Microscopía electrónica de transmisión

La microscopía electrónica de transmisión ( MET ) es una técnica de microscopía en la que se transmite un haz de electrones a través de una muestra para formar una imagen. La muestra suele ser una sección ultrafina de menos de 100 nm de espesor o una suspensión en una rejilla. Se forma una imagen a partir de la interacción de los electrones con la muestra a medida que el haz se transmite a través de la muestra. Luego, la imagen se amplía y se enfoca en un dispositivo de obtención de imágenes, como una pantalla fluorescente , una capa de película fotográfica o un detector como un centelleador conectado a un dispositivo acoplado a la carga o un detector directo de electrones.

Los microscopios electrónicos de transmisión son capaces de obtener imágenes con una resolución significativamente mayor que los microscopios ópticos , debido a la menor longitud de onda de De Broglie de los electrones. Esto permite al instrumento capturar detalles finos, incluso tan pequeños como una sola columna de átomos, que es miles de veces más pequeña que un objeto resoluble visto en un microscopio óptico. La microscopía electrónica de transmisión es un método analítico importante en las ciencias físicas, químicas y biológicas. Los TEM encuentran aplicación en la investigación del cáncer , la virología y la ciencia de los materiales , así como en la investigación sobre la contaminación , la nanotecnología y los semiconductores , pero también en otros campos como la paleontología y la palinología .

Los instrumentos TEM tienen múltiples modos de funcionamiento, entre ellos, la obtención de imágenes convencionales, la obtención de imágenes por TEM de barrido (STEM), la difracción, la espectroscopia y combinaciones de estos. Incluso en el ámbito de la obtención de imágenes convencionales, existen muchas formas fundamentalmente diferentes de producir contraste, denominadas "mecanismos de contraste de imagen". El contraste puede surgir de diferencias de posición a posición en el espesor o la densidad ("contraste masa-espesor"), el número atómico ("contraste Z", en referencia a la abreviatura común Z para número atómico), la estructura u orientación cristalina ("contraste cristalográfico" o "contraste de difracción"), los ligeros cambios de fase mecánico-cuánticos que producen los átomos individuales en los electrones que pasan a través de ellos ("contraste de fase"), la energía perdida por los electrones al pasar a través de la muestra ("obtención de imágenes espectrales") y más. Cada mecanismo proporciona al usuario un tipo diferente de información, que depende no solo del mecanismo de contraste, sino también de cómo se utiliza el microscopio: la configuración de las lentes, las aberturas y los detectores. Esto significa que un TEM es capaz de devolver una extraordinaria variedad de información con resolución atómica y nanométrica, que en casos ideales revela no sólo dónde están todos los átomos, sino también qué tipo de átomos son y cómo están unidos entre sí. Por este motivo, el TEM se considera una herramienta esencial para la nanociencia, tanto en el campo de la biología como en el de los materiales.

El primer TEM fue demostrado por Max Knoll y Ernst Ruska en 1931, y este grupo desarrolló el primer TEM con una resolución mayor que la de la luz en 1933 y el primer TEM comercial en 1939. En 1986, Ruska recibió el Premio Nobel de Física por el desarrollo de la microscopía electrónica de transmisión. ^[2]

En 1873, Ernst Abbe propuso que la capacidad de resolver detalles en un objeto estaba limitada aproximadamente por la longitud de onda de la luz utilizada en la obtención de imágenes o unos pocos cientos de nanómetros para los microscopios de luz visible. Los avances en microscopios ultravioleta (UV), liderados por Köhler y Rohr , aumentaron el poder de resolución en un factor de dos. ^[3] Sin embargo, esto requería una costosa óptica de cuarzo, debido a la absorción de UV por el vidrio. Se creía que obtener una imagen con información submicrométrica no era posible debido a esta restricción de longitud de onda. ^[4]

En 1858, Plücker observó la desviación de los "rayos catódicos" ( electrones ) por los campos magnéticos. ^[5] Este efecto fue utilizado por Ferdinand Braun en 1897 para construir dispositivos de medición simples, los osciloscopios de rayos catódicos (CRO). ^[6] En 1891, Eduard Riecke notó que los rayos catódicos podían ser enfocados por campos magnéticos, lo que permitió diseños simples de lentes electromagnéticas. En 1926, Hans Busch publicó un trabajo que extendía esta teoría y demostró que la ecuación del fabricante de lentes podía, con las suposiciones apropiadas, aplicarse a los electrones. ^[2]

En 1928, en la Technische Hochschule de Charlottenburg (ahora Technische Universität Berlin ), Adolf Matthias, profesor de Tecnología de Alto Voltaje e Instalaciones Eléctricas, nombró a Max Knoll para dirigir un equipo de investigadores para avanzar en el diseño del CRO. El equipo estaba formado por varios estudiantes de doctorado, entre ellos Ernst Ruska y Bodo von Borries . El equipo de investigación trabajó en el diseño de lentes y la colocación de columnas CRO, para optimizar los parámetros para construir mejores CRO y fabricar componentes ópticos electrónicos para generar imágenes de bajo aumento (casi 1:1). En 1931, el grupo generó con éxito imágenes magnificadas de rejillas de malla colocadas sobre la apertura del ánodo. El dispositivo utilizó dos lentes magnéticas para lograr mayores aumentos, creando posiblemente el primer microscopio electrónico . En ese mismo año, Reinhold Rudenberg , el director científico de la empresa Siemens , patentó un microscopio electrónico de lente electrostática . ^{[4] [7]}

En aquella época, se pensaba que los electrones eran partículas cargadas de materia; la naturaleza ondulatoria de los electrones no se comprendió plenamente hasta la tesis doctoral de Louis de Broglie en 1924. ^[8] El grupo de investigación de Knoll no tuvo conocimiento de esta publicación hasta 1932, cuando se dieron cuenta de que la longitud de onda de los electrones de De Broglie era muchos órdenes de magnitud menor que la de la luz, lo que teóricamente permitía la obtención de imágenes a escala atómica. (Incluso para electrones con una energía cinética de solo 1 electronvoltio, la longitud de onda ya es tan corta como 1,18  nm ). En abril de 1932, Ruska sugirió la construcción de un nuevo microscopio electrónico para la obtención de imágenes directas de muestras insertadas en el microscopio, en lugar de simples rejillas de malla o imágenes de aberturas. Con este dispositivo se logró una difracción exitosa y la obtención de imágenes normales de una lámina de aluminio. Sin embargo, el aumento alcanzable era menor que con la microscopía óptica. En septiembre de 1933 se lograron aumentos mayores que los disponibles con un microscopio óptico, con imágenes de fibras de algodón adquiridas rápidamente antes de ser dañadas por el haz de electrones. ^[4]

En esa época, el interés por el microscopio electrónico había aumentado y otros grupos, como el de Paul Anderson y Kenneth Fitzsimmons de la Universidad Estatal de Washington ^[9] y el de Albert Prebus y James Hillier de la Universidad de Toronto , que construyeron los primeros TEM en América del Norte en 1935 y 1938, respectivamente, ^[10], avanzaron continuamente en el diseño de TEM.

En 1936, Siemens continuó con la investigación sobre el microscopio electrónico , cuyo objetivo era el desarrollo y la mejora de las propiedades de las imágenes TEM, en particular en lo que respecta a especímenes biológicos. En esa época, se fabricaban microscopios electrónicos para grupos específicos, como el dispositivo "EM1" utilizado en el Laboratorio Nacional de Física del Reino Unido. ^[11] En 1939, se instaló el primer microscopio electrónico comercial, en la imagen, en el departamento de Física de IG Farben -Werke. El trabajo posterior en el microscopio electrónico se vio obstaculizado por la destrucción de un nuevo laboratorio construido en Siemens por un ataque aéreo , así como por la muerte de dos de los investigadores, Heinz Müller y Friedrick Krause durante la Segunda Guerra Mundial . ^[12]

Después de la Segunda Guerra Mundial, Ruska volvió a trabajar en Siemens, donde continuó desarrollando el microscopio electrónico, produciendo el primer microscopio con aumento de 100k. ^[12] La estructura fundamental de este diseño de microscopio, con óptica de preparación de haz de múltiples etapas, todavía se utiliza en microscopios modernos. La comunidad mundial de microscopía electrónica avanzó con microscopios electrónicos que se fabricaban en Manchester, Reino Unido, EE. UU. (RCA), Alemania (Siemens) y Japón (JEOL). La primera conferencia internacional sobre microscopía electrónica se celebró en Delft en 1949, con más de cien asistentes. ^[11] Las conferencias posteriores incluyeron la "Primera" conferencia internacional en París, en 1950, y luego en Londres en 1954.

Con el desarrollo de la microscopía electrónica de transmisión por barrido (MET), se volvió a investigar la técnica asociada de la microscopía electrónica de transmisión por barrido (STEM), que permaneció sin desarrollar hasta la década de 1970, cuando Albert Crewe, de la Universidad de Chicago, desarrolló el cañón de emisión de campo ^[13] y añadió una lente objetivo de alta calidad para crear el STEM moderno. Con este diseño, Crewe demostró la capacidad de obtener imágenes de átomos mediante imágenes de campo oscuro anulares . Crewe y sus colaboradores de la Universidad de Chicago desarrollaron la fuente de emisión de electrones de campo frío y construyeron un STEM capaz de visualizar átomos pesados ​​individuales en sustratos de carbono delgados. ^[14]

En teoría, la resolución máxima, d , que se puede obtener con un microscopio óptico está limitada por la longitud de onda de los fotones ( λ ) y la apertura numérica NA del sistema. ^[15]

${\displaystyle d={\frac {\lambda }{2n\sin \alpha }}\approx {\frac {\lambda }{2\,{\textrm {NA}}}}}$

donde n es el índice de refracción del medio en el que trabaja la lente y α es el semiángulo máximo del cono de luz que puede entrar en la lente (véase apertura numérica ). ^[16] Los científicos de principios del siglo XX teorizaron formas de sortear las limitaciones de la longitud de onda relativamente grande de la luz visible (longitudes de onda de 400 a 700 nanómetros ) utilizando electrones. Como toda materia, los electrones tienen propiedades tanto de onda como de partícula ( onda de materia ), y sus propiedades ondulatorias significan que un haz de electrones puede enfocarse y difractarse de forma muy similar a la luz. La longitud de onda de los electrones está relacionada con su energía cinética a través de la ecuación de De Broglie, que dice que la longitud de onda es inversamente proporcional al momento. Teniendo en cuenta los efectos relativistas (como en un TEM la velocidad de un electrón es una fracción sustancial de la velocidad de la luz,  c ^[17] ), la longitud de onda es

${\displaystyle \lambda _{e}={\frac {h}{\sqrt {2m_{0}E\left(1+{\frac {E}{2m_{0}c^{2}}}\right)}}}}$

donde h es la constante de Planck , m ₀ es la masa en reposo de un electrón y E es la energía cinética del electrón acelerado.

De arriba hacia abajo, el TEM consta de una fuente de emisión o cátodo, que puede ser un filamento de tungsteno , un monocristal de hexaboruro de lantano ( LaB ₆ ) o un cañón de emisión de campo . ^[18] El cañón está conectado a una fuente de alto voltaje (normalmente ~100–300 kV) y emite electrones mediante emisión termoiónica o de electrones de campo en el vacío. En el caso de una fuente termoiónica, la fuente de electrones está montada en un cilindro Wehnelt para proporcionar un enfoque preliminar de los electrones emitidos en un haz mientras también estabiliza la corriente utilizando un circuito de retroalimentación pasivo. Una fuente de emisión de campo utiliza en cambio electrodos electrostáticos llamados extractor, supresor y lente de cañón, con diferentes voltajes en cada uno, para controlar la forma e intensidad del campo eléctrico cerca de la punta afilada. La combinación del cátodo y estos primeros elementos de lente electrostática se denomina colectivamente "cañón de electrones". Después de salir del cañón, el haz se acelera hasta alcanzar su voltaje final y entrar en la siguiente parte del microscopio: el sistema de lentes condensadoras. Estas lentes superiores del TEM enfocan aún más el haz de electrones hacia el tamaño y la ubicación deseados en la muestra. ^[19]

La manipulación del haz de electrones se realiza mediante dos efectos físicos. La interacción de los electrones con un campo magnético hará que los electrones se muevan según la regla de la mano izquierda , lo que permite que los electroimanes manipulen el haz de electrones. Además, los campos electrostáticos pueden hacer que los electrones se desvíen en un ángulo constante. El acoplamiento de dos desviaciones en direcciones opuestas con un pequeño espacio intermedio permite la formación de un cambio en la trayectoria del haz, lo que permite el desplazamiento del haz.

Las lentes de un TEM son las que le dan su flexibilidad de modos de funcionamiento y la capacidad de enfocar haces a escala atómica y magnificarlos para obtener una imagen. Una lente suele estar hecha de una bobina de solenoide casi rodeada de materiales ferromagnéticos diseñados para concentrar el campo magnético de la bobina en una forma precisa y limitada. Cuando un electrón entra y sale de este campo magnético, gira en espiral alrededor de las líneas curvas del campo magnético de una manera que actúa de forma muy similar a como lo hace una lente de vidrio común para la luz: es una lente convergente. Pero, a diferencia de una lente de vidrio, una lente magnética puede cambiar muy fácilmente su poder de enfoque ajustando la corriente que pasa a través de las bobinas.

Igualmente importantes que las lentes son las aberturas. Se trata de orificios circulares en tiras delgadas de metal pesado. Algunas tienen un tamaño y una posición fijos y desempeñan un papel importante en la limitación de la generación de rayos X y la mejora del rendimiento del vacío. Otras pueden cambiarse libremente entre varios tamaños diferentes y se pueden ajustar sus posiciones. Las aberturas variables después de la muestra permiten al usuario seleccionar el rango de posiciones espaciales o ángulos de dispersión de electrones que se utilizarán en la formación de una imagen o un patrón de difracción.

El sistema electroóptico también incluye deflectores y estigmatizadores, generalmente hechos de pequeños electroimanes. Los deflectores permiten controlar de forma independiente la posición y el ángulo del haz en la posición de la muestra y también garantizan que los haces permanezcan cerca de los centros de baja aberración de cada lente en las pilas de lentes. Los estigmatizadores compensan las pequeñas imperfecciones y aberraciones que causan astigmatismo (una lente que tiene una fuerza focal diferente en diferentes direcciones).

Por lo general, un TEM consta de tres etapas de lente. Las etapas son las lentes condensadoras, las lentes objetivo y las lentes proyectoras. Las lentes condensadoras son responsables de la formación del haz primario, mientras que las lentes objetivo enfocan el haz que pasa a través de la muestra misma (en el modo de escaneo STEM, también hay lentes objetivo sobre la muestra para hacer que el haz de electrones incidente sea convergente). Las lentes proyectoras se utilizan para expandir el haz sobre la pantalla de fósforo u otro dispositivo de imagen, como una película. La ampliación del TEM se debe a la relación de las distancias entre la muestra y el plano de imagen de la lente objetivo. ^[20] Las configuraciones ópticas de TEM difieren significativamente con la implementación, y los fabricantes utilizan configuraciones de lentes personalizadas, como en los instrumentos con aberración esférica corregida, ^[19] o TEM que utilizan filtrado de energía para corregir la aberración cromática de electrones .

El teorema de reciprocidad óptica, o principio de reciprocidad de Helmholtz , generalmente es válido para electrones dispersos elásticamente , como suele ser el caso en condiciones de funcionamiento estándar de TEM. ^{[21] [22]} El teorema establece que la amplitud de onda en algún punto B como resultado de la fuente puntual de electrones A sería la misma que la amplitud en A debido a una fuente puntual equivalente colocada en B. ^[22] En términos simples, la función de onda para electrones enfocados a través de cualquier serie de componentes ópticos que incluya solo campos escalares (es decir, no magnéticos) será exactamente equivalente si la fuente de electrones y el punto de observación se invierten.

La reciprocidad se utiliza para comprender la microscopía electrónica de transmisión de barrido (STEM) en el contexto familiar de TEM y para obtener e interpretar imágenes utilizando STEM.

Los factores clave a tener en cuenta a la hora de considerar la detección de electrones incluyen la eficiencia cuántica de detección (DQE) , la función de dispersión de puntos (PSF) , la función de transferencia de modulación (MTF) , el tamaño de píxel y el tamaño de la matriz, el ruido, la velocidad de lectura de datos y la dureza de la radiación. ^[23]

Los sistemas de imágenes en un TEM consisten en una pantalla de fósforo, que puede estar hecha de sulfuro de zinc particulado fino (10–100 μm) , para observación directa por parte del operador, y un sistema de registro de imágenes como película fotográfica , ^[24] CCD acoplados a pantalla YAG dopados , ^[25] u otro detector digital. ^[23] Normalmente, estos dispositivos se pueden quitar o insertar en la trayectoria del haz según sea necesario. (La película fotográfica ya no se utiliza). El primer informe sobre el uso de un detector de dispositivo acoplado a carga (CCD) para TEM fue en 1982, ^[26] pero la tecnología no encontró un uso generalizado hasta finales de la década de 1990 y principios de la de 2000. ^[27] Los sensores de píxeles activos monolíticos (MAPS) también se utilizaron en TEM. ^{[28] Los detectores} CMOS , que son más rápidos y más resistentes al daño por radiación que los CCD, se han utilizado para TEM desde 2005. ^{[29] [30]} A principios de la década de 2010, un mayor desarrollo de la tecnología CMOS permitió la detección de recuentos de electrones individuales ("modo de recuento"). ^{[31] [32]} Estos detectores de electrones directos están disponibles en Gatan , FEI , Quantum Detectors y Direct Electron. ^[28]

Un TEM se compone de varios componentes, entre los que se incluyen un sistema de vacío en el que viajan los electrones, una fuente de emisión de electrones para generar el flujo de electrones, una serie de lentes electromagnéticas y placas electrostáticas. Estas dos últimas permiten al operador guiar y manipular el haz según sea necesario. También se requiere un dispositivo que permita la inserción, el movimiento dentro y la extracción de muestras de la trayectoria del haz. Posteriormente se utilizan dispositivos de formación de imágenes para crear una imagen de los electrones que salen del sistema.

Para aumentar el camino libre medio de la interacción electrón-gas, un TEM estándar se evacua a presiones bajas, típicamente del orden de10 ⁻⁴  Pa . ^[33] La necesidad de esto es doble: primero, la tolerancia para la diferencia de voltaje entre el cátodo y el suelo sin generar un arco, y segundo, reducir la frecuencia de colisión de los electrones con los átomos de gas a niveles insignificantes; este efecto se caracteriza por el camino libre medio . Los componentes de TEM, como los portamuestras y los cartuchos de película, deben insertarse o reemplazarse de manera rutinaria, lo que requiere un sistema con la capacidad de volver a evacuar de manera regular. Como tal, los TEM están equipados con múltiples sistemas de bombeo y esclusas de aire y no están sellados al vacío de forma permanente.

El sistema de vacío para evacuar un TEM hasta un nivel de presión de operación consta de varias etapas. Inicialmente, se logra un vacío bajo o preliminar con una bomba de paletas rotativas o bombas de diafragma que establecen una presión suficientemente baja para permitir el funcionamiento de una bomba turbomolecular o de difusión que establezca el alto nivel de vacío necesario para las operaciones. Para permitir que la bomba de bajo vacío no requiera un funcionamiento continuo, mientras que las bombas turbomoleculares funcionan continuamente, el lado de vacío de una bomba de baja presión puede conectarse a cámaras que alojan los gases de escape de la bomba turbomolecular. ^[34] Las secciones del TEM pueden aislarse mediante el uso de aberturas limitadoras de presión para permitir diferentes niveles de vacío en áreas específicas, como un vacío más alto de 10 ⁻⁴ a 10 ⁻⁷ Pa o superior en el cañón de electrones en TEM de alta resolución o de emisión de campo.

Los TEM de alto voltaje requieren vacíos ultra altos en el rango de 10 ⁻⁷ a 10 ⁻⁹ Pa para evitar la generación de un arco eléctrico, particularmente en el cátodo del TEM. ^[35] Por lo tanto, para los TEM de mayor voltaje puede funcionar un tercer sistema de vacío, con la pistola aislada de la cámara principal ya sea por válvulas de compuerta o una abertura de bombeo diferencial, un pequeño orificio que evita la difusión de moléculas de gas en el área de la pistola de mayor vacío más rápido de lo que pueden ser bombeadas hacia afuera. Para estas presiones muy bajas, se utiliza una bomba de iones o un material absorbente .

Un vacío deficiente en un TEM puede causar varios problemas que van desde la deposición de gas dentro del TEM sobre la muestra mientras se observa en un proceso conocido como deposición inducida por haz de electrones hasta daños más graves en el cátodo causados ​​por descarga eléctrica. ^[35] El uso de una trampa fría para adsorber gases sublimados en las proximidades de la muestra elimina en gran medida los problemas de vacío que son causados ​​por la sublimación de la muestra . ^[34]

Los diseños de platinas para muestras TEM incluyen esclusas de aire para permitir la inserción del portamuestras en el vacío con una pérdida mínima de vacío en otras áreas del microscopio. Los portamuestras sostienen una rejilla de muestra de tamaño estándar o una muestra autoportante. Los tamaños de rejilla TEM estándar son de 3,05 mm de diámetro, con un grosor y un tamaño de malla que varían de unos pocos a 100 μm. La muestra se coloca sobre el área de la malla que tiene un diámetro de aproximadamente 2,5 mm. Los materiales de rejilla habituales son cobre, molibdeno, oro o platino. Esta rejilla se coloca en el portamuestras, que está emparejado con la platina para muestras. Existe una amplia variedad de diseños de platinas y portamuestras, según el tipo de experimento que se realice. Además de las rejillas de 3,05 mm, a veces, aunque raramente, se utilizan rejillas de 2,3 mm. Estas rejillas se utilizaron particularmente en las ciencias minerales, donde se puede requerir un gran grado de inclinación y donde el material de la muestra puede ser extremadamente raro. Las muestras transparentes a los electrones tienen un espesor normalmente inferior a 100 nm, pero este valor depende del voltaje de aceleración.

Una vez insertada en un TEM, la muestra debe manipularse para ubicar la región de interés para el haz, como en la difracción de grano único , en una orientación específica. Para adaptarse a esto, la platina TEM permite el movimiento de la muestra en el plano XY, el ajuste de la altura Z y, comúnmente, una sola dirección de inclinación paralela al eje de los soportes de entrada lateral. La rotación de la muestra puede estar disponible en soportes y platinas de difracción especializados. Algunos TEM modernos brindan la capacidad de dos ángulos de inclinación ortogonales de movimiento con diseños de soporte especializados llamados soportes de muestra de doble inclinación. Algunos diseños de platina, como las platinas de entrada superior o de inserción vertical, que alguna vez fueron comunes para los estudios TEM de alta resolución, pueden simplemente tener disponible solo la traslación XY. Los criterios de diseño de las platinas TEM son complejos, debido a los requisitos simultáneos de restricciones mecánicas y electrón-ópticas, y hay modelos especializados disponibles para diferentes métodos.

Se requiere que una platina TEM tenga la capacidad de sostener una muestra y ser manipulada para llevar la región de interés a la trayectoria del haz de electrones. Como el TEM puede operar en un amplio rango de aumentos, la platina debe ser simultáneamente muy resistente a la deriva mecánica, con requisitos de deriva tan bajos como unos pocos nm/minuto mientras que puede moverse varios μm/minuto, con una precisión de reposicionamiento del orden de nanómetros. ^[36] Los diseños anteriores de TEM lograron esto con un conjunto complejo de dispositivos mecánicos de reducción de engranajes, que permiten al operador controlar finamente el movimiento de la platina mediante varias varillas giratorias. Los dispositivos modernos pueden utilizar diseños de platina eléctricos, utilizando engranajes de tornillo en conjunto con motores paso a paso , proporcionando al operador una entrada de platina basada en computadora, como un joystick o una bola de seguimiento .

Existen dos diseños principales para las etapas de un TEM: la versión de entrada lateral y la de entrada superior. ^[25] Cada diseño debe adaptarse al soporte correspondiente para permitir la inserción de la muestra sin dañar la delicada óptica del TEM ni permitir que entre gas en los sistemas TEM al vacío.

El más común es el soporte de entrada lateral, donde la muestra se coloca cerca de la punta de una varilla larga de metal (latón o acero inoxidable), con la muestra colocada plana en un pequeño orificio. A lo largo de la varilla hay varios anillos de vacío de polímero para permitir la formación de un sello de vacío de calidad suficiente, cuando se inserta en la platina. Por lo tanto, la platina está diseñada para acomodar la varilla, colocando la muestra entre o cerca de la lente del objetivo, según el diseño del objetivo. Cuando se inserta en la platina, el soporte de entrada lateral tiene su punta contenida dentro del vacío del TEM, y la base se presenta a la atmósfera, la esclusa de aire formada por los anillos de vacío.

Los procedimientos de inserción para soportes TEM de entrada lateral generalmente implican la rotación de la muestra para activar microinterruptores que inician la evacuación de la esclusa de aire antes de que la muestra se inserte en la columna TEM.

El segundo diseño es el soporte de entrada superior que consiste en un cartucho de varios centímetros de largo con un orificio perforado a lo largo del eje del cartucho. La muestra se carga en el orificio, posiblemente utilizando un pequeño anillo de tornillo para mantener la muestra en su lugar. Este cartucho se inserta en una esclusa de aire con el orificio perpendicular al eje óptico del TEM. Cuando está sellado, la esclusa de aire se manipula para empujar el cartucho de manera que caiga en su lugar, donde el orificio del orificio se alinea con el eje del haz, de modo que el haz viaja por el orificio del cartucho y dentro de la muestra. Estos diseños normalmente no se pueden inclinar sin bloquear la trayectoria del haz o interferir con la lente del objetivo. ^[25]

El cañón de electrones está formado por varios componentes: el filamento, un circuito de polarización, una tapa Wehnelt y un ánodo de extracción. Al conectar el filamento a la fuente de alimentación del componente negativo, los electrones pueden ser "bombeados" desde el cañón de electrones a la placa del ánodo y a la columna TEM, completando así el circuito. El cañón está diseñado para crear un haz de electrones que salen del conjunto en un ángulo determinado, conocido como semiángulo de divergencia del cañón, α. Al construir el cilindro Wehnelt de manera que tenga una carga negativa más alta que el propio filamento, los electrones que salen del filamento de manera divergente son, bajo un funcionamiento adecuado, forzados a formar un patrón convergente cuyo tamaño mínimo es el diámetro de cruce del cañón.

La densidad de corriente de emisión termoiónica, J , se puede relacionar con la función de trabajo del material emisor a través de la ley de Richardson.

${\displaystyle J=AT^{2}\exp \left({\frac {-\Phi }{kT}}\right),}$

donde A es la constante de Richardson , Φ es la función de trabajo y T es la temperatura del material. ^[25]

Esta ecuación muestra que para lograr una densidad de corriente suficiente es necesario calentar el emisor, teniendo cuidado de no causar daños por la aplicación de calor excesivo. Por esta razón, se requieren materiales con un punto de fusión alto, como el tungsteno, o aquellos con una función de trabajo baja (LaB _{6 ) para el filamento de la pistola.} ^[37] Además, tanto las fuentes termoiónicas de hexaboruro de lantano como las de tungsteno deben calentarse para lograr la emisión termoiónica, esto se puede lograr mediante el uso de una pequeña tira resistiva. Para evitar el choque térmico, a menudo se aplica un retraso en la aplicación de corriente a la punta, para evitar que los gradientes térmicos dañen el filamento, el retraso suele ser de unos pocos segundos para LaB ₆ , y significativamente menor para el tungsteno ^{[ cita requerida ]} .

Las lentes electrónicas están diseñadas para actuar de una manera que emula la de una lente óptica, enfocando electrones paralelos a una distancia focal constante. Las lentes electrónicas pueden operar electrostáticamente o magnéticamente. La mayoría de las lentes electrónicas para TEM utilizan bobinas electromagnéticas para generar una lente convexa . El campo producido para la lente debe ser radialmente simétrico, ya que la desviación de la simetría radial de la lente magnética causa aberraciones como el astigmatismo y empeora la aberración esférica y cromática . Las lentes electrónicas se fabrican a partir de hierro, aleaciones de hierro-cobalto o níquel-cobalto, ^[38] como permalloy . Estos se seleccionan por sus propiedades magnéticas, como la saturación magnética , la histéresis y la permeabilidad .

Los componentes incluyen el yugo, la bobina magnética, los polos, la pieza polar y el circuito de control externo. La pieza polar debe fabricarse de manera muy simétrica, ya que esto proporciona las condiciones límite para el campo magnético que forma la lente. Las imperfecciones en la fabricación de la pieza polar pueden inducir distorsiones graves en la simetría del campo magnético, que inducen distorsiones que en última instancia limitarán la capacidad de las lentes para reproducir el plano del objeto. Las dimensiones exactas del espacio, el diámetro interno de la pieza polar y la conicidad, así como el diseño general de la lente, a menudo se realizan mediante análisis de elementos finitos del campo magnético, al tiempo que se consideran las restricciones térmicas y eléctricas del diseño. ^[38]

Las bobinas que producen el campo magnético están ubicadas dentro del yugo de la lente. Las bobinas pueden contener una corriente variable, pero normalmente utilizan voltajes altos y, por lo tanto, requieren un aislamiento significativo para evitar cortocircuitos en los componentes de la lente. Se colocan distribuidores térmicos para garantizar la extracción del calor generado por la energía perdida por la resistencia de los devanados de las bobinas. Los devanados pueden estar refrigerados por agua, utilizando un suministro de agua helada para facilitar la eliminación de la alta carga térmica.

Las aberturas son placas metálicas anulares a través de las cuales se pueden excluir los electrones que están más allá de una distancia fija del eje óptico . Consisten en un pequeño disco metálico que es lo suficientemente grueso para evitar que los electrones pasen a través del disco, mientras que permite el paso de electrones axiales. Esta posibilidad de permitir el paso de electrones centrales en un TEM causa dos efectos simultáneamente: en primer lugar, las aberturas disminuyen la intensidad del haz a medida que los electrones se filtran del haz, lo que puede ser deseable en el caso de muestras sensibles al haz. En segundo lugar, este filtrado elimina los electrones que se dispersan en ángulos altos, lo que puede deberse a procesos no deseados como la aberración esférica o cromática, o debido a la difracción de la interacción dentro de la muestra. ^[39]

Las aberturas pueden ser una abertura fija dentro de la columna, como en la lente del condensador, o una abertura móvil, que puede insertarse o retirarse de la trayectoria del haz, o moverse en el plano perpendicular a la trayectoria del haz. Los conjuntos de aberturas son dispositivos mecánicos que permiten la selección de diferentes tamaños de aberturas, que pueden ser utilizados por el operador para equilibrar la intensidad y el efecto de filtrado de la abertura. Los conjuntos de aberturas suelen estar equipados con micrómetros para mover la abertura, lo que es necesario durante la calibración óptica.

Los métodos de obtención de imágenes en TEM utilizan la información contenida en las ondas de electrones que salen de la muestra para formar una imagen. Las lentes del proyector permiten la correcta colocación de esta distribución de ondas de electrones en el sistema de visualización. La intensidad observada, I , de la imagen, suponiendo que el dispositivo de obtención de imágenes es de una calidad suficientemente alta, puede aproximarse como proporcional al valor absoluto al cuadrado promediado en el tiempo de la amplitud de las funciones de onda de los electrones, donde la onda que forma el haz de salida se denota por Ψ. ^[40]

${\displaystyle I(x)={\frac {k}{t_{1}-t_{0}}}\int _{t_{0}}^{t_{1}}\Psi \Psi ^{\mathrm {*} }\,dt}$

Por lo tanto, los diferentes métodos de obtención de imágenes intentan modificar las ondas de electrones que salen de la muestra de una manera que proporcione información sobre la muestra o el haz en sí. De la ecuación anterior, se puede deducir que la imagen observada depende no solo de la amplitud del haz, sino también de la fase de los electrones, ^{[ aclaración necesaria ]} aunque los efectos de fase a menudo se pueden ignorar con aumentos menores. Las imágenes de mayor resolución requieren muestras más delgadas y mayores energías de electrones incidentes, lo que significa que ya no se puede considerar que la muestra absorba electrones (es decir, a través de un efecto de la ley de Beer). En cambio, la muestra se puede modelar como un objeto que no cambia la amplitud de la función de onda del electrón entrante, sino que modifica la fase de la onda entrante; en este modelo, la muestra se conoce como un objeto de fase pura. Para muestras suficientemente delgadas, los efectos de fase dominan la imagen, lo que complica el análisis de las intensidades observadas. ^[40] Para mejorar el contraste en la imagen, el TEM puede funcionar con un ligero desenfoque para mejorar el contraste, debido a la convolución de la función de transferencia de contraste del TEM, ^[41] que normalmente disminuiría el contraste si la muestra no fuera un objeto de fase débil.

La figura de la derecha muestra los dos modos básicos de funcionamiento del TEM: el de formación de imágenes y el de difracción. En ambos casos, la muestra se ilumina con un haz paralelo, formado por la conformación del haz de electrones con el sistema de lentes y aberturas de condensador. Después de la interacción con la muestra, en la superficie de salida de la muestra existen dos tipos de electrones: no dispersos (que corresponden al haz central brillante en el patrón de difracción) y electrones dispersos (que cambian su trayectoria debido a la interacción con el material).

En el modo de imagen, la abertura del objetivo se inserta en un plano focal posterior (BFP) de la lente del objetivo (donde se forman los puntos de difracción). Si se utiliza la abertura del objetivo para seleccionar solo el haz central, los electrones transmitidos pasan a través de la abertura mientras que todos los demás se bloquean, y se obtiene una imagen de campo claro (imagen BF). Si permitimos la señal de un haz difractado, se recibe una imagen de campo oscuro (imagen DF). La señal seleccionada se amplía y se proyecta en una pantalla (o en una cámara) con la ayuda de lentes intermedias y de proyector. De este modo se obtiene una imagen de la muestra.

En el modo de difracción, se puede utilizar una apertura de área seleccionada para determinar con mayor precisión el área de la muestra desde la cual se mostrará la señal. Al cambiar la intensidad de la corriente en la lente intermedia, el patrón de difracción se proyecta en una pantalla. La difracción es una herramienta muy poderosa para realizar una reconstrucción celular y determinar la orientación del cristal.

El contraste entre dos áreas adyacentes en una imagen TEM se puede definir como la diferencia en las densidades de electrones en el plano de la imagen. Debido a la dispersión del haz incidente por la muestra, la amplitud y la fase de la onda electrónica cambian, lo que da como resultado un contraste de amplitud y un contraste de fase , respectivamente. La mayoría de las imágenes tienen ambos componentes de contraste.

La amplitud y el contraste se obtienen debido a la eliminación de algunos electrones antes del plano de la imagen. Durante su interacción con la muestra, algunos electrones se perderán debido a la absorción o a la dispersión en ángulos muy altos que superan las limitaciones físicas del microscopio, o se verán bloqueados por la abertura del objetivo. Si bien las dos primeras pérdidas se deben a la muestra y a la construcción del microscopio, el operador puede utilizar la abertura del objetivo para mejorar el contraste.

La figura de la derecha muestra una imagen TEM (a) y el patrón de difracción correspondiente (b) de una película policristalina de Pt tomada sin una abertura de objetivo. Para mejorar el contraste en la imagen TEM, se debe reducir el número de haces dispersos visibles en el patrón de difracción. Esto se puede hacer seleccionando un área determinada en el plano focal posterior, como solo el haz central o un haz difractado específico (ángulo), o combinaciones de dichos haces. Al seleccionar intencionalmente una abertura de objetivo que solo permita que el haz no difractado pase más allá del plano focal posterior (y sobre el plano de la imagen): se crea una imagen de campo claro (BF) (c), mientras que si se bloquea el haz central, no difractado: se pueden obtener imágenes de campo oscuro (DF) como las que se muestran en (d–e). Las imágenes DF (d–e) se obtuvieron seleccionando los haces difractados indicados en el patrón de difracción con círculos (b) utilizando una abertura en el plano focal posterior. Los granos desde los cuales los electrones se dispersan en estos puntos de difracción aparecen más brillantes. Más adelante se darán más detalles sobre la formación del contraste de difracción.

Existen dos tipos de contraste de amplitud: contraste de masa-espesor y contraste de difracción. En primer lugar, consideremos el contraste de masa-espesor . Cuando el haz ilumina dos áreas vecinas con masa (o espesor) baja y masa (o espesor) alta, la región más pesada dispersa electrones en ángulos mayores. Estos electrones fuertemente dispersos son bloqueados en el modo BF TEM por la apertura del objetivo. Como resultado, las regiones más pesadas aparecen más oscuras en las imágenes BF (tienen baja intensidad). El contraste de masa-espesor es más importante para materiales amorfos no cristalinos.

El contraste de difracción se produce debido a una orientación cristalográfica específica de un grano. En tal caso, el cristal está orientado de tal manera que existe una alta probabilidad de difracción. El contraste de difracción proporciona información sobre la orientación de los cristales en una muestra policristalina, así como otra información como los defectos. Tenga en cuenta que, en caso de que exista contraste de difracción, el contraste no se puede interpretar como debido a variaciones de masa o espesor.

Las muestras pueden presentar contraste de difracción, por lo que el haz de electrones sufre una difracción que, en el caso de una muestra cristalina, dispersa los electrones en ubicaciones discretas en el plano focal posterior . Mediante la colocación de aberturas en el plano focal posterior, es decir, la abertura del objetivo, se pueden seleccionar (o excluir) los vectores reticulares recíprocos deseados , de modo que solo las partes de la muestra que están haciendo que los electrones se dispersen en las reflexiones seleccionadas terminarán proyectadas sobre el aparato de formación de imágenes.

Si los reflejos seleccionados no incluyen el haz no dispersado (que aparecerá en el punto focal de la lente), la imagen aparecerá oscura donde no haya dispersión de muestra hacia el pico seleccionado, ya que una región sin muestra aparecerá oscura. Esto se conoce como imagen de campo oscuro.

Los TEM modernos suelen estar equipados con portamuestras que permiten al usuario inclinar la muestra en una variedad de ángulos para obtener condiciones de difracción específicas, y las aberturas colocadas sobre la muestra permiten al usuario seleccionar electrones que de otro modo serían difractados en una dirección particular para evitar que ingresen a la muestra.

Las aplicaciones de este método incluyen la identificación de defectos reticulares en cristales. Al seleccionar cuidadosamente la orientación de la muestra, es posible no solo determinar la posición de los defectos, sino también determinar el tipo de defecto presente. Si la muestra está orientada de modo que un plano particular esté solo ligeramente inclinado hacia afuera del ángulo de difracción más fuerte (conocido como el ángulo de Bragg ), cualquier distorsión del plano del cristal que incline localmente el plano hacia el ángulo de Bragg producirá variaciones de contraste particularmente fuertes. Sin embargo, los defectos que producen solo desplazamiento de átomos que no inclinan el cristal hacia el ángulo de Bragg (es decir, desplazamientos paralelos al plano del cristal) producirán un contraste más débil. ^[42]

La estructura cristalina también se puede investigar mediante microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HRTEM), también conocida como contraste de fase . Cuando se utiliza una fuente de emisión de campo y una muestra de espesor uniforme, las imágenes se forman debido a las diferencias en la fase de las ondas de electrones, que es causada por la interacción de la muestra. ^[41] La formación de imágenes está dada por el módulo complejo de los haces de electrones entrantes. Como tal, la imagen no solo depende del número de electrones que golpean la pantalla, lo que hace que la interpretación directa de las imágenes de contraste de fase sea ligeramente más compleja. Sin embargo, este efecto se puede utilizar de forma ventajosa, ya que se puede manipular para proporcionar más información sobre la muestra, como en técnicas complejas de recuperación de fase .

Como se indicó anteriormente, al ajustar las lentes magnéticas de manera que el plano focal posterior de la lente en lugar del plano de obtención de imágenes se coloque sobre el aparato de obtención de imágenes, se puede generar un patrón de difracción . Para muestras cristalinas delgadas, esto produce una imagen que consiste en un patrón de puntos en el caso de un monocristal, o una serie de anillos en el caso de un material sólido policristalino o amorfo . Para el caso del monocristal, el patrón de difracción depende de la orientación de la muestra y de la estructura de la muestra iluminada por el haz de electrones. Esta imagen proporciona al investigador información sobre las simetrías del grupo espacial en el cristal y la orientación del cristal con respecto a la trayectoria del haz. Esto se hace normalmente sin utilizar ninguna información excepto la posición en la que aparecen los puntos de difracción y las simetrías de la imagen observadas.

Los patrones de difracción pueden tener un amplio rango dinámico y, en el caso de muestras cristalinas, pueden tener intensidades mayores que las que se pueden registrar con CCD. Por ello, los TEM pueden estar equipados con cartuchos de película para obtener estas imágenes, ya que la película es un detector de un solo uso.

El análisis de los patrones de difracción más allá de la posición puntual puede ser complejo, ya que la imagen es sensible a una serie de factores, como el espesor y la orientación de la muestra, el desenfoque de la lente del objetivo y la aberración esférica y cromática. Aunque es posible la interpretación cuantitativa del contraste que se muestra en las imágenes reticulares, es inherentemente complicada y puede requerir una simulación y un análisis informáticos exhaustivos, como el análisis de múltiples cortes electrónicos . ^[43]

También es posible que se produzcan comportamientos más complejos en el plano de difracción, con fenómenos como las líneas de Kikuchi que surgen de la difracción múltiple dentro de la red cristalina. En la difracción de electrones por haz convergente (CBED), en la que se produce un frente de onda de electrones no paralelo, es decir, convergente, al concentrar el haz de electrones en una sonda fina en la superficie de la muestra, la interacción del haz convergente puede proporcionar información más allá de los datos estructurales, como el espesor de la muestra.

Utilizando la técnica avanzada de espectroscopia de pérdida de energía de electrones (EELS), para los TEM equipados adecuadamente, los electrones pueden separarse en un espectro basado en su velocidad (que está estrechamente relacionada con su energía cinética y, por lo tanto, la pérdida de energía de la energía del haz), utilizando dispositivos basados ​​en sectores magnéticos conocidos como espectrómetros EEL. Estos dispositivos permiten la selección de valores de energía particulares, que pueden asociarse con la forma en que el electrón ha interactuado con la muestra. Por ejemplo, diferentes elementos en una muestra dan como resultado diferentes energías de electrones en el haz después de la muestra. Esto normalmente da como resultado una aberración cromática; sin embargo, este efecto puede, por ejemplo, usarse para generar una imagen que proporcione información sobre la composición elemental, basada en la transición atómica durante la interacción electrón-electrón. ^[44]

Los espectrómetros EELS pueden funcionar a menudo tanto en modo espectroscópico como de obtención de imágenes, lo que permite aislar o rechazar haces dispersados ​​elásticamente . Como en muchas imágenes la dispersión inelástica incluirá información que puede no ser de interés para el investigador, lo que reduce las señales observables de interés, la obtención de imágenes EELS puede utilizarse para mejorar el contraste en las imágenes observadas, incluidas las de campo claro y difracción, al rechazar componentes no deseados.

Como los portamuestras TEM suelen permitir la rotación de una muestra en un ángulo deseado, se pueden obtener múltiples vistas de la misma muestra rotando el ángulo de la muestra a lo largo de un eje perpendicular al haz. Al tomar múltiples imágenes de una sola muestra TEM en diferentes ángulos, normalmente en incrementos de 1°, se puede recopilar un conjunto de imágenes conocido como "serie de inclinación". Esta metodología fue propuesta en la década de 1970 por Walter Hoppe . En condiciones de contraste de absorción pura, este conjunto de imágenes se puede utilizar para construir una representación tridimensional de la muestra. ^[46]

La reconstrucción se logra mediante un proceso de dos pasos, primero se alinean las imágenes para tener en cuenta los errores en el posicionamiento de una muestra; dichos errores pueden ocurrir debido a la vibración o la deriva mecánica. ^[47] Los métodos de alineación utilizan algoritmos de registro de imágenes , como los métodos de autocorrelación para corregir estos errores. En segundo lugar, utilizando un algoritmo de reconstrucción, como la retroproyección filtrada , las porciones de imagen alineadas se pueden transformar de un conjunto de imágenes bidimensionales, I _j ( x ,  y ), a una sola imagen tridimensional, I ′ _j ( x ,  y ,  z ). Esta imagen tridimensional es de particular interés cuando se requiere información morfológica, se pueden realizar estudios adicionales utilizando algoritmos informáticos, como isosuperficies y corte de datos para analizar los datos.

Como las muestras de TEM no se pueden ver normalmente con una rotación completa de 180°, las imágenes observadas suelen sufrir una "cuña faltante" de datos, que cuando se utilizan métodos de retroproyección basados ​​en Fourier disminuye el rango de frecuencias resolubles en la reconstrucción tridimensional. ^[46] Se pueden utilizar refinamientos mecánicos, como la inclinación multieje (dos series de inclinación de la misma muestra realizadas en direcciones ortogonales) y la tomografía cónica (donde la muestra se inclina primero a un ángulo fijo dado y luego se obtienen imágenes en incrementos de rotación angular iguales a través de una rotación completa en el plano de la cuadrícula de la muestra) para limitar el impacto de los datos faltantes en la morfología de la muestra observada. Utilizando el fresado de haz de iones enfocado , se ha propuesto una nueva técnica ^[48] que utiliza una muestra en forma de pilar y un soporte de tomografía en el eje dedicado para realizar una rotación de 180° de la muestra dentro de la pieza polar de la lente del objetivo en TEM. Usando tales disposiciones, es posible la tomografía electrónica cuantitativa sin la cuña faltante. ^[49] Además, existen técnicas numéricas que pueden mejorar los datos recopilados.

Todos los métodos mencionados anteriormente implican el registro de series de inclinación de un campo de muestra determinado. Esto inevitablemente da como resultado la suma de una dosis alta de electrones reactivos a través de la muestra y la consiguiente destrucción de detalles finos durante el registro. Por lo tanto, la técnica de obtención de imágenes de baja dosis (dosis mínima) se aplica regularmente para mitigar este efecto. La obtención de imágenes de baja dosis se realiza desviando simultáneamente las regiones de iluminación y de obtención de imágenes lejos del eje óptico para obtener imágenes de una región adyacente al área que se va a registrar (la región de alta dosis). Esta área se mantiene centrada durante la inclinación y se vuelve a enfocar antes del registro. Durante el registro, se eliminan las desviaciones de modo que el área de interés esté expuesta al haz de electrones solo durante el tiempo necesario para la obtención de imágenes. Una mejora de esta técnica (para objetos que descansan sobre una película de sustrato inclinada) es tener dos regiones simétricas fuera del eje para enfocar, seguidas de ajustar el enfoque al promedio de los dos valores de enfoque de alta dosis antes de registrar el área de interés de baja dosis.

Las variantes no tomográficas de este método, conocidas como análisis de partículas individuales , utilizan imágenes de múltiples objetos (con suerte) idénticos en diferentes orientaciones para producir los datos de imagen necesarios para la reconstrucción tridimensional. Si los objetos no tienen orientaciones preferidas significativas, este método no sufre la falta de datos en cuña (o cono) que acompaña a los métodos tomográficos ni incurre en una dosis excesiva de radiación; sin embargo, supone que los diferentes objetos obtenidos en imágenes pueden tratarse como si los datos 3D generados a partir de ellos surgieran de un único objeto estable.

La preparación de muestras en TEM puede ser un procedimiento complejo. ^[50] Las muestras de TEM deben tener menos de 100 nanómetros de espesor para un TEM convencional. A diferencia de la radiación de neutrones o rayos X , los electrones en el haz interactúan fácilmente con la muestra, un efecto que aumenta aproximadamente con el número atómico al cuadrado ( Z ² ). ^[15] Las muestras de alta calidad tendrán un espesor comparable al camino libre medio de los electrones que viajan a través de las muestras, que puede ser de solo unas pocas decenas de nanómetros. La preparación de muestras de TEM es específica para el material bajo análisis y el tipo de información que se obtendrá de la muestra.

Los materiales que tienen dimensiones lo suficientemente pequeñas para ser transparentes a los electrones, como sustancias en polvo, organismos pequeños, virus o nanotubos, se pueden preparar rápidamente mediante la deposición de una muestra diluida que contiene la muestra sobre películas en rejillas de soporte. Las muestras biológicas se pueden incrustar en resina para soportar el alto vacío en la cámara de muestra y para permitir el corte de tejido en secciones delgadas transparentes a los electrones. La muestra biológica se puede teñir utilizando un material de tinción negativa como acetato de uranilo para bacterias y virus, o, en el caso de secciones incrustadas, la muestra se puede teñir con metales pesados, incluido el tetróxido de osmio . Alternativamente, las muestras se pueden mantener a temperaturas de nitrógeno líquido después de incrustarlas en hielo vítreo. ^[51] En la ciencia de los materiales y la metalurgia, las muestras generalmente pueden soportar el alto vacío, pero aún deben prepararse como una lámina delgada o grabarse para que una parte de la muestra sea lo suficientemente delgada para que el haz penetre. Las restricciones sobre el espesor del material pueden estar limitadas por la sección transversal de dispersión de los átomos que lo componen.

Antes de seccionarlo, el tejido biológico se suele incrustar en un bloque de resina epoxi y primero se recorta con una hoja de afeitar en una cara de bloque trapezoidal. Luego se cortan secciones gruesas de la cara del bloque. Las secciones gruesas se tiñen de manera tosca con azul de toluidina y se examinan para la orientación de la muestra y del bloque antes de cortarlas en secciones finas. ^[52] Luego, el tejido biológico se adelgaza a menos de 100 nm en un ultramicrotomo . El bloque de resina se fractura al pasar sobre el borde de un cuchillo de vidrio o diamante. ^[53] Este método se utiliza para obtener muestras delgadas, mínimamente deformadas que permiten la observación de la ultraestructura del tejido. Las muestras inorgánicas, como el aluminio, también se pueden incrustar en resinas y cortar en secciones ultrafinas de esta manera, utilizando cuchillos de vidrio recubierto, zafiro o diamante de ángulo más grande. ^[54] Para evitar la acumulación de carga en la superficie de la muestra cuando se observa en el TEM, las muestras de tejido deben recubrirse con una capa delgada de material conductor, como carbono.

Las muestras de tejidos biológicos obtenidas mediante TEM necesitan tinciones de alto número atómico para mejorar el contraste. La tinción absorbe los electrones del haz o dispersa parte del haz de electrones que, de otro modo, se proyectaría sobre el sistema de obtención de imágenes. Se pueden utilizar compuestos de metales pesados ​​como el osmio , el plomo , el uranio o el oro (en el marcaje inmunocromático ) antes de la observación mediante TEM para depositar selectivamente átomos densos en electrones en la muestra o sobre la región celular o proteica deseada. Este proceso requiere una comprensión de cómo los metales pesados ​​se unen a tejidos biológicos y estructuras celulares específicos. ^[55]

Otra forma de tinción de muestra es la tinción negativa , donde se aplica una mayor cantidad de tinción de metal pesado a la muestra. ^[56] El resultado es una muestra con un fondo oscuro y la superficie topológica de la muestra que aparece más clara. La microscopía electrónica de tinción negativa puede ser ideal para visualizar o formar reconstrucciones topológicas 3D de proteínas grandes o complejos macromoleculares (> 150 kDa). Para proteínas más pequeñas, la tinción negativa se puede utilizar como un paso de detección para encontrar la concentración ideal de la muestra para la microscopía electrónica criogénica . ^[56]

El pulido mecánico también se utiliza para preparar muestras para la obtención de imágenes en el TEM. El pulido debe realizarse con una alta calidad para garantizar un espesor de muestra constante en toda la región de interés. Se puede utilizar un compuesto de pulido de diamante o nitruro de boro cúbico en las etapas finales del pulido para eliminar los rayones que puedan causar fluctuaciones de contraste debido a la variación del espesor de la muestra. Incluso después de un fresado mecánico cuidadoso, es posible que se requieran métodos finos adicionales, como el grabado iónico, para realizar el adelgazamiento de la etapa final.

Algunas muestras pueden prepararse mediante grabado químico, en particular las muestras metálicas. Estas muestras se diluyen utilizando un agente de grabado químico, como un ácido, para preparar la muestra para la observación mediante TEM. Los dispositivos para controlar el proceso de dilución pueden permitir al operador controlar el voltaje o la corriente que pasa a través de la muestra, y pueden incluir sistemas para detectar cuándo la muestra se ha diluido hasta alcanzar un nivel suficiente de transparencia óptica.

El grabado iónico es un proceso de pulverización catódica que puede eliminar cantidades muy pequeñas de material. Se utiliza para realizar un pulido final de muestras pulidas por otros medios. El grabado iónico utiliza un gas inerte que pasa a través de un campo eléctrico para generar una corriente de plasma que se dirige a la superficie de la muestra. Las energías de aceleración para gases como el argón suelen ser de unos pocos kilovoltios. La muestra se puede girar para promover un pulido uniforme de la superficie de la muestra. La velocidad de pulverización catódica de estos métodos es del orden de decenas de micrómetros por hora, lo que limita el método a un pulido extremadamente fino.

Recientemente se ha demostrado que el grabado iónico con gas argón puede limar las estructuras de las pilas de MTJ hasta una capa específica que luego se ha resuelto atómicamente. Las imágenes de TEM tomadas en vista de planta en lugar de en sección transversal revelan que la capa de MgO dentro de las MTJ contiene una gran cantidad de límites de grano que pueden estar disminuyendo las propiedades de los dispositivos. ^[57]

Más recientemente, se han utilizado métodos de haz de iones enfocados para preparar muestras. FIB es una técnica relativamente nueva para preparar muestras delgadas para el examen TEM a partir de muestras más grandes. Debido a que FIB se puede utilizar para micromecanizar muestras con mucha precisión, es posible fresar membranas muy delgadas de un área específica de interés en una muestra, como un semiconductor o un metal. A diferencia de la pulverización catódica de iones con gas inerte, FIB utiliza iones de galio significativamente más energéticos y puede alterar la composición o estructura del material a través de la implantación de galio. ^[58]

Para una introducción mínima de estrés y flexión en muestras de microscopía electrónica de transmisión (TEM) ( láminas , películas delgadas y otras muestras sensibles a los mecanismos y al haz), cuando se transfieren dentro de un haz de iones enfocado (FIB), se pueden unir nanocables metálicos flexibles a un micromanipulador típicamente rígido .

Las principales ventajas de este método incluyen una reducción significativa del tiempo de preparación de la muestra (soldadura y corte rápidos de nanocables con corriente de haz baja) y la minimización de la flexión inducida por estrés, la contaminación de Pt y el daño del haz de iones. ^[59] Esta técnica es particularmente adecuada para la preparación de muestras de microscopía electrónica in situ .

Las muestras también se pueden replicar utilizando una película de acetato de celulosa , que posteriormente se recubre con un metal pesado como el platino, se disuelve la película original y se obtiene la imagen de la réplica en el microscopio electrónico de transmisión. Se utilizan variaciones de la técnica de réplica tanto para materiales como para muestras biológicas. En la ciencia de los materiales, un uso común es examinar la superficie de fractura reciente de aleaciones metálicas.

Las capacidades del TEM se pueden ampliar aún más mediante etapas y detectores adicionales, a veces incorporados en el mismo microscopio.

Un TEM puede modificarse para convertirse en un microscopio electrónico de transmisión por barrido (STEM) mediante la adición de un sistema que hace pasar un haz convergente a través de la muestra para formar la imagen, cuando se combina con detectores adecuados. Se utilizan bobinas de barrido para desviar el haz, por ejemplo mediante un desplazamiento electrostático del haz, donde el haz se recoge utilizando un detector de corriente como una copa de Faraday , que actúa como un contador de electrones directo. Al correlacionar el recuento de electrones con la posición del haz de barrido (conocido como la "sonda"), se puede medir el componente transmitido del haz. Los componentes no transmitidos se pueden obtener mediante la inclinación del haz o mediante el uso de detectores de campo oscuro anulares .

Básicamente, los TEM y los STEM están vinculados a través de la reciprocidad de Helmholtz . Un STEM es un TEM en el que la fuente de electrones y el punto de observación se han cambiado en relación con la dirección de desplazamiento del haz de electrones. Vea los diagramas de rayos en la figura de la derecha. El instrumento STEM se basa efectivamente en la misma configuración óptica que un TEM, pero funciona invirtiendo la dirección de desplazamiento de los electrones (o invirtiendo el tiempo) durante el funcionamiento de un TEM. En lugar de utilizar una apertura para controlar los electrones detectados, como en el TEM, un STEM utiliza varios detectores con ángulos de recolección que pueden ajustarse según los electrones que el usuario desee capturar.

Un microscopio electrónico de bajo voltaje (LVEM) se opera a un voltaje de aceleración de electrones relativamente bajo, entre 5 y 25 kV. Algunos de estos pueden ser una combinación de SEM, TEM y STEM en un solo instrumento compacto. El bajo voltaje aumenta el contraste de la imagen, lo que es especialmente importante para las muestras biológicas. Este aumento del contraste reduce significativamente, o incluso elimina, la necesidad de teñir. Son posibles resoluciones de unos pocos nm en los modos TEM, SEM y STEM. La baja energía del haz de electrones significa que se pueden usar imanes permanentes como lentes y, por lo tanto, se puede utilizar una columna en miniatura que no requiere refrigeración. ^{[60] [61]}

La microscopía electrónica de transmisión criogénica (Cryo-TEM) utiliza un TEM con un portamuestras capaz de mantener la muestra a temperaturas de nitrógeno líquido o helio líquido . Esto permite obtener imágenes de muestras preparadas en hielo vítreo , la técnica de preparación preferida para obtener imágenes de moléculas individuales o conjuntos macromoleculares , ^[62] obtener imágenes de interfaces de sólidos vitrificados-electrolito, ^[63] e imágenes de materiales que son volátiles en alto vacío a temperatura ambiente, como el azufre. ^[64]

También se pueden realizar experimentos in situ en TEM utilizando cámaras de muestra con bombeo diferencial o soportes especializados. ^[65] Los tipos de experimentos in situ incluyen el estudio de nanomateriales, ^[66] muestras biológicas, reacciones químicas de moléculas, ^[67] microscopía electrónica de fase líquida , ^{[68] [69]} y pruebas de deformación de materiales. ^[70]

Durante el calentamiento se producen muchas transformaciones de fase. Además, el engrosamiento y el crecimiento del grano, junto con otros procesos relacionados con la difusión, se producen más rápidamente a temperaturas elevadas, donde se mejora la cinética, lo que permite la observación de fenómenos relacionados con la microscopía electrónica de transmisión en escalas de tiempo razonables. Esto también permite la observación de fenómenos que ocurren a temperaturas elevadas y desaparecen o no se conservan de manera uniforme en muestras ex situ.

La TEM de alta temperatura presenta varios desafíos adicionales que deben abordarse en la mecánica de los soportes de alta temperatura, incluidos, entre otros, la corrección de la deriva, la medición de la temperatura y la disminución de la resolución espacial a expensas de soportes más complejos. ^{[71] [72]}

La deriva de la muestra en el TEM es linealmente proporcional a la diferencia de temperatura entre la habitación y el soporte. Con temperaturas tan altas como 1500C en los soportes modernos, las muestras pueden experimentar una deriva significativa y un desplazamiento vertical (abultamiento), lo que requiere ajustes continuos del enfoque o la platina, lo que induce pérdida de resolución y deriva mecánica. ^{[73] [74]} Los laboratorios y fabricantes individuales han desarrollado software acoplado con sistemas de enfriamiento avanzados para corregir la deriva térmica en función de la temperatura prevista en la cámara de muestra ^{[71] [74] [75]} Estos sistemas a menudo tardan entre 30 minutos y muchas horas para que los cambios de muestra se estabilicen. Si bien se han logrado avances significativos, no se ha creado un accesorio TEM universal para tener en cuenta la deriva a temperaturas elevadas. ^{[72] [73] [75]}

Un desafío adicional de muchos de estos soportes especializados es conocer la temperatura local de la muestra. Muchos soportes de alta temperatura utilizan un filamento de tungsteno para calentar localmente la muestra. ^{[71] [74]} La ambigüedad en la temperatura en los calentadores de horno (alambre W) con termopares surge del contacto térmico entre el horno y la rejilla TEM; complicado por gradientes de temperatura a lo largo de la muestra causados ​​por la variación de la conductividad térmica con diferentes muestras y materiales de rejilla. ^[72] Con diferentes soportes, tanto comerciales como fabricados en laboratorio, existen diferentes métodos para crear calibración de temperatura. Los fabricantes como Gatan utilizan pirometría IR para medir gradientes de temperatura en toda su muestra. Un método aún mejor para calibrar es la espectroscopia Raman, que mide la temperatura local del polvo de Si en ventanas transparentes a los electrones y calibra cuantitativamente la pirometría IR. Estas mediciones tienen una precisión garantizada dentro del 5%. Los laboratorios de investigación también han realizado sus propias calibraciones en soportes comerciales. Los investigadores del NIST utilizaron la espectroscopia Raman para mapear el perfil de temperatura de una muestra en una rejilla TEM y lograr mediciones muy precisas para mejorar su investigación. ^[76] De manera similar, un grupo de investigación en Alemania utilizó la difracción de rayos X para medir pequeños cambios en el espaciado de la red causados ​​por cambios de temperatura para calcular la temperatura exacta en el soporte. Este proceso requirió una calibración cuidadosa y una óptica TEM exacta. ^[77] Otros ejemplos incluyen el uso de EELS para medir la temperatura local utilizando cambios en la densidad del gas, ^[78] y cambios de resistividad. ^[72]

La resolución óptima en un TEM se logra cuando las aberraciones esféricas se corrigen con una lente objetivo. Sin embargo, debido a la geometría de la mayoría de los TEM, la inserción de soportes grandes in situ requiere que el usuario comprometa la lente objetivo y soporte las aberraciones esféricas. Por lo tanto, existe un compromiso entre el ancho del espacio entre la pieza polar y la resolución espacial por debajo de 0,1 nm. Los grupos de investigación de varias instituciones han intentado superar las aberraciones esféricas mediante el uso de monocromadores para lograr una resolución de 0,05 nm con un espacio entre la pieza polar de 5 mm. ^[79]

La alta resolución de TEM permite monitorear la muestra en cuestión en una escala de longitud que va desde cientos de nanómetros hasta varios angstroms. Esto permite la visualización de la deformación elástica y plástica a través de campos de deformación, así como el movimiento de defectos cristalográficos como distorsiones reticulares y movimiento de dislocación . Al observar simultáneamente los fenómenos de deformación y medir la respuesta mecánica in situ, es posible conectar la información de pruebas nanomecánicas a modelos que describen tanto la sutileza como la complejidad de cómo los materiales responden al estrés y la deformación. ^[80] Las propiedades del material y la precisión de los datos obtenidos a partir de tales pruebas nanomecánicas están determinadas en gran medida por el soporte de deformación mecánica que se utiliza. Los soportes de deformación actuales tienen la capacidad de realizar pruebas de tracción , nanoindentación , pruebas de compresión, pruebas de corte y pruebas de flexión en materiales. ^[81]

Uno de los pioneros de los soportes clásicos fue Heinz GF Wilsdorf, quien realizó una prueba de tracción dentro de un TEM en 1958. ^[82] En un experimento típico, las muestras de TEM transparentes a los electrones se cortan a la forma y se pegan a una rejilla deformable. Los avances en micromanipuladores también han permitido la prueba de tracción de nanocables y películas delgadas . La rejilla deformable se adhiere al soporte de tracción clásico que estira la muestra utilizando un eje rígido largo unido a una caja de engranajes sin fin accionada por un motor eléctrico ubicado en una carcasa fuera del TEM. Normalmente, las velocidades de deformación varían de 10 nm/s a 10 μm/s. ^[83] Los soportes hechos a medida que amplían el accionamiento de deformación simple han permitido pruebas de flexión utilizando un soporte de flexión ^[84] y pruebas de corte utilizando un soporte de muestra de corte. ^[85] Las propiedades típicas de las muestras medidas en estos experimentos son la resistencia a la fluencia , el módulo elástico , el módulo de corte , la resistencia a la tracción , la resistencia a la flexión y la resistencia al corte . Para estudiar las propiedades mecánicas dependientes de la temperatura de las muestras TEM, el soporte se puede enfriar a través de un dedo frío conectado a un depósito de nitrógeno líquido. Para experimentos de alta temperatura, la muestra TEM también se puede calentar a través de un horno miniaturizado o un láser que normalmente puede alcanzar los 1000 °C. ^[86]

Los soportes de nano-indentación realizan una prueba de dureza en el material en cuestión presionando una punta dura en una superficie plana pulida y midiendo la fuerza aplicada y el desplazamiento resultante en la muestra TEM a través de un cambio en la capacitancia entre una referencia y una placa electrostática móvil unida a la punta. ^[87] Las propiedades típicas de la muestra medidas son la dureza y el módulo elástico . Aunque la nano-indentación fue posible desde principios de la década de 1980, su investigación utilizando un TEM se informó por primera vez en 2001, donde se investigó una muestra de aluminio depositada en una cuña de silicio. ^[88] Para los experimentos de nanoindentación, las muestras TEM generalmente se moldean como cuñas utilizando un pulidor de trípode, una ventana de barra en H o un micro-nanopilar que utiliza un haz de iones enfocado para crear suficiente espacio para que se presione una punta en la ubicación transparente a los electrones deseada. Las puntas del penetrador suelen ser de tipo punzón plano, piramidales o en forma de cuña alargadas en la dirección z. ^[89] Las puntas piramidales ofrecen una alta precisión del orden de 10 nm pero sufren deslizamiento de la muestra, mientras que los penetradores de cuña tienen un mayor contrato para evitar el deslizamiento pero requieren un análisis de elementos finitos para modelar la tensión transmitida ya que la alta área de contacto con la muestra TEM hace que esto sea casi una prueba de compresión. ^[90]

Los soportes basados ​​en sistemas microelectromecánicos (MEM) proporcionan una plataforma barata y personalizable para realizar pruebas mecánicas en muestras con las que antes era difícil trabajar, como micropilares, nanocables y películas delgadas. ^[91] Los MEM pasivos se utilizan como dispositivos simples de empujar para tirar para pruebas mecánicas in situ. Normalmente, se utiliza un soporte de nanoindentación para aplicar una fuerza de empuje en el sitio de la indentación. Utilizando una geometría de brazos, esta fuerza de empuje se traduce en una fuerza de tracción en un par de almohadillas de tracción a las que está unida la muestra. Por lo tanto, una compresión aplicada en el exterior de los MEM se traduce en una tensión en el espacio central donde se encuentra la muestra de TEM. La curva de fuerza-desplazamiento resultante debe corregirse realizando la misma prueba en un MEM vacío sin la muestra de TEM para tener en cuenta la rigidez de los MEM vacíos. Las dimensiones y la rigidez de los MEM se pueden modificar para realizar pruebas de tracción en muestras de diferentes tamaños con diferentes cargas. Para facilitar el proceso de actuación, se han desarrollado MEM activos con actuadores y sensores integrados . Estos dispositivos funcionan aplicando una tensión mediante energía eléctrica y midiendo la tensión mediante variaciones de capacitancia . ^[92] También se han desarrollado MEM accionados electrostáticamente para soportar fuerzas aplicadas muy bajas en el rango de 1 a 100 nN. ^[93]

Gran parte de la investigación actual se centra en el desarrollo de portamuestras que puedan realizar pruebas mecánicas mientras crean un estímulo ambiental como un cambio de temperatura, tasas de deformación variables y diferentes entornos gaseosos. Además, la aparición de detectores de alta resolución está permitiendo monitorear el movimiento de dislocación y las interacciones con otros defectos y está ampliando los límites de las mediciones de deformación subnanómetros. Las mediciones mecánicas TEM in situ se combinan rutinariamente con otras mediciones TEM estándar como EELS y XEDS para alcanzar una comprensión integral de la estructura y las propiedades de la muestra. ^[94]

Los modernos TEM de investigación pueden incluir correctores de aberración ^[19] para reducir la cantidad de distorsión en la imagen. También se pueden utilizar monocromadores de haz incidente que reducen la dispersión de energía del haz de electrones incidente a menos de 0,15  eV ^[19] . Los principales fabricantes de TEM con corrección de aberración incluyen JEOL , Hitachi High-technologies, FEI Company y NION.

Es posible alcanzar una resolución temporal mucho más allá de la velocidad de lectura de los detectores de electrones con el uso de electrones pulsados . Los pulsos se pueden producir modificando la fuente de electrones para permitir la fotoemisión activada por láser ^[95] o mediante la instalación de un supresor de haz ultrarrápido ^[96] . Este enfoque se denomina microscopía electrónica de transmisión ultrarrápida cuando se utiliza iluminación de bombeo-sonda estroboscópica : se forma una imagen por la acumulación de muchos pulsos de electrones ultracortos (normalmente de cientos de femtosegundos) con un retraso de tiempo fijo entre la llegada del pulso de electrones y la excitación de la muestra. Por otro lado, el uso de pulsos de electrones individuales o una secuencia corta de ellos con una cantidad suficiente de electrones para formar una imagen a partir de cada pulso se denomina microscopía electrónica de transmisión dinámica. La resolución temporal de hasta cientos de femtosegundos y la resolución espacial comparable a la disponible con una fuente de emisión de campo Schottky son posibles en la TEM ultrarrápida. ^[97] Utilizando el método de activación de fotones, ^[98] la resolución temporal en el microscopio electrónico ultrarrápido alcanza los 30 fs, lo que permite obtener imágenes de dinámicas atómicas y electrónicas ultrarrápidas de la materia. ^[99] Sin embargo, la técnica solo puede obtener imágenes de procesos reversibles que se pueden activar de forma reproducible millones de veces. El TEM dinámico puede resolver procesos irreversibles con una precisión de hasta decenas de nanosegundos y decenas de nanómetros. ^[100]

La técnica fue iniciada a principios de la década de 2000 en laboratorios de Alemania ( Technische Universität Berlin ^[95] ) y de los EE. UU. ( Caltech ^{[101] [102]} y Lawrence Livermore National Laboratory ^{[103] [104]} ). La TEM ultrarrápida y la TEM dinámica han hecho posible la investigación en tiempo real de numerosos fenómenos físicos y químicos a escala nanométrica.

Una variante interesante de la técnica de microscopía electrónica de transmisión ultrarrápida es la microscopía electrónica de campo cercano inducida por fotones (PINEM). Esta última se basa en el acoplamiento inelástico entre electrones y fotones en presencia de una superficie o una nanoestructura. ^[105] Este método permite investigar campos electromagnéticos a escala nanométrica que varían con el tiempo en un microscopio electrónico, así como dar forma dinámica a las propiedades ondulatorias del haz de electrones.

La técnica TEM presenta una serie de inconvenientes. Muchos materiales requieren una preparación exhaustiva de la muestra para producir una muestra lo suficientemente fina como para ser transparente a los electrones, lo que hace que el análisis TEM sea un proceso relativamente lento con un bajo rendimiento de muestras. La estructura de la muestra también puede cambiar durante el proceso de preparación. Además, el campo de visión es relativamente pequeño, lo que aumenta la posibilidad de que la región analizada no sea característica de toda la muestra. Existe la posibilidad de que la muestra pueda resultar dañada por el haz de electrones, especialmente en el caso de materiales biológicos.

El límite de resolución obtenible en un TEM puede describirse de varias maneras y normalmente se lo denomina límite de información del microscopio. Un valor comúnmente utilizado ^{[ cita requerida ]} es un valor de corte de la función de transferencia de contraste , una función que normalmente se cita en el dominio de frecuencia para definir la reproducción de _frecuencias espaciales de objetos en el plano del objeto por la óptica del microscopio. Una frecuencia de corte, qmax , para la función de transferencia puede aproximarse con la siguiente ecuación, donde Cs es el coeficiente de aberración esférica y λ es la longitud de _onda del electrón: ^[39]

${\displaystyle q_{\max}={\frac {1}{0.67(C_{\text{s}}\lambda ^{3})^{1/4}}}.}$

Para un microscopio de 200 kV, con aberraciones esféricas parcialmente corregidas ("hasta el tercer orden") y un valor C _{s de 1 μm,} ^[107] un valor de corte teórico podría ser 1/ q _max = 42  pm . ^[39] El mismo microscopio sin un corrector tendría C _s = 0,5 mm y, por lo tanto, un valor de corte de 200 pm. ^[107] Las aberraciones esféricas se suprimen hasta el tercer o quinto orden en los microscopios " corregidos por aberración ". Sin embargo, su resolución está limitada por la geometría de la fuente de electrones y el brillo y las aberraciones cromáticas en el sistema de lentes objetivo. ^{[19] [108]}

La representación del dominio de frecuencia de la función de transferencia de contraste puede tener a menudo una naturaleza oscilatoria, ^[109] que se puede ajustar ajustando el valor focal de la lente del objetivo. Esta naturaleza oscilatoria implica que algunas frecuencias espaciales son fielmente representadas por el microscopio, mientras que otras se suprimen. Al combinar múltiples imágenes con diferentes frecuencias espaciales, el uso de técnicas como la reconstrucción de series focales se puede utilizar para mejorar la resolución del TEM de manera limitada. ^[39] La función de transferencia de contraste se puede aproximar experimentalmente, hasta cierto punto, a través de técnicas como la transformación de Fourier de imágenes de material amorfo, como el carbono amorfo .

Más recientemente, los avances en el diseño de correctores de aberración han permitido reducir las aberraciones esféricas ^[110] y lograr una resolución por debajo de 0,5 ångströms (50 pm) ^[108] con aumentos superiores a 50 millones de veces. ^[111] La resolución mejorada permite obtener imágenes de átomos más ligeros que dispersan electrones de forma menos eficiente, como los átomos de litio en los materiales de las baterías de litio. ^[112] La capacidad de determinar la posición de los átomos dentro de los materiales ha hecho del HRTEM una herramienta indispensable para la investigación y el desarrollo de la nanotecnología en muchos campos, incluida la catálisis heterogénea y el desarrollo de dispositivos semiconductores para la electrónica y la fotónica. ^[113]

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• Centro Nacional de Microscopía Electrónica, Berkeley, California, EE.UU.
• Centro Nacional de Imágenes Macromoleculares, Houston, Texas, EE.UU.
• Recurso nacional para la microscopía molecular automatizada, Nueva York, EE.UU.
• Cursos tutoriales en Microscopía Electrónica de Transmisión
• Paquete de enseñanza y aprendizaje de la Universidad de Cambridge sobre TEM
• Curso en línea sobre Microscopía Electrónica de Transmisión e Imperfecciones Cristalinas Eric Stach (2008).
• Simulador de microscopio electrónico de transmisión (herramienta didáctica).
• Animaciones y explicaciones sobre distintos tipos de microscopios, incluidos los microscopios electrónicos (Université Paris Sud)