Dicroísmo lineal

El dicroísmo lineal ( LD ) o diatenuación es la diferencia entre la absorción de luz polarizada paralela y polarizada perpendicularmente a un eje de orientación. ^[1] Es la propiedad de un material cuya transmitancia depende de la orientación de la luz polarizada linealmente que incide sobre él. Como técnica, se utiliza principalmente para estudiar la funcionalidad y la estructura de las moléculas . Las mediciones de LD se basan en la interacción entre la materia y la luz y, por lo tanto, son una forma de espectroscopia electromagnética .

Este efecto se ha aplicado en todo el espectro electromagnético , donde diferentes longitudes de onda de luz pueden investigar una gran cantidad de sistemas químicos. El uso predominante de LD actualmente es en el estudio de biomacromoléculas ( por ejemplo, ADN ), así como polímeros sintéticos .

La LD utiliza luz polarizada linealmente , que es luz que ha sido polarizada en una sola dirección. Esto produce una onda, el vector de campo eléctrico , que oscila en un solo plano, dando lugar a una forma de onda sinusoidal clásica a medida que la luz viaja a través del espacio. Al utilizar luz paralela y perpendicular a la dirección de orientación, es posible medir cuánta energía más se absorbe en una dimensión de la molécula en relación con la otra, lo que proporciona información al experimentador.

A medida que la luz interactúa con la molécula que se está investigando, si la molécula comienza a absorber la luz, la densidad electrónica dentro de la molécula se desplazará a medida que el electrón se fotoexcite . Este movimiento de carga se conoce como transición electrónica , cuya dirección se denomina polarización de transición eléctrica. Esta es la propiedad para la que la LD es una medida.

La LD de una molécula orientada se puede calcular utilizando la siguiente ecuación:

LD = A _║ - A _┴

Donde A _║ es la absorbancia paralela al eje de orientación y A _┴ es la absorbancia perpendicular al eje de orientación.

Tenga en cuenta que se puede utilizar luz de cualquier longitud de onda para generar una señal LD.

Por lo tanto, la señal LD ​​generada tiene dos límites en cuanto a la señal que se puede generar. Para un sistema químico cuya transición eléctrica es paralela al eje de orientación, se puede escribir la siguiente ecuación:

LD = A _║ - A _┴ = A _║ > 0

Para la mayoría de los sistemas químicos, esto representa una transición eléctrica polarizada a lo largo de la molécula (es decir, paralela al eje de orientación).

Alternativamente, se puede encontrar que la polarización de transición eléctrica es perfectamente perpendicular a la orientación de la molécula, dando lugar a la siguiente ecuación:

LD = A _║ - A _┴ = - A _┴ < 0

Esta ecuación representa la señal LD ​​registrada si la transición eléctrica está polarizada a lo ancho de la molécula (es decir, perpendicular al eje de orientación), que en el caso de LD es el más pequeño de los dos ejes investigables.

Por lo tanto, la LD se puede utilizar de dos maneras. Si se conoce la orientación de las moléculas en el flujo ^{[ aclaración necesaria ]} , entonces el experimentador puede observar la dirección de polarización en la molécula (lo que proporciona una idea de la estructura química de una molécula), o si se desconoce la dirección de polarización, se puede utilizar como un medio para determinar qué tan orientada está una molécula en el flujo.

La LD ultravioleta (UV) se emplea normalmente en el análisis de moléculas biológicas, especialmente moléculas grandes, flexibles y largas que resultan difíciles de determinar estructuralmente mediante métodos como la RMN y la difracción de rayos X.

El ADN es casi ideal para la detección por LD UV. La molécula es muy larga y muy delgada, lo que hace que sea muy fácil orientarla en el flujo. Esto da lugar a una fuerte señal de LD. Los sistemas de ADN que se han estudiado mediante LD UV incluyen complejos de ADN- enzima y complejos de ADN- ligando , ^[2] siendo la formación de estos últimos fácilmente observable a través de experimentos cinéticos.

Las proteínas fibrosas , como las proteínas implicadas en la enfermedad de Alzheimer y las proteínas priónicas , cumplen los requisitos de la LD UV, ya que son una clase de moléculas largas y delgadas. Además, las proteínas del citoesqueleto ^[3] también se pueden medir mediante LD.

Se ha monitoreado la inserción de proteínas de membrana en una membrana lipídica utilizando LD, proporcionando al experimentalista información sobre la orientación de la proteína en relación con la membrana lipídica en diferentes puntos temporales.

Además, se han analizado otros tipos de moléculas mediante LD UV, incluidos nanotubos de carbono ^[4] y sus complejos de ligandos asociados.

El sistema de orientación de flujo Couette es el método más utilizado para la orientación de muestras en el análisis de LD por UV. Tiene una serie de características que lo hacen muy adecuado como método de alineación de muestras. El flujo Couette es actualmente el único medio establecido para orientar las moléculas en la fase de solución. Este método también requiere solo cantidades muy pequeñas de muestra de análisis (20 - 40 μL) para generar un espectro de LD. La recirculación constante de la muestra es otra propiedad útil del sistema, que permite realizar muchas mediciones repetidas de cada muestra, lo que disminuye el efecto del ruido en el espectro registrado final.

Su modo de funcionamiento es muy sencillo: la muestra se coloca entre un tubo giratorio y una varilla estacionaria. A medida que la muestra gira dentro de la celda, el haz de luz la atraviesa y la absorbancia paralela se calcula a partir de la luz polarizada horizontalmente y la absorbancia perpendicular a partir de la luz polarizada verticalmente. El método de LD por UV de flujo Couette es actualmente el único método comercialmente disponible para orientar LD.

El dicroísmo lineal con película estirada es un método de orientación basado en la incorporación de las moléculas de la muestra en una película de polietileno. ^[5] A continuación, se estira la película de polietileno, lo que hace que las moléculas orientadas aleatoriamente sobre la película "sigan" el movimiento de la película. El estiramiento de la película hace que las moléculas de la muestra se orienten en la dirección del estiramiento.

La espectroscopia de dicroísmo circular (LD) es muy similar al dicroísmo circular (CD), pero con dos diferencias importantes. (i) La espectroscopia de CD utiliza luz polarizada circularmente mientras que la LD utiliza luz polarizada linealmente. (ii) En los experimentos de CD, las moléculas suelen estar libres en solución, por lo que están orientadas aleatoriamente. El espectro observado es entonces una función únicamente de la naturaleza quiral o asimétrica de las moléculas en la solución. Con biomacromoléculas, la CD es particularmente útil para determinar la estructura secundaria. Por el contrario, en los experimentos de LD, las moléculas deben tener una orientación preferencial, de lo contrario, la LD=0. Con las biomacromoléculas, a menudo se utiliza la orientación del flujo; otros métodos incluyen películas estiradas, campos magnéticos y geles comprimidos. Por lo tanto, la LD proporciona información como la alineación en una superficie o la unión de una molécula pequeña a una macromolécula orientada al flujo, lo que le otorga una funcionalidad diferente a otras técnicas espectroscópicas. Las diferencias entre la LD y la CD son complementarias y pueden ser un medio potente para dilucidar la estructura de las moléculas biológicas cuando se utilizan conjuntamente, ya que la combinación de técnicas revela mucha más información que una sola técnica por separado. Por ejemplo, la CD nos dice cuándo se pliega un péptido o proteína de membrana, mientras que la LD nos dice cuándo se inserta en una membrana. ^[6]

El dicroísmo lineal detectado por fluorescencia (FDLD) es una técnica muy útil para el experimentador, ya que combina las ventajas del LD UV y al mismo tiempo ofrece la detección confocal de la emisión de fluorescencia. ^[7] El FDLD tiene aplicaciones en microscopía, donde se puede utilizar como un medio de mapeo de superficies bidimensional a través de espectroscopia de polarización diferencial (DPS), donde la anisotropía del objeto escaneado permite registrar una imagen. El FDLD también se puede utilizar junto con colorantes fluorescentes intercalados (que también se pueden controlar mediante LD UV). La diferencia de intensidad registrada entre los dos tipos de luz polarizada para la lectura de fluorescencia es proporcional a la señal de LD UV, lo que permite el uso de DPS para obtener imágenes de superficies.