Microsatélite
Secuencias repetidas de 2 a 13 pares de bases de ADN

Un microsatélite es un tramo de ADN repetitivo en el que se repiten ciertos motivos de ADN (que varían en longitud de uno a seis o más pares de bases ), típicamente de 5 a 50 veces. [1] [2] Los microsatélites se encuentran en miles de lugares dentro del genoma de un organismo . Tienen una tasa de mutación más alta que otras áreas del ADN [3], lo que conduce a una alta diversidad genética . Los genetistas forenses y en genealogía genética a menudo se refieren a los microsatélites como repeticiones cortas en tándem ( STR , por sus siglas en inglés ) o como repeticiones de secuencia simple ( SSR , por sus siglas en inglés ) por los genetistas de plantas. [4]

Los microsatélites y sus primos más largos, los minisatélites , se clasifican en conjunto como ADN VNTR (número variable de repeticiones en tándem ). El nombre ADN "satélite" se refiere a la observación temprana de que la centrifugación del ADN genómico en un tubo de ensayo separa una capa prominente de ADN en masa de las capas "satélite" acompañantes de ADN repetitivo. [5]

Se utilizan ampliamente para la elaboración de perfiles de ADN en el diagnóstico del cáncer , en el análisis de parentesco (especialmente en las pruebas de paternidad ) y en la identificación forense. También se utilizan en el análisis de ligamiento genético para localizar un gen o una mutación responsable de un rasgo o enfermedad determinados. Los microsatélites también se utilizan en genética de poblaciones para medir los niveles de parentesco entre subespecies, grupos e individuos.

Historia

Aunque el primer microsatélite fue caracterizado en 1984 en la Universidad de Leicester por Weller, Jeffreys y colegas como una repetición polimórfica de GGAT en el gen de la mioglobina humana , el término "microsatélite" fue introducido más tarde, en 1989, por Litt y Luty. [1] El nombre ADN "satélite" se refiere a la observación temprana de que la centrifugación del ADN genómico en un tubo de ensayo separa una capa prominente de ADN en masa de las capas "satélite" acompañantes de ADN repetitivo. [5] La creciente disponibilidad de la amplificación de ADN por PCR a principios de la década de 1990 desencadenó una gran cantidad de estudios que utilizaban la amplificación de microsatélites como marcadores genéticos para la medicina forense, para las pruebas de paternidad y para la clonación posicional para encontrar el gen subyacente a un rasgo o enfermedad. Entre las primeras aplicaciones destacadas se incluyen las identificaciones mediante genotipado de microsatélites de los restos óseos de ocho años de una víctima de asesinato británica ( Hagelberg et al. 1991) y del médico del campo de concentración de Auschwitz, Josef Mengele , que escapó a Sudamérica después de la Segunda Guerra Mundial ( Jeffreys et al. 1992). [1]

Estructuras, ubicaciones y funciones

Un microsatélite es un tramo de motivos de ADN repetidos en tándem (es decir, adyacentes) que varían en longitud de uno a seis o hasta diez nucleótidos (la definición exacta y la delimitación de los minisatélites más largos varía de un autor a otro), [1] [6] y generalmente se repiten de 5 a 50 veces. Por ejemplo, la secuencia TATATATATA es un microsatélite de dinucleótido, y GTCGTCGTCGTCGTC es un microsatélite de trinucleótido (siendo A adenina , G guanina , C citosina y T timina ). Las unidades repetidas de cuatro y cinco nucleótidos se denominan motivos tetra y pentanucleótidos, respectivamente. La mayoría de los eucariotas tienen microsatélites, con la notable excepción de algunas especies de levadura. Los microsatélites se distribuyen por todo el genoma. [7] [1] [8] El genoma humano, por ejemplo, contiene entre 50.000 y 100.000 microsatélites de dinucleótidos y un número menor de microsatélites de trinucleótidos, tetranucleótidos y pentanucleótidos. [9] Muchos se encuentran en partes no codificantes del genoma humano y, por lo tanto, no producen proteínas, pero también pueden estar ubicados en regiones reguladoras y regiones codificantes .

Los microsatélites en regiones no codificantes pueden no tener ninguna función específica y, por lo tanto, no pueden ser seleccionados en su contra; esto les permite acumular mutaciones sin impedimentos a lo largo de las generaciones y da lugar a una variabilidad que puede utilizarse para la identificación y la identificación de ADN. Otros microsatélites se encuentran en regiones flanqueantes o intrónicas reguladoras de los genes, o directamente en los codones de los genes; las mutaciones de microsatélites en tales casos pueden conducir a cambios fenotípicos y enfermedades, en particular en enfermedades de expansión de tripletes como el síndrome del cromosoma X frágil y la enfermedad de Huntington . [10]

Los telómeros son secuencias lineales de ADN que se encuentran en los extremos de los cromosomas y protegen la integridad del material genómico (de manera similar a un herrete en el extremo de un cordón de zapato) durante las sucesivas rondas de división celular debido al "problema de replicación final". [6] En los glóbulos blancos, se ha demostrado que el acortamiento gradual del ADN telomérico se correlaciona inversamente con el envejecimiento en varios tipos de muestras. [11] Los telómeros consisten en ADN repetitivo, con el motivo de repetición de hexanucleótidos TTAGGG en vertebrados. [ cita requerida ] Por lo tanto, se clasifican como minisatélites . De manera similar, los insectos tienen motivos repetidos más cortos en sus telómeros que podrían considerarse microsatélites. [ cita requerida ]

Mecanismos de mutación y tasas de mutación

Deslizamiento de la cadena de ADN durante la replicación de un locus STR. Los recuadros simbolizan unidades de ADN repetitivas. Las flechas indican la dirección en la que se está replicando una nueva cadena de ADN (recuadros blancos) a partir de la cadena molde (recuadros negros). Se representan tres situaciones durante la replicación del ADN. (a) La replicación del locus STR ha tenido lugar sin una mutación. (b) La replicación del locus STR ha dado lugar a una ganancia de una unidad debido a un bucle en la nueva cadena; el bucle aberrante se estabiliza mediante unidades flanqueantes complementarias a la cadena opuesta. (c) La replicación del locus STR ha dado lugar a una pérdida de una unidad debido a un bucle en la cadena molde. (Forster et al. 2015)

A diferencia de las mutaciones puntuales , que afectan solo a un único nucleótido, las mutaciones de microsatélites conducen a la ganancia o pérdida de una unidad de repetición completa y, a veces, dos o más repeticiones simultáneamente. Por lo tanto, se espera que la tasa de mutación en los loci microsatélites difiera de otras tasas de mutación, como las tasas de sustitución de bases. [12] [13] La tasa de mutación en los loci microsatélites depende de la secuencia del motivo de repetición, el número de unidades de motivo repetidas y la pureza de la secuencia repetida canónica. [14] Se han revisado diversos mecanismos de mutación de los loci microsatélites, [14] [15] y se ha cuantificado su naturaleza polimórfica resultante. [16] Se debate la causa real de las mutaciones en los microsatélites.

Una causa propuesta de tales cambios de longitud es el deslizamiento de replicación, causado por desajustes entre las hebras de ADN mientras se replican durante la meiosis . [17] La ​​ADN polimerasa , la enzima responsable de leer el ADN durante la replicación, puede deslizarse mientras se mueve a lo largo de la hebra molde y continuar en el nucleótido equivocado. El deslizamiento de la ADN polimerasa es más probable que ocurra cuando se replica una secuencia repetitiva (como CGCGCG). Debido a que los microsatélites consisten en tales secuencias repetitivas, la ADN polimerasa puede cometer errores a una tasa mayor en estas regiones de secuencia. Varios estudios han encontrado evidencia de que el deslizamiento es la causa de las mutaciones de microsatélites. [18] [19] Normalmente, el deslizamiento en cada microsatélite ocurre aproximadamente una vez cada 1000 generaciones. [20] Por lo tanto, los cambios de deslizamiento en el ADN repetitivo son tres órdenes de magnitud más comunes que las mutaciones puntuales en otras partes del genoma. [21] La mayoría de los deslizamientos resultan en un cambio de solo una unidad de repetición, y las tasas de deslizamiento varían para diferentes longitudes de alelos y tamaños de unidades de repetición, [3] y dentro de diferentes especies. [22] [23] [24] Si hay una gran diferencia de tamaño entre alelos individuales, entonces puede haber una mayor inestabilidad durante la recombinación en la meiosis. [21]

Otra posible causa de las mutaciones de microsatélites son las mutaciones puntuales, en las que solo se copia incorrectamente un nucleótido durante la replicación. Un estudio que comparó los genomas humanos y de primates descubrió que la mayoría de los cambios en el número de repeticiones en microsatélites cortos aparecen debido a mutaciones puntuales en lugar de deslizamientos. [25]

Tasas de mutación de microsatélites

Se han realizado estimaciones directas de las tasas de mutación de microsatélites en numerosos organismos, desde insectos hasta humanos. En la langosta del desierto Schistocerca gregaria , la tasa de mutación de microsatélites se estimó en 2,1 × 10 −4 por generación por locus. [26] La tasa de mutación de microsatélites en las líneas germinales masculinas humanas es cinco a seis veces mayor que en las líneas germinales femeninas y varía de 0 a 7 × 10 −3 por locus por gameto por generación. [3] En el nematodo Pristionchus pacificus , la tasa estimada de mutación de microsatélites varía de 8,9 × 10 −5 a 7,5 × 10 −4 por locus por generación. [27]

Las tasas de mutación de microsatélites varían con la posición de la base en relación con el microsatélite, el tipo de repetición y la identidad de la base. [25] La tasa de mutación aumenta específicamente con el número de repeticiones, alcanzando un máximo alrededor de seis a ocho repeticiones y luego disminuyendo nuevamente. [25] El aumento de la heterocigosidad en una población también aumentará las tasas de mutación de microsatélites, [28] especialmente cuando hay una gran diferencia de longitud entre los alelos. Esto probablemente se deba a que los cromosomas homólogos con brazos de longitudes desiguales causan inestabilidad durante la meiosis. [29]

Efectos biológicos de las mutaciones de microsatélites

Muchos microsatélites se encuentran en el ADN no codificante y son biológicamente silenciosos. Otros se encuentran en el ADN regulador o incluso codificante  ; en estos casos, las mutaciones de microsatélites pueden provocar cambios fenotípicos y enfermedades. Un estudio de todo el genoma estima que la variación de microsatélites contribuye entre el 10 y el 15 % de la variación hereditaria de la expresión génica en los seres humanos. [30] [16]

Efectos sobre las proteínas

En los mamíferos, entre el 20 y el 40 % de las proteínas contienen secuencias repetidas de aminoácidos codificados por repeticiones de secuencias cortas. [31] La mayoría de las repeticiones de secuencias cortas dentro de las porciones codificantes de proteínas del genoma tienen una unidad repetida de tres nucleótidos, ya que esa longitud no causará cambios en el marco de lectura al mutar. [32] Cada secuencia repetida de trinucleótidos se transcribe en una serie repetida del mismo aminoácido. En las levaduras, los aminoácidos repetidos más comunes son glutamina, ácido glutámico, asparagina, ácido aspártico y serina.

Las mutaciones en estos segmentos repetitivos pueden afectar las propiedades físicas y químicas de las proteínas, con el potencial de producir cambios graduales y predecibles en la acción de las proteínas. [33] Por ejemplo, los cambios de longitud en las regiones que se repiten en tándem en el gen Runx2 conducen a diferencias en la longitud facial en perros domésticos ( Canis familiaris ), con una asociación entre longitudes de secuencia más largas y caras más largas. [34] Esta asociación también se aplica a una gama más amplia de especies de Carnivora. [35] Los cambios de longitud en los tractos de polialanina dentro del gen HOXA13 están relacionados con el síndrome mano-pie-genital , un trastorno del desarrollo en humanos. [36] Los cambios de longitud en otras repeticiones de tripletes están relacionados con más de 40 enfermedades neurológicas en humanos, en particular los trastornos de repetición de trinucleótidos como el síndrome del cromosoma X frágil y la enfermedad de Huntington . [10] Los cambios evolutivos por deslizamiento de la replicación también ocurren en organismos más simples. Por ejemplo, los cambios de longitud de microsatélites son comunes dentro de las proteínas de la membrana de la superficie en la levadura, lo que proporciona una rápida evolución en las propiedades celulares. [37] En concreto, los cambios de longitud en el gen FLO1 controlan el nivel de adhesión a los sustratos. [38] Las repeticiones de secuencias cortas también proporcionan un cambio evolutivo rápido a las proteínas de superficie en bacterias patógenas; esto puede permitirles mantenerse al día con los cambios inmunológicos en sus huéspedes. [39] Los cambios de longitud en repeticiones de secuencias cortas en un hongo ( Neurospora crassa ) controlan la duración de sus ciclos de reloj circadiano . [40]

Efectos sobre la regulación genética

Los cambios de longitud de los microsatélites dentro de los promotores y otras regiones reguladoras cis pueden cambiar la expresión génica rápidamente, entre generaciones. El genoma humano contiene muchas repeticiones de secuencias cortas (>16.000) en regiones reguladoras, que proporcionan "perillas de ajuste" en la expresión de muchos genes. [30] [41]

Los cambios de longitud en los SSR bacterianos pueden afectar la formación de fimbrias en Haemophilus influenzae , al alterar el espaciamiento del promotor. [39] Los microsatélites de dinucleótidos están vinculados a una abundante variación en las regiones de control cis-reguladoras en el genoma humano. [41] Los microsatélites en las regiones de control del gen del receptor de vasopresina 1a en topillos influyen en su comportamiento social y su nivel de monogamia. [42]

En el sarcoma de Ewing (un tipo de cáncer óseo doloroso en humanos jóvenes), una mutación puntual ha creado un microsatélite GGAA extendido que se une a un factor de transcripción, que a su vez activa el gen EGR2 que impulsa el cáncer. [43] Además, otros microsatélites GGAA pueden influir en la expresión de genes que contribuyen al resultado clínico de los pacientes con sarcoma de Ewing. [44]

Efectos dentro de los intrones

Los microsatélites dentro de los intrones también influyen en el fenotipo, a través de medios que actualmente no se comprenden. Por ejemplo, una expansión del triplete GAA en el primer intrón del gen X25 parece interferir con la transcripción y causa la ataxia de Friedreich . [45] Las repeticiones en tándem en el primer intrón del gen de la asparagina sintetasa están vinculadas a la leucemia linfoblástica aguda. [46] Un polimorfismo de repetición en el cuarto intrón del gen NOS3 está vinculado a la hipertensión en una población tunecina. [47] Las longitudes de repetición reducidas en el gen EGFR están vinculadas a los osteosarcomas. [48]

Se sabe que una forma arcaica de empalme preservada en el pez cebra utiliza secuencias de microsatélites dentro del ARNm intrónico para la eliminación de intrones en ausencia de U2AF2 y otra maquinaria de empalme. Se teoriza que estas secuencias forman configuraciones de hoja de trébol altamente estables que acercan los sitios de empalme de intrones 3' y 5', reemplazando efectivamente el espliceosoma . Se cree que este método de empalme de ARN se desvió de la evolución humana en la formación de los tetrápodos y representa un artefacto de un mundo de ARN . [49]

Efectos dentro de los transposones

Casi el 50% del genoma humano está contenido en varios tipos de elementos transponibles (también llamados transposones o "genes saltarines"), y muchos de ellos contienen ADN repetitivo. [50] Es probable que las repeticiones de secuencias cortas en esas ubicaciones también estén involucradas en la regulación de la expresión genética. [51]

Aplicaciones

Los microsatélites se utilizan para evaluar las deleciones de ADN cromosómico en el diagnóstico del cáncer. Los microsatélites se utilizan ampliamente para el perfil de ADN , también conocido como "huella genética", de manchas delictivas (en medicina forense) y de tejidos (en pacientes trasplantados). También se utilizan ampliamente en el análisis de parentesco (más comúnmente en pruebas de paternidad). Además, los microsatélites se utilizan para mapear ubicaciones dentro del genoma, específicamente en el análisis de ligamiento genético para localizar un gen o una mutación responsable de un rasgo o enfermedad determinados. Como caso especial de mapeo, se pueden utilizar para estudios de duplicación o deleción de genes . Los investigadores utilizan microsatélites en genética de poblaciones y en proyectos de conservación de especies. Los genetistas de plantas han propuesto el uso de microsatélites para la selección asistida por marcadores de rasgos deseables en el mejoramiento de plantas.

Diagnóstico de cáncer

En las células tumorales , cuyos controles de replicación están dañados, los microsatélites pueden ganarse o perderse con una frecuencia especialmente alta durante cada ronda de mitosis . Por lo tanto, una línea celular tumoral puede mostrar una huella genética diferente de la del tejido huésped y, especialmente en el cáncer colorrectal , puede presentar pérdida de heterocigosidad . [52] [53] Por lo tanto, los microsatélites analizados en el tejido primario se han utilizado rutinariamente en el diagnóstico del cáncer para evaluar la progresión del tumor. [54] [55] [56] Los estudios de asociación del genoma completo (GWAS) se han utilizado para identificar biomarcadores de microsatélites como una fuente de predisposición genética en una variedad de cánceres. [57] [58] [59]

Un perfil STR humano parcial obtenido utilizando el kit Applied Biosystems Identifiler

Toma de huellas dactilares médicas y forenses

El análisis de microsatélites se hizo popular en el campo de la ciencia forense en la década de 1990. [60] Se utiliza para la toma de huellas genéticas de individuos, lo que permite la identificación forense (normalmente, la comparación de una mancha de un delito con una víctima o un perpetrador). También se utiliza para el seguimiento de pacientes con trasplante de médula ósea . [61]

Los microsatélites que se utilizan hoy en día para el análisis forense son todos repeticiones de tetranucleótidos o pentanucleótidos, ya que proporcionan un alto grado de datos libres de errores y al mismo tiempo son lo suficientemente cortos como para sobrevivir a la degradación en condiciones no ideales. Incluso las secuencias de repetición más cortas tenderían a sufrir artefactos como tartamudeo de PCR y amplificación preferencial, mientras que las secuencias de repetición más largas sufrirían más por la degradación ambiental y se amplificarían peor por PCR . [62] Otra consideración forense es que debe respetarse la privacidad médica de la persona , de modo que se elijan STR forenses que no sean codificantes, no influyan en la regulación genética y no sean generalmente STR de trinucleótidos que podrían estar involucrados en enfermedades de expansión de tripletes como la enfermedad de Huntington . Los perfiles de STR forenses se almacenan en bancos de datos de ADN como la Base de Datos Nacional de ADN del Reino Unido (NDNAD), el CODIS estadounidense o el NCIDD australiano.

Análisis de parentesco (prueba de paternidad)

Los microsatélites autosómicos se utilizan ampliamente para la elaboración de perfiles de ADN en el análisis de parentesco (más comúnmente en pruebas de paternidad). [63] Los Y-STR heredados paternalmente (microsatélites en el cromosoma Y ) se utilizan a menudo en pruebas de ADN genealógicas .

Análisis de ligamiento genético

Durante la década de 1990 y los primeros años de este milenio, los microsatélites fueron los marcadores genéticos de primera línea para los escaneos de todo el genoma para localizar cualquier gen responsable de un fenotipo o enfermedad determinados, utilizando observaciones de segregación a lo largo de generaciones de un pedigrí muestreado. Aunque el auge de las plataformas de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) de mayor rendimiento y rentables condujo a la era del SNP para los escaneos del genoma, los microsatélites siguen siendo medidas altamente informativas de la variación genómica para los estudios de ligamiento y asociación. Su ventaja continua radica en su mayor diversidad alélica que los SNP bialélicos, por lo que los microsatélites pueden diferenciar alelos dentro de un bloque de interés de desequilibrio de ligamiento definido por SNP. Por lo tanto, los microsatélites han llevado con éxito a descubrimientos de genes de diabetes tipo 2 ( TCF7L2 ) y cáncer de próstata (la región 8q21). [6] [64]

Genética de poblaciones

Árbol de consenso de unión de vecinos de 249 poblaciones humanas y seis poblaciones de chimpancés. Creado a partir de 246 marcadores microsatélites. [65]

Los microsatélites se popularizaron en la genética de poblaciones durante la década de 1990 porque, a medida que la PCR se volvió omnipresente en los laboratorios, los investigadores pudieron diseñar cebadores y amplificar conjuntos de microsatélites a bajo costo. Sus usos son de amplio alcance. [66] Un microsatélite con una historia evolutiva neutral lo hace aplicable para medir o inferir cuellos de botella , [67] adaptación local , [68] el índice de fijación alélica (F ST ), [69] tamaño de la población , [70] y flujo genético . [71] A medida que la secuenciación de próxima generación se vuelve más asequible, el uso de microsatélites ha disminuido, sin embargo, siguen siendo una herramienta crucial en el campo. [72]

Mejoramiento de plantas

La selección asistida por marcadores o selección asistida por marcadores (MAS) es un proceso de selección indirecta en el que se selecciona un rasgo de interés en función de un marcador ( morfológico , bioquímico o variación de ADN / ARN ) vinculado a un rasgo de interés (por ejemplo, productividad, resistencia a enfermedades, tolerancia al estrés y calidad), en lugar de en función del rasgo en sí. Se ha propuesto el uso de microsatélites como tales marcadores para ayudar al mejoramiento de plantas. [73]

Análisis

Análisis de repeticiones cortas en tándem (STR) en un modelo simplificado mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR): primero, una muestra de ADN se somete a PCR con cebadores que apuntan a ciertos STR (que varían en longitudes entre individuos y sus alelos ). Los fragmentos resultantes se separan por tamaño (como la electroforesis ). [74]

El ADN repetitivo no se analiza fácilmente con métodos de secuenciación de ADN de próxima generación , ya que algunas tecnologías tienen dificultades con los tractos homopoliméricos . Se han creado diversos enfoques de software para el análisis o lecturas de secuenciación de ADN de próxima generación sin procesar para determinar el genotipo y las variantes en loci repetitivos. [75] [76] Los microsatélites se pueden analizar y verificar mediante amplificación por PCR establecida y determinación del tamaño del amplicón, a veces seguidas de secuenciación de ADN de Sanger .

En la ciencia forense, el análisis se realiza extrayendo ADN nuclear de las células de una muestra de interés, para luego amplificar regiones polimórficas específicas del ADN extraído por medio de la reacción en cadena de la polimerasa . Una vez amplificadas estas secuencias, se resuelven ya sea mediante electroforesis en gel o electroforesis capilar , lo que permitirá al analista determinar cuántas repeticiones de la secuencia de microsatélites en cuestión hay. Si el ADN se resolvió mediante electroforesis en gel, el ADN se puede visualizar ya sea mediante tinción de plata (baja sensibilidad, segura, económica), o un colorante intercalante como el bromuro de etidio (bastante sensible, riesgos moderados para la salud, económico), o como utilizan la mayoría de los laboratorios forenses modernos, colorantes fluorescentes (altamente sensibles, seguros, costosos). [77] Los instrumentos construidos para resolver fragmentos de microsatélites mediante electroforesis capilar también utilizan colorantes fluorescentes. [77] Los perfiles forenses se almacenan en importantes bancos de datos. La base de datos británica para la identificación de loci de microsatélites se basó originalmente en el sistema británico SGM+ [78] [79], que utiliza 10 loci y un marcador sexual . Los estadounidenses [80] aumentaron este número a 13 loci. [81] La base de datos australiana se llama NCIDD y, desde 2013, utiliza 18 marcadores básicos para la elaboración de perfiles de ADN. [60]

Amplificación

Los microsatélites se pueden amplificar para su identificación mediante el proceso de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando las secuencias únicas de las regiones flanqueantes como cebadores . El ADN se desnaturaliza repetidamente a alta temperatura para separar la doble cadena, luego se enfría para permitir la hibridación de los cebadores y la extensión de las secuencias de nucleótidos a través del microsatélite. Este proceso da como resultado la producción de suficiente ADN para ser visible en geles de agarosa o poliacrilamida ; solo se necesitan pequeñas cantidades de ADN para la amplificación porque de esta manera el termociclado crea un aumento exponencial en el segmento replicado. [82] Con la abundancia de tecnología de PCR, los cebadores que flanquean los loci de microsatélites son simples y rápidos de usar, pero el desarrollo de cebadores que funcionen correctamente es a menudo un proceso tedioso y costoso.

Varias muestras de ADN de ejemplares de Littorina plena amplificadas mediante reacción en cadena de la polimerasa con cebadores dirigidos a un locus de repetición de secuencia simple variable (SSR, también conocido como microsatélite). Las muestras se analizaron en un gel de poliacrilamida al 5 % y se visualizaron mediante tinción de plata.

Diseño de cebadores de microsatélites

Si se buscan marcadores microsatélites en regiones específicas de un genoma, por ejemplo, dentro de un intrón en particular , los cebadores se pueden diseñar manualmente. Esto implica buscar repeticiones de microsatélites en la secuencia de ADN genómico, lo que se puede hacer a simple vista o utilizando herramientas automatizadas como el enmascarador de repeticiones. Una vez que se determinan los microsatélites potencialmente útiles, las secuencias flanqueantes se pueden utilizar para diseñar cebadores de oligonucleótidos que amplificarán la repetición de microsatélite específica en una reacción de PCR.

Los cebadores de microsatélites aleatorios se pueden desarrollar clonando segmentos aleatorios de ADN de la especie focal. Estos segmentos aleatorios se insertan en un plásmido o vector bacteriófago , que a su vez se implanta en la bacteria Escherichia coli . Luego se desarrollan colonias y se examinan con secuencias de oligonucleótidos marcadas con fluorescencia que se hibridarán con una repetición de microsatélite, si está presente en el segmento de ADN. Si se pueden obtener clones positivos a partir de este procedimiento, se secuencia el ADN y se eligen cebadores de PCR de las secuencias que flanquean dichas regiones para determinar un locus específico . Este proceso implica un ensayo y error significativo por parte de los investigadores, ya que las secuencias de repetición de microsatélites deben predecirse y los cebadores que se aíslan aleatoriamente pueden no mostrar un polimorfismo significativo. [21] [83] Los loci de microsatélites están ampliamente distribuidos por todo el genoma y se pueden aislar del ADN semidegradado de especímenes más antiguos, ya que todo lo que se necesita es un sustrato adecuado para la amplificación a través de PCR.

Las técnicas más recientes implican el uso de secuencias de oligonucleótidos que consisten en repeticiones complementarias a las repeticiones en el microsatélite para "enriquecer" el ADN extraído ( enriquecimiento del microsatélite ). La sonda de oligonucleótidos se hibrida con la repetición en el microsatélite y luego el complejo sonda/microsatélite se extrae de la solución. El ADN enriquecido se clona luego de manera normal, pero la proporción de éxitos ahora será mucho mayor, lo que reducirá drásticamente el tiempo necesario para desarrollar las regiones para su uso. Sin embargo, qué sondas usar puede ser un proceso de prueba y error en sí mismo. [84]

PCR-ISSR

ISSR ( inter-simple sequence repeat , repetición de secuencia intersimple ) es un término general para una región del genoma entre loci de microsatélites. Las secuencias complementarias de dos microsatélites vecinos se utilizan como iniciadores de PCR; la región variable entre ellos se amplifica. La longitud limitada de los ciclos de amplificación durante la PCR evita la replicación excesiva de secuencias de ADN contiguas demasiado largas, por lo que el resultado será una mezcla de una variedad de cadenas de ADN amplificadas que generalmente son cortas pero varían mucho en longitud.

Las secuencias amplificadas por la técnica ISSR-PCR pueden utilizarse para la identificación de huellas genéticas. Dado que una ISSR puede ser una región conservada o no, esta técnica no es útil para distinguir individuos, sino más bien para análisis filogeográficos o tal vez para delimitar especies ; la diversidad de secuencias es menor que en la SSR-PCR, pero aún mayor que en las secuencias de genes reales. Además, la secuenciación de microsatélites y la secuenciación ISSR se ayudan mutuamente, ya que una produce cebadores para la otra.

Limitaciones

El ADN repetitivo no se analiza fácilmente con métodos de secuenciación de ADN de última generación , que tienen dificultades con los tractos homopoliméricos. [85] Por lo tanto, los microsatélites se analizan normalmente mediante amplificación por PCR convencional y determinación del tamaño del amplicón. El uso de PCR significa que el análisis de la longitud de los microsatélites es propenso a limitaciones de PCR como cualquier otro locus de ADN amplificado por PCR. Una preocupación particular es la aparición de " alelos nulos ":

  • Ocasionalmente, dentro de una muestra de individuos, como en los casos de pruebas de paternidad, una mutación en el ADN que flanquea el microsatélite puede impedir que el cebador de PCR se una y produzca un amplicón (creando un "alelo nulo" en un ensayo en gel), por lo que solo se amplifica un alelo (del cromosoma hermano no mutado) y el individuo puede parecer falsamente homocigoto. Esto puede causar confusión en los casos de paternidad. Entonces puede ser necesario amplificar el microsatélite utilizando un conjunto diferente de cebadores. [21] [86] Los alelos nulos son causados ​​especialmente por mutaciones en la sección 3', donde comienza la extensión.
  • En el análisis de especies o poblaciones, por ejemplo en el trabajo de conservación, los iniciadores de PCR que amplifican microsatélites en un individuo o especie pueden funcionar en otras especies. Sin embargo, el riesgo de aplicar iniciadores de PCR en diferentes especies es que es probable que aparezcan alelos nulos, siempre que la divergencia de secuencia sea demasiado grande para que los iniciadores se unan. En ese caso, puede parecer artificialmente que las especies tienen una diversidad reducida. En este caso, los alelos nulos a veces pueden indicarse por una frecuencia excesiva de homocigotos que causa desviaciones de las expectativas de equilibrio de Hardy-Weinberg.

Véase también

Referencias

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  • Todas las repeticiones cortas en tándem causantes de enfermedades conocidas
  • Base de datos de microsatélites
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    • IMEx Archivado el 14 de septiembre de 2013 en Wayback Machine.
    • Buscador de SSR imperfectos Archivado el 23 de julio de 2021 en Wayback Machine : encuentre SSR perfectos o imperfectos en secuencias FASTA .
    • JSTRING: búsqueda en Java de repeticiones en tándem en genomas
    • Buscador de repeticiones de microsatélites
    • MISA—Herramienta de identificación de microsatélites
    • MREPATT
    • Mreps
    • Phobos: una herramienta de búsqueda de repeticiones en tándem para repeticiones perfectas e imperfectas; el tamaño máximo del patrón depende únicamente de la potencia computacional
    • escuela politécnica
    • CienciaRoKo
    • Buscador de SSR
    • ESTRELLA
    • Análisis del genoma de novo de SERF y buscador de repeticiones en tándem
    • Buscador de repeticiones en tándem
    • TándemSWAN
    • TREADO
    • GNOMO
    • El pez cebra se repite Archivado el 12 de septiembre de 2019 en Wayback Machine
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