Secuenciación de nanoporos
Técnica de secuenciación de ADN/ARN
A la izquierda se muestra un dibujo del complejo formado entre la alfa-hemolisina y el dsADN con unión a través de un oligómero . A la derecha, se muestra el movimiento de este complejo en relación con un canal nanoporoso de forma secuencial en dos pasos (I) y (II). Una vez que el complejo se inserta en el nanoporo, la proteína alfa-hemolisina será funcional en el sistema nanoporoso híbrido, biológico y de estado sólido recién formado.
Ilustración de cómo se genera una señal eléctrica a partir del ADN que pasa a través de un canal de nanoporos.

La secuenciación de nanoporos es un método de tercera generación [1] utilizado en la secuenciación de biopolímeros , específicamente, polinucleótidos en forma de ADN o ARN .

Utilizando la secuenciación de nanoporos, una sola molécula de ADN o ARN puede ser secuenciada sin la necesidad de amplificación por PCR o etiquetado químico de la muestra. La secuenciación de nanoporos tiene el potencial de ofrecer genotipado de costo relativamente bajo , alta movilidad para pruebas y procesamiento rápido de muestras con la capacidad de mostrar resultados en tiempo real. Las publicaciones sobre el método describen su uso en la identificación rápida de patógenos virales, [2] [3] [4] monitoreo del ébola , [5] monitoreo ambiental, [6] monitoreo de seguridad alimentaria, secuenciación del genoma humano, [7] secuenciación del genoma vegetal, [8] monitoreo de resistencia a antibióticos , [9] haplotipado [10] y otras aplicaciones.

Desarrollo

La secuenciación por nanoporos tardó 25 años en materializarse por completo. Implicó una estrecha colaboración entre el mundo académico y la industria. Una de las primeras personas en proponer la idea de la secuenciación por nanoporos fue David Deamer . En 1989, esbozó un plan para conducir una cadena sencilla de ADN a través de un nanoporo de proteína incrustado en una membrana delgada como parte de su trabajo para sintetizar ARN desde cero. Al darse cuenta de que el mismo enfoque podría tener potencial para mejorar la secuenciación de ADN, Deamer y su equipo pasaron la siguiente década probándolo. En 1999, Deamer y sus colegas publicaron el primer artículo en el que se utilizó el término "secuenciación por nanoporos" y dos años más tarde produjeron una imagen que capturaba una horquilla de ADN pasando a través de un nanoporo en tiempo real. Otra base para la secuenciación por nanoporos fue establecida por el trabajo de un equipo dirigido por Hagan Bayley, quien a partir de la década de 1990 comenzó a desarrollar de forma independiente la detección estocástica, una técnica que mide el cambio en una corriente iónica que pasa a través de un nanoporo para determinar la concentración e identidad de una sustancia. En 2005, Bayley había logrado avances sustanciales con el método de secuenciación de ADN y cofundó Oxford Nanopore para ayudar a impulsar aún más la tecnología. En 2014, la empresa lanzó su primer dispositivo portátil de secuenciación por nanoporos. Esto hizo posible que la secuenciación de ADN se llevara a cabo prácticamente en cualquier lugar, incluso en áreas remotas con recursos limitados. Se ha utilizado en la pandemia de COVID-19 . Una cuarta parte de todos los genomas virales del SARS-CoV-2 del mundo ya se han secuenciado con dispositivos de nanoporos. La tecnología también ofrece una herramienta importante para combatir la resistencia a los antimicrobianos, una creciente amenaza para la salud pública. [11] En 2020, Qitan Technology, con sede en China, lanzó su secuenciador de genes de una sola molécula por nanoporos, [12] mientras que en 2024 MGI Tech lanzó sus propios productos de secuenciación por nanoporos. [13]

Principios de detección

La membrana biológica o de estado sólido, donde se encuentra el nanoporo , está rodeada por una solución electrolítica. [14] La membrana divide la solución en dos cámaras. [15] Se aplica un voltaje de polarización a través de la membrana induciendo un campo eléctrico que impulsa las partículas cargadas, en este caso los iones, al movimiento. Este efecto se conoce como electroforesis . Para concentraciones suficientemente altas, la solución electrolítica se distribuye bien y toda la caída de voltaje se concentra cerca y dentro del nanoporo. Esto significa que las partículas cargadas en la solución solo sienten una fuerza del campo eléctrico cuando están cerca de la región del poro. [16] Esta región a menudo se conoce como la región de captura. Dentro de la región de captura, los iones tienen un movimiento dirigido que se puede registrar como una corriente iónica constante colocando electrodos cerca de la membrana. Imagine ahora un polímero de tamaño nanométrico como ADN o proteína colocado en una de las cámaras. Esta molécula también tiene una carga neta que siente una fuerza del campo eléctrico cuando se encuentra en la región de captura. [16] La molécula se acerca a esta región de captura con la ayuda del movimiento browniano y cualquier atracción que pueda tener hacia la superficie de la membrana. [16] Una vez dentro del nanoporo, la molécula se transloca a través de una combinación de fuerzas electroforéticas, electroosmóticas y, a veces, termoforéticas. [14] Dentro del poro, la molécula ocupa un volumen que restringe parcialmente el flujo de iones, lo que se observa como una caída de la corriente iónica. Según diversos factores, como la geometría, el tamaño y la composición química, el cambio en la magnitud de la corriente iónica y la duración de la translocación variarán. Luego, se pueden detectar y potencialmente identificar diferentes moléculas en función de esta modulación de la corriente iónica. [17]

Identificación de base

La magnitud de la densidad de corriente eléctrica a través de la superficie de un nanoporo depende de las dimensiones del nanoporo y de la composición del ADN o ARN que lo ocupa. La secuenciación fue posible porque, al pasar a través del canal del nanoporo, las muestras provocan cambios característicos en la densidad de la corriente eléctrica que fluye a través del nanoporo. La carga total que fluye a través de un canal de nanoporo es igual a la integral de superficie del flujo de densidad de corriente eléctrica a través de las superficies normales unitarias del nanoporo entre los tiempos t 1 y t 2 .

Tipos

Biológico

Poro de alfa-hemolisina (compuesto por 7 subunidades idénticas en 7 colores) y ADN monocatenario de 12 meros (en blanco) en la misma escala para ilustrar los efectos del ADN sobre la conductancia cuando se mueve a través de un nanoporo. A continuación se muestra una vista ortogonal de las mismas moléculas.

La secuenciación biológica de nanoporos se basa en el uso de proteínas transmembrana, llamadas nanoporos proteicos, en particular, formados por toxinas proteicas, que se incrustan en las membranas lipídicas para crear superficies porosas dependientes del tamaño, con "agujeros" de escala nanométrica distribuidos a través de las membranas. [18] Se puede lograr una velocidad de translocación suficientemente baja mediante la incorporación de varias proteínas que facilitan el movimiento de ADN o ARN a través de los poros de las membranas lipídicas. [19]

Hemolisina alfa

La alfa hemolisina (αHL), un nanoporo de las bacterias que provoca la lisis de los glóbulos rojos, se ha estudiado durante más de 15 años. [20] Hasta este punto, los estudios han demostrado que las cuatro bases se pueden identificar utilizando la corriente iónica medida a través del poro αHL. [21] [22] La estructura de αHL es ventajosa para identificar bases específicas que se mueven a través del poro. El poro αHL tiene una longitud de ~10 nm, con dos secciones distintas de 5 nm. La sección superior consta de una estructura más grande, similar a un vestíbulo, y la sección inferior consta de tres posibles sitios de reconocimiento (R1, R2, R3), y es capaz de discriminar entre cada base. [21] [22]

La secuenciación con αHL se ha desarrollado a través de estudios básicos y mutaciones estructurales, avanzando hacia la secuenciación de lecturas muy largas. La mutación de la proteína αHL ha mejorado las capacidades de detección del poro. [23] El siguiente paso propuesto es unir una exonucleasa al poro αHL. La enzima escindiría periódicamente bases individuales, lo que permitiría al poro identificar bases sucesivas. Acoplar una exonucleasa al poro biológico ralentizaría la translocación del ADN a través del poro y aumentaría la precisión de la adquisición de datos.

Cabe destacar que los teóricos han demostrado que la secuenciación mediante enzimas exonucleasas como la descrita aquí no es factible. [24] Esto se debe principalmente a los efectos relacionados con la difusión que imponen un límite a la probabilidad de captura de cada nucleótido a medida que se escinde. Esto da como resultado una probabilidad significativa de que un nucleótido no se capture antes de que se difunda en la masa o se capture fuera de orden y, por lo tanto, no se secuencie correctamente por el nanoporo, lo que conduce a errores de inserción y eliminación. Por lo tanto, se necesitan cambios importantes en este método antes de que pueda considerarse una estrategia viable.

Un estudio reciente ha señalado la capacidad de αHL para detectar nucleótidos en dos sitios separados en la mitad inferior del poro. [25] Los sitios R1 y R2 permiten que cada base se controle dos veces a medida que se mueve a través del poro, creando 16 valores de corriente iónica medibles diferentes en lugar de 4. Este método mejora la lectura única a través del nanoporo al duplicar los sitios en los que se lee la secuencia por nanoporo.

MspA

La porina A de Mycobacterium smegmatis (MspA) es el segundo nanoporo biológico que se está investigando actualmente para la secuenciación de ADN. El poro de MspA se ha identificado como una mejora potencial con respecto a αHL debido a una estructura más favorable. [26] El poro se describe como una copa con un borde grueso y un diámetro de 1,2 nm en la parte inferior del poro. [27] Una MspA natural, si bien es favorable para la secuenciación de ADN debido a su forma y diámetro, tiene un núcleo negativo que impide la translocación de ADN monocatenario (ssDNA). El nanoporo natural se modificó para mejorar la translocación reemplazando tres ácidos aspárticos cargados negativamente con asparaginas neutras. [28]

Se ha demostrado que la detección de nucleótidos mediante corriente eléctrica a través de la membrana es diez veces más específica que la αHL para identificar bases. [26] Utilizando esta especificidad mejorada, un grupo de la Universidad de Washington ha propuesto utilizar ADN de doble cadena (dsDNA) entre cada molécula de cadena sencilla para mantener la base en la sección de lectura del poro. [26] [28] El dsDNA detendría la base en la sección correcta del poro y permitiría la identificación del nucleótido. Se ha concedido recientemente una subvención a una colaboración de la UC Santa Cruz, la Universidad de Washington y la Universidad Northeastern para mejorar el reconocimiento de bases de MspA utilizando la polimerasa phi29 junto con el poro. [29] La MspA con detección de corriente eléctrica también se puede utilizar para secuenciar péptidos. [30]

Estado sólido

A diferencia de la secuenciación biológica por nanoporos, los métodos de secuenciación por nanoporos de estado sólido no incorporan proteínas a sus sistemas. En cambio, la tecnología de nanoporos de estado sólido utiliza diversos sustratos de metal o aleación de metal con poros de tamaño nanométrico que permiten el paso del ADN o ARN. Estos sustratos suelen desempeñar funciones integrales en el reconocimiento de secuencias de ácidos nucleicos a medida que se translocan a través de los canales a lo largo de los sustratos. [31]

Corriente de túnel

Figura que muestra el movimiento teórico del ssDNA a través de un sistema de nanoporos con corriente de tunelización. La detección es posible gracias a la incorporación de electrodos a lo largo de las paredes del canal del nanoporo, perpendiculares al vector de velocidad del ssDNA.

La medición del efecto túnel de electrones a través de las bases a medida que el ADN monocatenario se transloca a través del nanoporo es un método mejorado de secuenciación de nanoporos de estado sólido. La mayoría de las investigaciones se han centrado en demostrar que las bases se pueden determinar mediante el efecto túnel de electrones. Estos estudios se llevaron a cabo utilizando un microscopio de sonda de barrido como electrodo de detección y han demostrado que las bases se pueden identificar mediante corrientes de efecto túnel específicas. [32] Después de la investigación de prueba de principio, se debe crear un sistema funcional para acoplar el poro de estado sólido y los dispositivos de detección.

Los investigadores del grupo Nanopore de Harvard han diseñado poros de estado sólido con nanotubos de carbono de pared simple a lo largo del diámetro del poro. [33] Se crean conjuntos de poros y se utiliza la deposición química de vapor para crear nanotubos que crecen a lo largo del conjunto. Una vez que un nanotubo ha crecido a lo largo de un poro, el diámetro del poro se ajusta al tamaño deseado. La creación exitosa de un nanotubo acoplado a un poro es un paso importante hacia la identificación de bases a medida que el ssDNA se transloca a través del poro de estado sólido.

Otro método es el uso de nanoelectrodos a ambos lados de un poro. [34] [35] Los electrodos se crean específicamente para permitir la formación de un nanoporo en estado sólido entre los dos electrodos. Esta tecnología podría utilizarse no solo para detectar las bases, sino también para ayudar a controlar la velocidad y la orientación de la translocación de las bases.

Fluorescencia

Se ha desarrollado una técnica eficaz para determinar una secuencia de ADN utilizando nanoporos de estado sólido y fluorescencia . [36] Este método de secuenciación por fluorescencia convierte cada base en una representación característica de múltiples nucleótidos que se unen a una cadena de sonda fluorescente que forma dsADN. Con el sistema de dos colores propuesto, cada base se identifica por dos fluorescencias separadas y, por lo tanto, se convertirá en dos secuencias específicas. Las sondas consisten en un fluoróforo y un extintor al principio y al final de cada secuencia, respectivamente. Cada fluoróforo se extinguirá por el extintor al final de la secuencia precedente. Cuando el dsADN se transloca a través de un nanoporo de estado sólido, la cadena de sonda se desprenderá y el fluoróforo corriente arriba emitirá fluorescencia. [36] [37]

Este método de secuenciación tiene una capacidad de 50-250 bases por segundo por poro, y un sistema de fluoróforos de cuatro colores (cada base podría convertirse en una secuencia en lugar de dos), secuenciará más de 500 bases por segundo. [36] Las ventajas de este método se basan en la lectura clara de la secuenciación, utilizando una cámara en lugar de los métodos actuales ruidosos. Sin embargo, el método requiere la preparación de la muestra para convertir cada base en un código binario expandido antes de la secuenciación. En lugar de identificar una base a medida que se transloca a través del poro, se requieren ~12 bases para encontrar la secuencia de una base. [36]

Propósitos

Los dispositivos nanoporosos se pueden utilizar para el análisis de eDNA en el monitoreo ambiental [38] [39] [40] [41] y la epidemiología de cultivos . [39] Estos se pueden miniaturizar más que las tecnologías anteriores y, por lo tanto, se han convertido en dispositivos portátiles, especialmente el MinION. [38] [39] [40] [41] El MinION es especialmente conocido por los estudios de virus de cultivos por Boykin et al 2018 y Shaffer 2019 [39] y estudios de prevalencia de especies por Menegon et al 2017 [39] [40] y Pomerantz et al 2018. [38] [39] [40] [41] Debido a su alta portabilidad, bajo costo y facilidad de uso para aplicaciones de secuenciación rápida, también planteó preocupaciones éticas, legales y sociales [42] junto con otras tecnologías de secuenciación de próxima generación. [43] Se detectaron variantes del SARS-CoV-2 en las aguas residuales de Praga mediante secuenciación basada en nanoporos. La secuenciación de muestras de la cuenca del alcantarillado beneficia a los sistemas de alerta temprana epidemiológica. [44]

Comparación entre tipos

Comparación de sistemas de secuenciación de nanoporos biológicos y de estado sólido en función de las principales limitaciones
BiológicoEstado sólido
Baja velocidad de translocación✓
Reproducibilidad dimensional✓
Tolerancia al estrés✓
Longevidad✓
Facilidad de fabricación✓

Principales limitaciones

  1. Baja velocidad de translocación: la velocidad a la que una muestra pasa a través del poro de una unidad lo suficientemente lenta como para ser medida.
  2. Reproducibilidad dimensional: la probabilidad de que el poro de una unidad tenga el tamaño adecuado.
  3. Tolerancia al estrés: La sensibilidad de una unidad a las condiciones ambientales internas.
  4. Longevidad: El tiempo que se espera que una unidad permanezca en funcionamiento.
  5. Facilidad de fabricación: La capacidad de producir una unidad, generalmente en lo que respecta a la producción en masa.

Biológica: ventajas y desventajas

Los sistemas de secuenciación de nanoporos biológicos tienen varias características fundamentales que los hacen ventajosos en comparación con los sistemas de estado sólido; cada característica ventajosa de este enfoque de diseño se deriva de la incorporación de proteínas a su tecnología. La estructura uniforme de los poros, el control preciso de la translocación de la muestra a través de los canales de los poros e incluso la detección de nucleótidos individuales en las muestras pueden verse facilitados por proteínas únicas de una variedad de tipos de organismos.

El uso de proteínas en sistemas de secuenciación de nanoporos biológicos, a pesar de sus diversos beneficios, también conlleva algunas características negativas. La sensibilidad de las proteínas en estos sistemas al estrés ambiental local tiene un gran impacto en la longevidad de las unidades en general. Un ejemplo es que una proteína motora solo puede abrir muestras con suficiente velocidad en un cierto rango de pH, mientras que no funciona lo suficientemente rápido fuera de ese rango; esta restricción afecta la funcionalidad de toda la unidad de secuenciación. Otro ejemplo es que una porina transmembrana solo puede funcionar de manera confiable durante un cierto número de ejecuciones antes de descomponerse. Ambos ejemplos tendrían que controlarse en el diseño de cualquier sistema de nanoporos biológicos viable, algo que puede ser difícil de lograr mientras se mantienen los costos de dicha tecnología lo más bajos y competitivos posibles con respecto a otros sistemas. [19]

Desafíos

Un desafío para el método de "secuenciación de cadenas" fue refinarlo para mejorar su resolución y poder detectar bases individuales. En los primeros métodos de los artículos, un nucleótido necesitaba repetirse en una secuencia alrededor de 100 veces sucesivas para producir un cambio característico medible. Esta baja resolución se debe a que la cadena de ADN se mueve rápidamente a una velocidad de 1 a 5 μs por base a través del nanoporo. Esto hace que la grabación sea difícil y propensa al ruido de fondo, lo que no permite obtener una resolución de nucleótido único. A partir de 2006, el problema se ha abordado mejorando la tecnología de grabación o controlando la velocidad de la cadena de ADN mediante varias estrategias de ingeniería de proteínas y Oxford Nanopore emplea un "enfoque kmer", analizando más de una base en cualquier momento, de modo que los tramos de ADN estén sujetos a una interrogación repetida a medida que la cadena se mueve a través del nanoporo una base a la vez. [45] Se han utilizado varias técnicas, incluida la algorítmica, para mejorar el rendimiento de la tecnología MinION desde que se puso a disposición de los usuarios por primera vez. [46] Más recientemente se han demostrado los efectos de las bases individuales debido a la estructura secundaria o a los mononucleótidos liberados. [47] [48]

En 2010, Hagan Bayley propuso que la creación de dos sitios de reconocimiento dentro de un poro de alfa-hemolisina puede conferir ventajas en el reconocimiento de bases. [25]

A partir de 2009, un desafío para el "enfoque de la exonucleasa", [49] donde una enzima procesiva alimenta bases individuales, en el orden correcto, dentro del nanoporo, ha sido integrar la exonucleasa y los sistemas de detección del nanoporo. En particular, [50] el problema es que cuando una exonucleasa hidroliza los enlaces fosfodiéster entre nucleótidos en el ADN, no se garantiza necesariamente que el nucleótido liberado posteriormente se mueva directamente hacia, digamos, un nanoporo de alfa-hemolisina cercano . En 2009, una idea ha sido unir la exonucleasa al nanoporo, quizás a través de la biotinilación a la hemolisina de barril beta . [50]

El poro central de la proteína puede estar revestido de residuos cargados dispuestos de manera que las cargas positivas y negativas aparezcan en lados opuestos del poro. Sin embargo, este mecanismo es principalmente discriminatorio y no constituye un mecanismo para guiar a los nucleótidos por un camino particular. [ cita requerida ]

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