Tinción de Leishman

La tinción de Leishman , también conocida como tinción de Leishman , se utiliza en microscopía para teñir frotis de sangre . Generalmente se utiliza para diferenciar e identificar glóbulos blancos , parásitos de la malaria y tripanosomas . Se basa en una mezcla metanólica de azul de metileno "policromado" (es decir, desmetilado en varios azures) y eosina . La solución madre metanólica es estable y también sirve para fijar directamente el frotis eliminando un paso de prefijación. Si se prepara una solución de trabajo por dilución con un tampón acuoso, la mezcla resultante es muy inestable y no se puede utilizar durante mucho tiempo. La tinción de Leishman recibe su nombre de su inventor, el patólogo escocés William Boog Leishman . Es una versión de la tinción de Romanowsky y, por lo tanto, es similar y parcialmente reemplazable por la tinción de Giemsa , la tinción de Jenner y la tinción de Wright .

Muchas empresas venden el colorante Leishman en forma de polvo seco, que luego se reconstituye con metanol . ^[1] El calor y la luz brillante oxidan el colorante y provocan la precipitación de precipitados insolubles, como el violeta de metileno (Bernthsen) o las sales de azur-eosinato. ^[2]

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Según el libro de texto de Sir John Vivian Dacie , Practical Haematology , "entre las tinciones de Romanowsky que se utilizan actualmente, la de Jenner es la más sencilla y la de Giemsa la más compleja. La tinción de Leishman, que ocupa una posición intermedia, todavía se utiliza ampliamente en la tinción de rutina".

El protocolo de la OMS ^[3] menciona:

Existen varias combinaciones diferentes de estos colorantes que varían en sus características de tinción. La tinción de May-Grunwald-Giemsa es un buen método para el trabajo de rutina. La tinción de Wright es un método más simple, mientras que la de Leishman también es un método simple que es especialmente adecuado cuando se necesita un frotis de sangre teñido con urgencia o no se dispone de la tinción de rutina (por ejemplo, por la noche). La tinción de Field es una tinción rápida que se utiliza principalmente en frotis delgados para los parásitos de la malaria. Cualquiera que sea el método que se utilice, es importante seleccionar colorantes que no estén contaminados con otros colorantes o sales metálicas.

Sir William Boog Leishman de Londres y Karl Reuter de Alemania descubrieron independientemente en 1901 lo que se considera "Quizás las modificaciones más prácticas de la tinción de Malachowski" ^[4] Adoptaron los mejores aspectos de las tinciones desarrolladas por Malachowski y Jenner, es decir, utilizaron tanto azul de metileno policromado (hecho accidentalmente por Romanowsky que obtuvo el nombre, hecho sistemáticamente por Ernst Malachowski incluso antes que Romanowsky, y redescubierto por Bernhard Nocht, pero desconocido para Jenner, May, Grunwald y muchos otros que usaron azul de metileno simple) y filtraron el precipitado de eosinato azul de la mezcla acuosa y lo redisolvieron en un solvente alcohólico (la sabiduría de Jenner). Las diferencias entre los métodos de Leishman y Reuter fueron: Leishman usó metanol (como Jenner) y sustituyó la eosina B por la eosina Y, mientras que Reuter usó alcohol etílico y enfatizó correctamente la importancia de usar un solvente absolutamente puro. Ambos métodos produjeron una mancha estable y el color púrpura deseado.

La tinción de Leishman generalmente muestra el color violeta brillante del núcleo y los gránulos de neutrófilos, para lo cual el recuento diferencial resulta conveniente y hace que la calidad de la tinción sea mejor que las tinciones que son simples a base de azul de metileno y eosina, que no producen suficiente contraste entre el citoplasma y el núcleo. Dado que Leishman, al igual que otras tinciones de Romanowsky, tiñe mejor los detalles y los gránulos citoplasmáticos, los hematólogos generalmente las prefieren (sin embargo, consulte a continuación sobre los citólogos). En comparación con los reactivos sintéticos puros y tóxicos basados ​​en AZure B y eosina Y utilizados por los métodos de referencia ICSH, que tampoco están libres de la desventaja de oxidarse y eventualmente dar un tono gris en lugar de los colores azules óptimos para el citoplasma, Leishman es una técnica barata, fácilmente disponible y fácil de hacer que brinda un contraste bastante aceptable. ^{[ cita requerida ]}

Se ha documentado que la tinción de Leishman es más sensible que la tinción de Field y tan buena como las tinciones fluorescentes para la detección del parásito de la malaria. ^[5]

La composición del azul de metileno policromado mezclado con eosina nunca es tan buena como las proporciones directamente pesadas y mezcladas en las tinciones tipo Giemsa. Albert Plehn en 1890 ^[6] había descubierto que la relación molar de los colorantes básicos a los ácidos tenía que aumentarse de 2:1 a 3:1, sin embargo, a partir de la época de Jenner (1899) el uso de los cristales de eosinato azul redujo la relación al insatisfactorio 2:1 y la profundidad del color se redujo. Fue solo el trabajo de Gustav Giemsa y similares, quienes nuevamente controlaron manualmente la proporción de estos dos componentes, lo que recuperó la profundidad de la tinción. Sin embargo, Giemsa y otros que controlaron artificialmente la proporción a veces fueron al otro extremo (un gran exceso molar de azul hasta una proporción de 16,1), lo que probablemente era innecesario. Según el ICSH, la proporción óptima es de 6,5 a 7,3. ^[7]

La tinción de Leishman, si se reconstituye con un tampón, se vuelve muy inestable (en contraste con Giemsa, que es relativamente más estable debido al glicerol, o las tinciones de referencia ICSH que utilizan metanol + DMSO en una proporción v/v de 6:4) y comienza a precipitar y necesita una filtración repetida. Si no se supervisa cuidadosamente, la absorción de agua, la evaporación del metanol de un recipiente abierto y la filtración repetida cambian la composición y requieren cambios frecuentes y hacen que este método sea un desperdicio. Si no se filtra, los depósitos de precipitado en el frotis pueden confundirse con plaquetas. Es importante no agitar el frasco de tinción antes de usar, de lo contrario, los precipitados sedimentados se resuspenderían y se depositarían en las películas durante la tinción y causarían numerosos artefactos y dificultarían mucho la microscopía. ^{[ cita requerida ]}

Al igual que todos los demás métodos de Malachowski-Romanowsky-Giemsa, se desvanece con el tiempo y no se puede archivar de forma estable durante mucho tiempo. Además, sus homólogos anteriores tiñen los núcleos de color púrpura oscuro y los detalles de las características nucleares no son tan claros como los de hematoxileno y eosina , que son los preferidos por algunos citopatólogos. Pero de esa manera es un método complementario (ya que tiñe los detalles citoplasmáticos, los gránulos, etc. mejor que la tinción H&E ). ^{[ cita requerida ]}