de doble cara conductora de electricidad, y se recubre con oro o aleación de oro/paladio antes de examinarla en el microscopio. Las muestras se pueden seccionar (con un micrótomo ) si se va a exponer información sobre la ultraestructura interna del organismo para obtener imágenes.

Si el SEM está equipado con una platina fría para criomicroscopía, se puede utilizar la criofijación y realizar una microscopía electrónica de barrido a baja temperatura en las muestras fijadas criogénicamente. [19] Las muestras criofijadas se pueden criofracturar al vacío en un aparato especial para revelar la estructura interna, recubrirlas con pulverización catódica y transferirlas a la platina criogénica del SEM mientras aún están congeladas. [24] La microscopía electrónica de barrido a baja temperatura (LT-SEM) también se puede aplicar a la obtención de imágenes de materiales sensibles a la temperatura, como el hielo [25] [26] y las grasas. [27]

La criofracturación, el grabado por congelación o el congelamiento y rotura es un método de preparación particularmente útil para examinar las membranas lipídicas y las proteínas incorporadas en ellas en una vista "frontal". El método de preparación revela las proteínas incrustadas en la bicapa lipídica.

Materiales

La obtención de imágenes por electrones retrodispersados, el análisis cuantitativo de rayos X y el mapeo de muestras por rayos X a menudo requieren esmerilar y pulir las superficies hasta obtener una superficie ultra suave. Las muestras que se someten a análisis WDS o EDS a menudo están recubiertas de carbono. En general, los metales no se recubren antes de la obtención de imágenes en el SEM porque son conductores y proporcionan su propia vía a tierra. La fractografía es el estudio de superficies fracturadas que se puede realizar en un microscopio óptico o, comúnmente, en un SEM. La superficie fracturada se corta a un tamaño adecuado, se limpia de cualquier residuo orgánico y se monta en un portamuestras para su visualización en el SEM. Los circuitos integrados se pueden cortar con un haz de iones enfocado (FIB) u otro instrumento de fresado de haz de iones para su visualización en el SEM. El SEM en el primer caso se puede incorporar al FIB, lo que permite obtener imágenes de alta resolución del resultado del proceso. Los metales, las muestras geológicas y los circuitos integrados también se pueden pulir químicamente para su visualización en el SEM. Se requieren técnicas especiales de recubrimiento de alta resolución para obtener imágenes de gran aumento de películas delgadas inorgánicas.

Proceso de escaneo y formación de imágenes

Esquema de un SEM

En un SEM típico, un haz de electrones se emite termoiónicamente desde un cañón de electrones equipado con un cátodo de filamento de tungsteno . El tungsteno se utiliza normalmente en cañones de electrones termoiónicos porque tiene el punto de fusión más alto y la presión de vapor más baja de todos los metales, lo que permite calentarlo eléctricamente para la emisión de electrones, y por su bajo coste. Otros tipos de emisores de electrones incluyen hexaboruro de lantano ( LaB
6) cátodos, que se pueden utilizar en un SEM de filamento de tungsteno estándar si se actualiza el sistema de vacío, o cañones de emisión de campo (FEG), que pueden ser del tipo de cátodo frío que utiliza emisores de monocristal de tungsteno o del tipo Schottky asistido térmicamente , que utilizan emisores de monocristales de tungsteno recubiertos de óxido de circonio .

El haz de electrones, que normalmente tiene una energía que oscila entre 0,2 keV y 40 keV, se enfoca mediante una o dos lentes condensadoras en un punto de entre 0,4 nm y 5 nm de diámetro. El haz pasa a través de pares de bobinas de barrido o pares de placas deflectoras en la columna de electrones, normalmente en la lente final, que desvían el haz en los ejes x e y de modo que barre en forma de trama un área rectangular de la superficie de la muestra.

Mecanismos de emisión de electrones secundarios, electrones retrodispersados ​​y rayos X característicos de los átomos de la muestra.

Cuando el haz de electrones primario interactúa con la muestra, los electrones pierden energía por dispersión y absorción aleatorias repetidas dentro de un volumen en forma de lágrima de la muestra conocido como volumen de interacción , que se extiende desde menos de 100 nm hasta aproximadamente 5 μm dentro de la superficie. El tamaño del volumen de interacción depende de la energía de aterrizaje del electrón, el número atómico de la muestra y la densidad de la muestra. El intercambio de energía entre el haz de electrones y la muestra da como resultado la reflexión de electrones de alta energía por dispersión elástica, la emisión de electrones secundarios por dispersión inelástica y la emisión de radiación electromagnética , cada una de las cuales puede detectarse mediante detectores especializados. La corriente del haz absorbida por la muestra también puede detectarse y usarse para crear imágenes de la distribución de la corriente de la muestra. Se utilizan amplificadores electrónicos de varios tipos para amplificar las señales, que se muestran como variaciones de brillo en un monitor de computadora (o, para modelos antiguos, en un tubo de rayos catódicos ). Cada píxel de la memoria de vídeo de la computadora está sincronizado con la posición del haz sobre la muestra en el microscopio y la imagen resultante es, por lo tanto, un mapa de distribución de la intensidad de la señal que se emite desde el área escaneada de la muestra. Los microscopios más antiguos capturaban imágenes en película, pero la mayoría de los instrumentos modernos recopilan imágenes digitales .

Serie de aumentos de SEM a baja temperatura para un cristal de nieve . Los cristales se capturan, se almacenan y se recubren con platino a temperaturas criogénicas para obtener imágenes.

Aumento

La ampliación en un SEM se puede controlar en un rango de aproximadamente 6 órdenes de magnitud desde aproximadamente 10 a 3.000.000 de veces. [28] A diferencia de los microscopios electrónicos ópticos y de transmisión, la ampliación de la imagen en un SEM no es una función de la potencia de la lente del objetivo . Los SEM pueden tener lentes condensadores y objetivos, pero su función es enfocar el haz en un punto y no obtener una imagen de la muestra. Siempre que el cañón de electrones pueda generar un haz con un diámetro suficientemente pequeño, un SEM podría, en principio, funcionar completamente sin lentes condensadores o objetivos. Sin embargo, podría no ser muy versátil o lograr una resolución muy alta. En un SEM, como en la microscopía de sonda de barrido , la ampliación resulta de la relación entre la trama en el dispositivo de visualización y las dimensiones de la trama en la muestra. Suponiendo que la pantalla de visualización tiene un tamaño fijo, una mayor ampliación resulta de la reducción del tamaño de la trama en la muestra, y viceversa. Por lo tanto, la ampliación está controlada por la corriente suministrada a las bobinas de exploración x, y, o el voltaje suministrado a las placas deflectoras x, y, y no por la potencia de la lente objetivo.

Detección de electrones secundarios

El modo de obtención de imágenes más común recoge electrones secundarios de baja energía (<50 eV) que son expulsados ​​de las bandas de conducción o valencia de los átomos de la muestra por interacciones de dispersión inelástica con los electrones del haz. Debido a su baja energía, estos electrones se originan a unos pocos nanómetros por debajo de la superficie de la muestra. [15] Los electrones son detectados por un detector Everhart-Thornley , [29] que es un tipo de sistema colector- centelleador - fotomultiplicador . Los electrones secundarios se recogen primero atrayéndolos hacia una rejilla polarizada eléctricamente a unos +400 V, y luego se aceleran aún más hacia un fósforo o centelleador polarizado positivamente a unos +2000 V. Los electrones secundarios acelerados son ahora lo suficientemente energéticos como para hacer que el centelleador emita destellos de luz (catodoluminiscencia), que se conducen a un fotomultiplicador fuera de la columna SEM a través de un tubo de luz y una ventana en la pared de la cámara de la muestra. La señal eléctrica amplificada emitida por el fotomultiplicador se muestra como una distribución de intensidad bidimensional que se puede ver y fotografiar en una pantalla de video analógica, o someterse a una conversión de analógico a digital y mostrarse y guardarse como una imagen digital . Este proceso se basa en un haz primario escaneado en trama. El brillo de la señal depende del número de electrones secundarios que llegan al detector . Si el haz entra en la muestra perpendicularmente a la superficie, entonces la región activada es uniforme alrededor del eje del haz y una cierta cantidad de electrones "escapan" de dentro de la muestra. A medida que aumenta el ángulo de incidencia, aumenta el volumen de interacción y disminuye la distancia de "escape" de un lado del haz, lo que da como resultado que se emitan más electrones secundarios desde la muestra. Por lo tanto, las superficies y los bordes empinados tienden a ser más brillantes que las superficies planas, lo que da como resultado imágenes con una apariencia tridimensional bien definida. Usando la señal de electrones secundarios, es posible obtener una resolución de imagen menor a 0,5 nm.

Detección de electrones retrodispersados

Comparación de técnicas SEM:
Arriba: análisis de electrones retrodispersados ​​– composición
Abajo: análisis de electrones secundarios – topografía

Los electrones retrodispersados ​​(BSE) consisten en electrones de alta energía que se originan en el haz de electrones, que se reflejan o retrodispersan fuera del volumen de interacción de la muestra por interacciones de dispersión elástica con los átomos de la muestra. Dado que los elementos pesados ​​(número atómico alto) retrodispersan electrones con mayor fuerza que los elementos ligeros (número atómico bajo) y, por lo tanto, aparecen más brillantes en la imagen, los BSE se utilizan para detectar el contraste entre áreas con diferentes composiciones químicas. [15] El detector Everhart-Thornley, que normalmente se coloca a un lado de la muestra, es ineficiente para la detección de electrones retrodispersados ​​porque pocos de estos electrones se emiten en el ángulo sólido subtendido por el detector, y porque la rejilla de detección con polarización positiva tiene poca capacidad para atraer los BSE de mayor energía. Los detectores de electrones retrodispersados ​​dedicados se colocan sobre la muestra en una disposición tipo "donut", concéntrica con el haz de electrones, maximizando el ángulo sólido de recolección. Los detectores de BSE suelen ser de tipo centelleador o semiconductor. Cuando todas las partes del detector se utilizan para recoger electrones simétricamente alrededor del haz, se produce un contraste de número atómico. Sin embargo, se produce un fuerte contraste topográfico recogiendo electrones retrodispersados ​​desde un lado por encima de la muestra utilizando un detector de BSE direccional asimétrico; el contraste resultante aparece como una iluminación de la topografía desde ese lado. Los detectores semiconductores se pueden fabricar en segmentos radiales que se pueden activar o desactivar para controlar el tipo de contraste producido y su direccionalidad.

Los electrones retrodispersados ​​también se pueden utilizar para formar una imagen de difracción de retrodispersión de electrones (EBSD) que se puede utilizar para determinar la estructura cristalográfica de la muestra.

Análisis de semiconductores mediante inyección de haz

La naturaleza de la sonda del SEM, los electrones energéticos, lo hace especialmente adecuado para examinar las propiedades ópticas y electrónicas de los materiales semiconductores. Los electrones de alta energía del haz del SEM inyectarán portadores de carga en el semiconductor. Por lo tanto, los electrones del haz pierden energía al promover electrones de la banda de valencia a la banda de conducción , dejando atrás huecos .

En un material con banda prohibida directa , la recombinación de estos pares electrón-hueco dará como resultado la catodoluminiscencia; si la muestra contiene un campo eléctrico interno, como el que está presente en una unión pn , la inyección de portadores mediante el haz de electrones mediante SEM hará que fluya una corriente inducida por haz de electrones (EBIC). La catodoluminiscencia y la EBIC se conocen como técnicas de "inyección por haz" y son sondas muy potentes del comportamiento optoelectrónico de los semiconductores, en particular para estudiar características y defectos a escala nanométrica.

Catodoluminiscencia

Imagen de un policristal de InGaN obtenida mediante microscopio electrónico de barrido (SEM) con una superposición de catodoluminiscencia en color . Los canales azul y verde representan colores reales, el canal rojo corresponde a la emisión UV.

La catodoluminiscencia , la emisión de luz cuando los átomos excitados por electrones de alta energía vuelven a su estado fundamental, es análoga a la fluorescencia inducida por UV , y algunos materiales como el sulfuro de cinc y algunos tintes fluorescentes, exhiben ambos fenómenos. Durante las últimas décadas, la catodoluminiscencia se experimentó más comúnmente como la emisión de luz desde la superficie interna del tubo de rayos catódicos en televisores y monitores CRT de computadora. En el SEM, los detectores CL recogen toda la luz emitida por la muestra o pueden analizar las longitudes de onda emitidas por la muestra y mostrar un espectro de emisión o una imagen de la distribución de la catodoluminiscencia emitida por la muestra en color real.

Microanálisis de rayos X

Los rayos X característicos que se producen por la interacción de los electrones con la muestra también se pueden detectar en un microscopio electrónico de barrido equipado para espectroscopia de rayos X de energía dispersiva o espectroscopia de rayos X de longitud de onda dispersiva . El análisis de las señales de rayos X se puede utilizar para mapear la distribución y estimar la abundancia de elementos en la muestra.

Resolución del SEM

Vídeo que ilustra un rango de aumento práctico típico de un microscopio electrónico de barrido diseñado para muestras biológicas. El vídeo comienza con 25×, unos 6 mm en todo el campo de visión, y amplía hasta 12000×, unos 12  μm en todo el campo de visión. Los objetos esféricos son perlas de vidrio con un diámetro de 10 μm, similar en diámetro a un glóbulo rojo .

Un SEM no es una cámara y el detector no forma imágenes de forma continua como una matriz CCD o una película . A diferencia de un sistema óptico, la resolución no está limitada por el límite de difracción , la finura de las lentes o espejos o la resolución de la matriz del detector. La óptica de enfoque puede ser grande y gruesa, y el detector SE es del tamaño de un puño y simplemente detecta la corriente. En cambio, la resolución espacial del SEM depende del tamaño del punto de electrones, que a su vez depende tanto de la longitud de onda de los electrones como del sistema electrón-óptico que produce el haz de escaneo. La resolución también está limitada por el tamaño del volumen de interacción, el volumen del material de la muestra que interactúa con el haz de electrones. El tamaño del punto y el volumen de interacción son grandes en comparación con las distancias entre los átomos, por lo que la resolución del SEM no es lo suficientemente alta como para obtener imágenes de átomos individuales, como es posible con un microscopio electrónico de transmisión (TEM). Sin embargo, el SEM tiene ventajas compensatorias, incluida la capacidad de obtener imágenes de un área comparativamente grande de la muestra; la capacidad de obtener imágenes de materiales a granel (no solo películas delgadas o láminas); y la variedad de modos analíticos disponibles para medir la composición y las propiedades de la muestra. Dependiendo del instrumento, la resolución puede oscilar entre menos de 1 nm y 20 nm. A partir de 2009, el microscopio electrónico de barrido convencional (≤30 kV) de mayor resolución del mundo puede alcanzar una resolución puntual de 0,4 nm utilizando un detector de electrones secundarios. [30]

SEM ambiental

El SEM convencional requiere que las muestras se tomen imágenes al vacío , porque una atmósfera de gas se propaga y atenúa rápidamente los haces de electrones. Como consecuencia, las muestras que producen una cantidad significativa de vapor , por ejemplo, muestras biológicas húmedas o rocas que contienen petróleo, deben secarse o congelarse criogénicamente. Los procesos que involucran transiciones de fase , como el secado de adhesivos o la fusión de aleaciones , el transporte de líquidos, las reacciones químicas y los sistemas sólido-aire-gas, en general no se pueden observar con SEM de alto vacío convencional. En SEM ambiental (ESEM), la cámara se vacía de aire, pero el vapor de agua se retiene cerca de su presión de saturación y la presión residual permanece relativamente alta. Esto permite el análisis de muestras que contienen agua u otras sustancias volátiles. Con ESEM, ha sido posible observar insectos vivos. [31]

El primer desarrollo comercial del ESEM a finales de los años 1980 [32] [33] permitió observar muestras en entornos gaseosos de baja presión (por ejemplo, 1–50 Torr o 0,1–6,7 kPa) y alta humedad relativa (hasta 100%). Esto fue posible gracias al desarrollo de un detector de electrones secundarios [34] [35] capaz de funcionar en presencia de vapor de agua y al uso de aberturas limitadoras de presión con bombeo diferencial en la trayectoria del haz de electrones para separar la región de vacío (alrededor del cañón y las lentes) de la cámara de muestra. Los primeros ESEM comerciales fueron producidos por ElectroScan Corporation en EE. UU. en 1988. ElectroScan fue adquirida por Philips (que más tarde vendió su división de óptica electrónica a FEI Company) en 1996. [36]

La ESEM es especialmente útil para materiales no metálicos y biológicos porque no es necesario recubrirlos con carbono u oro. Los plásticos y elastómeros sin recubrimiento se pueden examinar de forma rutinaria, al igual que las muestras biológicas sin recubrimiento. Esto es útil porque el recubrimiento puede ser difícil de revertir, puede ocultar pequeñas características en la superficie de la muestra y puede reducir el valor de los resultados obtenidos. El análisis de rayos X es difícil con un recubrimiento de un metal pesado, por lo que los recubrimientos de carbono se utilizan de forma rutinaria en los SEM convencionales, pero la ESEM permite realizar microanálisis de rayos X en muestras no conductoras sin recubrimiento; sin embargo, se introducen algunos artefactos específicos para la ESEM en el análisis de rayos X. La ESEM puede ser la opción preferida para la microscopía electrónica de muestras únicas de acciones criminales o civiles, donde el análisis forense puede necesitar ser repetido por varios expertos diferentes. Es posible estudiar muestras en líquido con ESEM o con otros métodos de microscopía electrónica en fase líquida . [37]

SEM de transmisión

El SEM también se puede utilizar en modo de transmisión incorporando simplemente un detector apropiado debajo de una sección delgada de la muestra. [38] Hay detectores disponibles para campo claro, campo oscuro, así como detectores segmentados para campo oscuro anular de ángulo medio a alto . A pesar de la diferencia en la instrumentación, esta técnica todavía se conoce comúnmente como microscopía electrónica de transmisión de barrido (STEM) .

SEM en la ciencia forense

El SEM se utiliza a menudo en la ciencia forense para el análisis ampliado de elementos microscópicos como diatomeas y residuos de disparos . Debido a que el SEM es una fuerza no destructiva sobre la muestra, se puede utilizar para analizar pruebas sin dañarla. El SEM dispara un haz de electrones de alta energía a la muestra que rebotan en la muestra sin cambiarla ni destruirla. Esto es genial cuando se trata de analizar diatomeas. Cuando una persona muere ahogada, inhala el agua, lo que hace que lo que está en el agua (diatomeas) entre en el torrente sanguíneo, el cerebro, los riñones y más. Estas diatomeas en el cuerpo se pueden ampliar con el SEM para determinar el tipo de diatomeas, lo que ayuda a comprender cómo y dónde murió la persona. Al usar las imágenes producidas por el SEM, los científicos forenses pueden comparar los tipos de diatomeas para confirmar el cuerpo de agua en el que murió una persona. [39]

El análisis de residuos de disparos (GSR) se puede realizar con muchos instrumentos analíticos diferentes, [40] pero el SEM es una forma común de analizar compuestos inorgánicos debido a la forma en que puede analizar de cerca los tipos de elementos (principalmente metales) a través de sus tres detectores: detector de electrones de retrodispersión, detector de electrones secundarios y detector de rayos X. Los GSR se pueden recolectar de la escena del crimen, la víctima o el tirador y analizar con el SEM. Esto puede ayudar a los científicos a determinar la proximidad o el contacto con el arma de fuego disparada. [40]

Color en SEM

Los microscopios electrónicos no producen naturalmente imágenes en color, mientras que un SEM produce un único valor por píxel ; este valor corresponde al número de electrones recibidos por el detector durante un pequeño período de tiempo del escaneo cuando el haz se dirige a la posición del píxel (x, y).

Este único número suele representarse, para cada píxel, mediante un nivel de gris, formando una imagen monocromática. [41] Sin embargo, se han utilizado varios métodos para obtener imágenes de microscopía electrónica en color. [42]

Falso color utilizando un único detector

  • Sobre imágenes compositivas de superficies planas (normalmente BSE):

La forma más sencilla de obtener el color es asociar a este único número un color arbitrario, utilizando una tabla de consulta de colores (es decir, cada nivel de gris se reemplaza por un color elegido). Este método se conoce como color falso . En una imagen BSE, se puede realizar un color falso para distinguir mejor las distintas fases de la muestra. [43]

  • En imágenes con superficies texturizadas:

Como alternativa a la simple sustitución de cada nivel de gris por un color, una muestra observada mediante un haz oblicuo permite a los investigadores crear una imagen topográfica aproximada (véase la sección "Representación 3D fotométrica a partir de una única imagen SEM"). Dicha topografía puede procesarse luego mediante algoritmos de representación 3D para obtener una representación más natural de la textura de la superficie.

  • Superficie de un cálculo renal
    Superficie de un cálculo renal
  • Lo mismo después del reprocesamiento del color a partir de la topografía estimada.
    Lo mismo después del reprocesamiento del color a partir de la topografía estimada.
  • Imagen SEM de un disaster alterado diagenéticamente
    Imagen SEM de un disaster alterado diagenéticamente
  • La misma imagen después de una coloración similar.
    La misma imagen después de una coloración similar.

Coloración de imágenes SEM

Muy a menudo, las imágenes SEM publicadas están coloreadas artificialmente. [43] Esto puede hacerse por un efecto estético, para aclarar la estructura o para agregar una apariencia realista a la muestra y generalmente no agrega información sobre el espécimen. [44]

La coloración se puede realizar manualmente con un software de edición de fotografías o de forma semiautomática con un software dedicado que utilice detección de características o segmentación orientada a objetos. [45]

  • Imagen SEM del polen de Cobaea scandens
    Imagen SEM del polen de Cobaea scandens
  • Lo mismo ocurre después de la coloración semiautomática. Los colores arbitrarios ayudan a identificar los distintos elementos de la estructura.
    Lo mismo ocurre después de la coloración semiautomática. Los colores arbitrarios ayudan a identificar los distintos elementos de la estructura.
  • Imagen SEM coloreada del polen y los estambres de Tradescantia
    Imagen SEM coloreada del polen y los estambres de Tradescantia
  • Imagen SEM coloreada del intercrecimiento de cristales de arsenopirita y oro nativo
    Imagen SEM coloreada del intercrecimiento de cristales de arsenopirita y oro nativo

Color creado utilizando múltiples detectores de electrones

En algunas configuraciones se recopila más información por píxel, a menudo mediante el uso de múltiples detectores. [46]

Como ejemplo común, se superponen detectores de electrones secundarios y de electrones retrodispersados ​​y se asigna un color a cada una de las imágenes capturadas por cada detector, [47] [48] con un resultado de una imagen de color combinada donde los colores están relacionados con la densidad de los componentes. Este método se conoce como SEM de color dependiente de la densidad (DDC-SEM). Las micrografías producidas por DDC-SEM retienen información topográfica, que es mejor capturada por el detector de electrones secundarios y la combinan con la información sobre la densidad, obtenida por el detector de electrones retrodispersados. [49] [50]

  • DDC-SEM de partículas calcificadas en tejido cardíaco - Señal 1: SE
    DDC-SEM de partículas calcificadas en tejido cardíaco - Señal 1: SE
  • Señal 2: EEB
    Señal 2: EEB
  • Imagen coloreada obtenida de las dos anteriores. Micrografía electrónica de barrido en color dependiente de la densidad (DDC-SEM) de calcificación cardiovascular, mostrando en naranja una partícula esférica de fosfato de calcio (material más denso) y, en verde, la matriz extracelular (material menos denso)
    Imagen coloreada obtenida de las dos anteriores. Micrografía electrónica de barrido en color dependiente de la densidad (DDC-SEM) de calcificación cardiovascular, mostrando en naranja una partícula esférica de fosfato de calcio (material más denso) y, en verde, la matriz extracelular (material menos denso)
  • El mismo trabajo con una visión más amplia, parte de un estudio sobre la calcificación del tejido cardiovascular humano.
    El mismo trabajo con una visión más amplia, parte de un estudio sobre la calcificación del tejido cardiovascular humano.

Señales analíticas basadas en fotones generados

La medición de la energía de los fotones emitidos por la muestra es un método común para obtener capacidades analíticas. Algunos ejemplos son los detectores de espectroscopia de rayos X de energía dispersiva (EDS) utilizados en el análisis elemental y los sistemas de microscopio de catodoluminiscencia (CL) que analizan la intensidad y el espectro de la luminiscencia inducida por electrones en (por ejemplo) muestras geológicas. En los sistemas SEM que utilizan estos detectores es común codificar por colores estas señales adicionales y superponerlas en una sola imagen de color, de modo que las diferencias en la distribución de los diversos componentes de la muestra se puedan ver claramente y comparar. Opcionalmente, la imagen estándar de electrones secundarios se puede fusionar con uno o más canales de composición, de modo que se pueda comparar la estructura y la composición de la muestra. Dichas imágenes se pueden realizar manteniendo la integridad total de los datos de la señal original, que no se modifican de ninguna manera.

3D en SEM

Los SEM no proporcionan imágenes 3D de forma natural, a diferencia de los SPM . Sin embargo, se pueden obtener datos 3D utilizando un SEM con diferentes métodos, como se indica a continuación.

Reconstrucción SEM 3D a partir de un par estéreo

  • La fotogrametría es el método metrológicamente más preciso para aportar la tercera dimensión a las imágenes SEM. [43] A diferencia de los métodos fotométricos (próximo párrafo), la fotogrametría calcula alturas absolutas utilizando métodos de triangulación . Las desventajas son que sólo funciona si hay una textura mínima y requiere que se adquieran dos imágenes desde dos ángulos diferentes, lo que implica el uso de una platina de inclinación. ( La fotogrametría es una operación de software que calcula el desplazamiento (o "disparidad") para cada píxel, entre la imagen izquierda y la imagen derecha del mismo par. Dicha disparidad refleja la altura local).
  • Un par estereoscópico SEM de microfósiles de menos de 1 mm de tamaño (Ostrácodos) producidos por inclinación a lo largo del eje longitudinal.
    Un par estereoscópico SEM de microfósiles de menos de 1 mm de tamaño ( Ostrácodos ) producidos por inclinación a lo largo del eje longitudinal.
  • A partir de este par de imágenes SEM, se ha reconstruido la tercera dimensión mediante fotogrametría (utilizando el software MountainsSEM, ver siguiente imagen); luego se han realizado una serie de representaciones 3D con diferentes ángulos y se han ensamblado en un archivo GIF para producir esta animación.
    A partir de este par de imágenes SEM, se ha reconstruido la tercera dimensión mediante fotogrametría (utilizando el software MountainsSEM , ver siguiente imagen); luego se han realizado una serie de representaciones 3D con diferentes ángulos y se han ensamblado en un archivo GIF para producir esta animación.
  • Reconstrucción de la superficie en 3D de una muestra de calibración de rugosidad (Ra = 3 μm) (como la utilizada para calibrar perfilómetros), a partir de 2 imágenes de microscopio electrónico de barrido inclinadas 15° (arriba a la izquierda). El cálculo del modelo 3D (abajo a la derecha) demora aproximadamente 1,5 segundos[51] y el error en el valor de rugosidad Ra calculado es inferior al 0,5 %.
    Reconstrucción de la superficie en 3D de una muestra de calibración de rugosidad (Ra = 3 μm) (como la utilizada para calibrar perfilómetros), a partir de 2 imágenes de microscopio electrónico de barrido inclinadas 15° (arriba a la izquierda). El cálculo del modelo 3D (abajo a la derecha) demora aproximadamente 1,5 segundos [51] y el error en el valor de rugosidad Ra calculado es inferior al 0,5 %.

Reconstrucción fotométrica 3D SEM a partir de un detector de cuatro cuadrantes mediante "forma a partir de sombreado"

Este método utiliza normalmente un detector BSE de cuatro cuadrantes (alternativamente, para un fabricante, un detector de 3 segmentos). El microscopio produce cuatro imágenes de la misma muestra al mismo tiempo, por lo que no se requiere inclinación de la muestra. El método proporciona dimensiones metrológicas en 3D siempre que la pendiente de la muestra se mantenga razonable. [43] La mayoría de los fabricantes de SEM ahora (2018) ofrecen un detector BSE de cuatro cuadrantes incorporado u opcional, junto con un software propietario para calcular una imagen en 3D en tiempo real. [52]

Otros enfoques utilizan métodos más sofisticados (y a veces intensivos en GPU), como el algoritmo de estimación óptima , y ​​ofrecen resultados mucho mejores [53] a costa de demandas elevadas de potencia informática.

En todos los casos, este enfoque funciona mediante la integración de la pendiente, por lo que se ignoran las pendientes verticales y los salientes; por ejemplo, si una esfera entera se encuentra sobre una superficie plana, se ve que poco más que el hemisferio superior emerge por encima de la superficie plana, lo que da como resultado una altitud incorrecta del vértice de la esfera. La prominencia de este efecto depende del ángulo de los detectores BSE con respecto a la muestra, pero estos detectores suelen estar situados alrededor (y cerca) del haz de electrones, por lo que este efecto es muy común.

Representación 3D fotométrica a partir de una única imagen SEM

Este método requiere una imagen SEM obtenida con una iluminación oblicua de bajo ángulo. El nivel de gris se interpreta entonces como la pendiente y la pendiente se integra para restaurar la topografía de la muestra. Este método es interesante para la mejora visual y la detección de la forma y la posición de los objetos; sin embargo, las alturas verticales normalmente no se pueden calibrar, a diferencia de otros métodos como la fotogrametría. [43]

  • Imagen SEM de la superficie del ojo compuesto de una mosca doméstica con un aumento de 450×.
    Imagen SEM de la superficie del ojo compuesto de una mosca doméstica con un aumento de 450×.
  • Detalle de la imagen anterior.
    Detalle de la imagen anterior.
  • Reconstrucción SEM 3D del anterior utilizando la forma de los algoritmos de sombreado.
    Reconstrucción SEM 3D del anterior utilizando la forma de los algoritmos de sombreado.
  • Igual que el anterior, pero con la iluminación homogeneizada antes de aplicar la forma a partir de los algoritmos de sombreado.
    Igual que el anterior, pero con la iluminación homogeneizada antes de aplicar la forma a partir de los algoritmos de sombreado.

Otros tipos de reconstrucción SEM 3D

  • Reconstrucción inversa utilizando modelos interactivos electrón-material [54] [55]
  • Reconstrucción multirresolución utilizando un único archivo 2D: las imágenes 3D de alta calidad pueden ser una solución definitiva para revelar las complejidades de cualquier medio poroso, pero obtenerlas es costoso y requiere mucho tiempo. Por otro lado, las imágenes SEM 2D de alta calidad están ampliamente disponibles. Recientemente, se presentó un nuevo método de reconstrucción multiresolución de tres pasos que utiliza directamente imágenes 2D para desarrollar modelos 3D. Este método, basado en una entropía de Shannon y una simulación condicional, se puede utilizar para la mayoría de los materiales estacionarios disponibles y puede construir varios modelos 3D estocásticos utilizando solo unas pocas secciones delgadas. [56] [57] [58]
  • La microscopía electrónica de barrido (SEM) por abrasión iónica (IA-SEM) es un método de obtención de imágenes tridimensionales a escala nanométrica que utiliza un haz de galio enfocado para desgastar repetidamente la superficie de la muestra a una velocidad de 20 nanómetros por vez. Luego, se escanea cada superficie expuesta para compilar una imagen tridimensional. [59] [60]

Aplicaciones del SEM 3D

Una posible aplicación es la medición de la rugosidad de los cristales de hielo. Este método puede combinar el SEM ambiental de presión variable y las capacidades 3D del SEM para medir la rugosidad en facetas individuales de cristales de hielo, convertirla en un modelo informático y ejecutar un análisis estadístico adicional en el modelo. [61] Otras mediciones incluyen la dimensión fractal, el examen de la superficie de fractura de los metales, la caracterización de los materiales, la medición de la corrosión y las mediciones dimensionales a escala nanométrica (altura del escalón, volumen, ángulo, planitud, relación de apoyo, coplanaridad, etc.). [ cita requerida ]

Los conservacionistas de arte también utilizan el SEM para discernir amenazas a la estabilidad de la superficie de las pinturas debido al envejecimiento, como la formación de complejos de iones de zinc con ácidos grasos . [62] Los científicos forenses utilizan el SEM para detectar falsificaciones de arte .

Los siguientes son ejemplos de imágenes tomadas con un SEM.

  • Imagen SEM coloreada de un nematodo del quiste de la soja y un huevo. La coloración artificial hace que la imagen sea más fácil de ver y comprender para los no especialistas las estructuras y superficies que se revelan en las micrografías.
    Imagen SEM coloreada de un nematodo del quiste de la soja y un huevo. La coloración artificial hace que la imagen sea más fácil de ver y comprender para los no especialistas las estructuras y superficies que se revelan en las micrografías.
  • Ojo compuesto del krill antártico Euphausia superba. Los ojos de los artrópodos son un tema común en las micrografías SEM debido a la profundidad de enfoque que una imagen SEM puede capturar. Imagen en color.
    Ojo compuesto del krill antártico Euphausia superba . Los ojos de los artrópodos son un tema común en las micrografías SEM debido a la profundidad de enfoque que una imagen SEM puede capturar. Imagen en color.
  • Omatidios del ojo del krill antártico, una ampliación mayor del ojo del krill. Los microscopios SEM cubren un rango que va desde la microscopía óptica hasta las ampliaciones disponibles con un TEM. Imagen en color.
    Omatidios del ojo del krill antártico , una ampliación mayor del ojo del krill. Los microscopios SEM cubren un rango que va desde la microscopía óptica hasta las ampliaciones disponibles con un TEM . Imagen en color.
  • Imagen obtenida mediante microscopio electrónico de barrido (SEM) de sangre humana circulante normal. Se trata de una micrografía antigua y con ruido de un tema habitual en las micrografías SEM: los glóbulos rojos.
    Imagen SEM de sangre humana circulante normal . Esta es una micrografía antigua y ruidosa de un tema común para las micrografías SEM: glóbulos rojos.
  • Imagen obtenida mediante microscopio electrónico de barrido (SEM) de un hederelloide del Devónico de Michigan (el diámetro del tubo más grande es de 0,75 mm). El SEM se utiliza ampliamente para capturar imágenes detalladas de fósiles micro y macro.
    Imagen obtenida mediante microscopio electrónico de barrido (SEM) de un hederelloide del Devónico de Michigan (el diámetro del tubo más grande es de 0,75 mm). El SEM se utiliza ampliamente para capturar imágenes detalladas de fósiles micro y macro.
  • Imagen de electrones retrodispersados ​​(BSE) de una región rica en antimonio en un fragmento de vidrio antiguo. Los museos utilizan microscopios electrónicos para estudiar artefactos valiosos de manera no destructiva.
    Imagen de electrones retrodispersados ​​(BSE) de una región rica en antimonio en un fragmento de vidrio antiguo. Los museos utilizan microscopios electrónicos para estudiar artefactos valiosos de manera no destructiva.
  • Imagen SEM de la capa de corrosión en la superficie de un fragmento de vidrio antiguo; observe la estructura laminar de la capa de corrosión.
    Imagen SEM de la capa de corrosión en la superficie de un fragmento de vidrio antiguo; observe la estructura laminar de la capa de corrosión.
  • Imagen SEM de una capa de fotorresistencia utilizada en la fabricación de semiconductores tomada con un microscopio electrónico de emisión de campo. Estos microscopios son importantes en la industria de los semiconductores por sus capacidades de alta resolución.
    Imagen SEM de una capa de fotorresistencia utilizada en la fabricación de semiconductores tomada con un microscopio electrónico de emisión de campo . Estos microscopios son importantes en la industria de los semiconductores por sus capacidades de alta resolución.
  • Imagen obtenida mediante microscopio electrónico de barrido (SEM) de la superficie de un cálculo renal que muestra cristales tetragonales de weddellita (oxalato de calcio dihidratado) que emergen de la parte central amorfa del cálculo. La longitud horizontal de la imagen representa 0,5 mm del original.
    Imagen obtenida mediante microscopio electrónico de barrido (SEM) de la superficie de un cálculo renal que muestra cristales tetragonales de weddellita (oxalato de calcio dihidratado) que emergen de la parte central amorfa del cálculo. La longitud horizontal de la imagen representa 0,5 mm del original.
  • Dos imágenes de cristales de nieve escarcha de la misma profundidad, vistas a través de un microscopio óptico (izquierda) y como una imagen SEM (derecha). Observe cómo la imagen SEM permite una percepción clara de los detalles finos de la estructura que son difíciles de distinguir por completo en la imagen del microscopio óptico.
    Dos imágenes de cristales de nieve escarcha de la misma profundidad , vistas a través de un microscopio óptico (izquierda) y como una imagen SEM (derecha). Observe cómo la imagen SEM permite una percepción clara de los detalles finos de la estructura que son difíciles de distinguir por completo en la imagen del microscopio óptico.
  • Células epidérmicas de la superficie interna de una hojuela de cebolla. Debajo de las paredes celulares, que parecen piel de tiburón, se pueden ver núcleos y pequeños orgánulos flotando en el citoplasma. Esta imagen de BSE de una muestra teñida con lantánidos se tomó sin fijación, deshidratación ni pulverización catódica previas.
    Células epidérmicas de la superficie interna de una hojuela de cebolla . Debajo de las paredes celulares, que parecen piel de tiburón, se pueden ver núcleos y pequeños orgánulos flotando en el citoplasma. Esta imagen de BSE de una muestra teñida con lantánidos se tomó sin fijación, deshidratación ni pulverización catódica previas.
  • Imagen SEM de estomas en la superficie inferior de una hoja.
    Imagen SEM de estomas en la superficie inferior de una hoja.

Véase también

Referencias

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General
  • HowStuffWorks – Cómo funcionan los microscopios electrónicos de barrido
  • Aprenda a utilizar un microscopio electrónico de barrido: un entorno de aprendizaje en línea para personas que desean utilizar un microscopio electrónico de barrido. Proporcionado por Microscopy Australia
  • SEM virtual – sparkler – una simulación interactiva de un microscopio electrónico de barrido (SEM)
  • Imágenes SEM en color multicanal (y con BSE)
  • Vídeo sobre el microscopio electrónico de barrido de la Universidad de Ciencias Aplicadas de Karlsruhe
  • Animaciones y explicaciones sobre distintos tipos de microscopios, incluidos los microscopios electrónicos (Université Paris Sud)
Historia
  • Historia del microscopio electrónico de barrido ambiental (ESEM)
Imágenes
  • Instalación de microscopio electrónico de Rippel Archivado el 19 de marzo de 2007 en Wayback Machine. Muchas docenas de imágenes SEM (en su mayoría biológicas) del Dartmouth College.
  • Imágenes SEM con tinción de lantánidos del Instituto de Investigación de Enfermedades Oculares, Moscú.
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