Secuenciación de ARN
Técnica de laboratorio en biología celular

Resumen de RNA-Seq. Dentro del organismo, los genes se transcriben y (en un organismo eucariota ) se empalman para producir transcripciones de ARNm maduro (rojo). El ARNm se extrae del organismo, se fragmenta y se copia en un ADNc bicatenario estable (azul). El ADNc bicatenario se secuencia utilizando métodos de secuenciación de lectura corta y alto rendimiento . Estas secuencias se pueden alinear a una secuencia de genoma de referencia para reconstruir qué regiones del genoma se estaban transcribiendo. Estos datos se pueden utilizar para anotar dónde se expresan los genes, sus niveles de expresión relativos y cualquier variante de empalme alternativa. [1]

RNA-Seq (denominado así por su sigla en inglés como RNA sequencing ) es una técnica que utiliza la secuenciación de próxima generación para revelar la presencia y cantidad de moléculas de ARN en una muestra biológica, proporcionando una instantánea de la expresión genética en la muestra, también conocida como transcriptoma . [2] [3]

Específicamente, RNA-Seq facilita la capacidad de observar transcripciones alternativas de genes empalmados , modificaciones postranscripcionales , fusión de genes , mutaciones/ SNP y cambios en la expresión génica a lo largo del tiempo, o diferencias en la expresión génica en diferentes grupos o tratamientos. [4] Además de las transcripciones de ARNm, RNA-Seq puede observar diferentes poblaciones de ARN para incluir ARN total, ARN pequeño, como miRNA , ARNt y perfiles ribosómicos . [5] RNA-Seq también se puede utilizar para determinar los límites de exón / intrón y verificar o modificar los límites de genes 5' y 3' anotados previamente . Los avances recientes en RNA-Seq incluyen secuenciación de células individuales , secuenciación de ARN en masa , [6] secuenciación de ARNm 3' , secuenciación in situ de tejido fijo y secuenciación de moléculas de ARN nativas con secuenciación de moléculas individuales en tiempo real. [7] Otros ejemplos de aplicaciones emergentes de RNA-Seq debido al avance de los algoritmos bioinformáticos son la alteración del número de copias, la contaminación microbiana, los elementos transponibles, el tipo de célula (deconvolución) y la presencia de neoantígenos. [8]

Antes de RNA-Seq, los estudios de expresión génica se realizaban con microarreglos basados ​​en hibridación . Los problemas con los microarreglos incluyen artefactos de hibridación cruzada, mala cuantificación de genes poco y altamente expresados ​​y la necesidad de conocer la secuencia a priori . [9] Debido a estos problemas técnicos, la transcriptómica hizo la transición a métodos basados ​​en secuenciación. Estos progresaron desde la secuenciación de Sanger de bibliotecas de etiquetas de secuencia expresada , a métodos basados ​​en etiquetas químicas (por ejemplo, análisis en serie de la expresión génica ) y finalmente a la tecnología actual, la secuenciación de próxima generación de ADN complementario (ADNc), en particular RNA-Seq.

En primer lugar, se extrae el ARNm celular y se fragmenta en secuencias de ARNm más pequeñas, que se someten a transcripción inversa. Los ADNc resultantes se secuencian en una plataforma de secuenciación de próxima generación (NGS). Los resultados de dicha secuenciación permiten la generación de mapas genómicos de secuenciación transcriptómica.
Técnica de secuenciación experimental del transcriptoma (RNA-seq).

Métodos

Preparación de la biblioteca

Flujo de trabajo experimental típico de secuenciación de ARN. El ARN se aísla de múltiples muestras, se convierte en bibliotecas de ADNc, se secuencia en un formato legible por computadora, se alinea con una referencia y se cuantifica para análisis posteriores, como expresión diferencial y empalme alternativo. Descripción general de un flujo de trabajo experimental típico de secuenciación de ARN. [10]

Los pasos generales para preparar una biblioteca de ADN complementario (ADNc) para secuenciación se describen a continuación, pero a menudo varían entre plataformas. [10] [3] [11]

  1. Aislamiento de ARN: el ARN se aísla del tejido y se mezcla con desoxirribonucleasa (DNasa). La DNasa reduce la cantidad de ADN genómico. La cantidad de degradación del ARN se verifica con electroforesis capilar y en gel y se utiliza para asignar un número de integridad del ARN a la muestra. Esta calidad del ARN y la cantidad total de ARN inicial se tienen en cuenta durante los pasos posteriores de preparación de la biblioteca, secuenciación y análisis.
  2. Selección/agotamiento de ARN: para analizar señales de interés, el ARN aislado puede conservarse tal cual, enriquecerse con ARN con colas poliadeniladas 3' (poli(A)) para incluir solo ARNm eucariota , despojarse de ARN ribosómico (ARNr) y/o filtrarse para ARN que se une a secuencias específicas ( tabla de métodos de selección y agotamiento de ARN , a continuación). Las moléculas de ARN que tienen colas poli(A) 3' en eucariotas se componen principalmente de secuencias codificantes maduras y procesadas. La selección poli(A) se realiza mezclando ARN con oligómeros poli(T) unidos covalentemente a un sustrato, típicamente perlas magnéticas. [12] [13] La selección poli(A) tiene limitaciones importantes en la detección del biotipo de ARN. Muchos biotipos de ARN no están poliadenilados, incluidos muchos ARN no codificantes y transcripciones de proteínas del núcleo de histonas, o están regulados a través de la longitud de su cola de poli(A) (p. ej., citocinas) y, por lo tanto, es posible que no se detecten después de la selección de poli(A). [14] Además, la selección de poli(A) puede mostrar un mayor sesgo 3', especialmente con ARN de menor calidad. [15] [16] Estas limitaciones se pueden evitar con el agotamiento ribosómico, eliminando el ARNr que normalmente representa más del 90% del ARN en una célula. Tanto el enriquecimiento de poli(A) como los pasos de agotamiento ribosómico requieren mucha mano de obra y podrían introducir sesgos, por lo que se han desarrollado enfoques más simples para omitir estos pasos. [17] Los objetivos de ARN pequeños, como el miRNA , se pueden aislar aún más mediante la selección de tamaño con geles de exclusión, perlas magnéticas o kits comerciales.
  3. Síntesis de ADNc: el ARN se transcribe de forma inversa a ADNc porque el ADN es más estable y para permitir la amplificación (que utiliza ADN polimerasas ) y aprovechar una tecnología de secuenciación de ADN más madura. La amplificación posterior a la transcripción inversa da como resultado la pérdida de la cadena , que se puede evitar con el etiquetado químico o la secuenciación de moléculas individuales. La fragmentación y la selección de tamaño se realizan para purificar secuencias que tienen la longitud adecuada para la máquina de secuenciación. El ARN, el ADNc o ambos se fragmentan con enzimas, sonicación , iones divalentes o nebulizadores. La fragmentación del ARN reduce el sesgo 5' de la transcripción inversa cebada aleatoriamente y la influencia de los sitios de unión del cebador , [13] con la desventaja de que los extremos 5' y 3' se convierten en ADN de forma menos eficiente. La fragmentación es seguida por la selección de tamaño, donde se eliminan secuencias pequeñas o se selecciona un rango estrecho de longitudes de secuencia. Debido a que los ARN pequeños como los miARN se pierden, estos se analizan de forma independiente. El ADNc de cada experimento se puede indexar con un código de barras de hexámero u octámero, de modo que estos experimentos se puedan agrupar en un solo carril para la secuenciación multiplexada.
Métodos de selección y depleción de ARN: [10]
EstrategiaTipo predominante de ARNContenido de ARN ribosómicoContenido de ARN sin procesarMétodo de aislamiento
ARN totalTodoAltoAltoNinguno
Selección de PolyACodificaciónBajoBajoHibridación con oligómeros poli(dT)
Agotamiento del ARNrCodificación, no codificaciónBajoAltoEliminación de oligómeros complementarios al ARNr
Captura de ARNDirigidoBajoModeradoHibridación con sondas complementarias a las transcripciones deseadas

Secuenciación complementaria de ADN (cDNA-Seq)

La biblioteca de ADNc derivada de los biotipos de ARN se secuencia luego en un formato legible por computadora. Existen muchas tecnologías de secuenciación de alto rendimiento para la secuenciación de ADNc, incluidas las plataformas desarrolladas por Illumina , Thermo Fisher , BGI/MGI , PacBio y Oxford Nanopore Technologies . [18] Para la secuenciación de lectura corta de Illumina, una tecnología común para la secuenciación de ADNc, los adaptadores se ligan al ADNc, el ADN se une a una celda de flujo, los grupos se generan a través de ciclos de amplificación de puente y desnaturalización, y la secuencia por síntesis se realiza en ciclos de síntesis de cadena complementaria y excitación láser de bases con terminadores reversibles. La elección de la plataforma de secuenciación y los parámetros están guiados por el diseño experimental y el costo. Las consideraciones de diseño experimental comunes incluyen decidir sobre la longitud de secuenciación, la profundidad de secuenciación, el uso de secuenciación de extremo único versus secuenciación de extremos emparejados, número de réplicas, multiplexación, aleatorización y agregaciones. [19]

Secuenciación de ARN pequeño/ARN no codificante

Al secuenciar ARN que no sea ARNm, se modifica la preparación de la biblioteca. El ARN celular se selecciona en función del rango de tamaño deseado. Para dianas de ARN pequeñas, como miRNA , el ARN se aísla mediante selección de tamaño. Esto se puede realizar con un gel de exclusión por tamaño, a través de perlas magnéticas de selección de tamaño o con un kit desarrollado comercialmente. Una vez aislado, se agregan enlaces a los extremos 3' y 5' y luego se purifica. El paso final es la generación de ADNc mediante transcripción inversa.

Secuenciación directa de ARN

Dado que se ha demostrado que la conversión de ARN en ADNc , la ligadura, la amplificación y otras manipulaciones de muestras introducen sesgos y artefactos que pueden interferir tanto con la caracterización como con la cuantificación adecuadas de las transcripciones, [20] empresas como Helicos (en quiebra), Oxford Nanopore Technologies [21] y otras han explorado la secuenciación directa de ARN de una sola molécula . Esta tecnología secuencia moléculas de ARN directamente de una manera masivamente paralela.

Secuenciación de ARN de una sola molécula en tiempo real

Se ha explorado la secuenciación directa de ARN de una sola molécula en paralelo masivo como una alternativa a la secuenciación de ARN tradicional, en la que la conversión de ARN a ADNc , la ligadura, la amplificación y otros pasos de manipulación de muestras pueden introducir sesgos y artefactos. [22] Las plataformas tecnológicas que realizan secuenciación de ARN de una sola molécula en tiempo real incluyen la secuenciación Nanopore de Oxford Nanopore Technologies (ONT) , [21] PacBio IsoSeq y Helicos (en quiebra). La secuenciación de ARN en su forma nativa preserva modificaciones como la metilación, lo que permite investigarlas de manera directa y simultánea. [21] Otro beneficio de la secuenciación de ARN de una sola molécula es que las transcripciones se pueden cubrir en su longitud completa, lo que permite una detección y cuantificación de isoformas de mayor confianza en comparación con la secuenciación de lectura corta. Tradicionalmente, los métodos de secuenciación de ARN de una sola molécula tienen tasas de error más altas en comparación con la secuenciación de lectura corta, pero los métodos más nuevos como la secuenciación de ARN directa ONT limitan los errores al evitar la fragmentación y la conversión de ADNc. Los usos recientes de la secuenciación de ARN directa ONT para la expresión diferencial en poblaciones de células humanas han demostrado que esta tecnología puede superar muchas limitaciones de la secuenciación de ADNc corta y larga. [23]

Secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-Seq)

Los métodos estándar, como los microarrays y el análisis estándar de secuenciación de ARN en masa, analizan la expresión de ARN de grandes poblaciones de células. En poblaciones de células mixtas, estas mediciones pueden ocultar diferencias críticas entre células individuales dentro de estas poblaciones. [24] [25]

La secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-Seq) proporciona los perfiles de expresión de células individuales. Aunque no es posible obtener información completa sobre cada ARN expresado por cada célula, debido a la pequeña cantidad de material disponible, se pueden identificar patrones de expresión génica a través de análisis de agrupamiento de genes . Esto puede descubrir la existencia de tipos de células raras dentro de una población celular que tal vez nunca se hayan visto antes. Por ejemplo, en 2018, dos grupos que realizaron scRNA-Seq en epitelios de las vías respiratorias pulmonares identificaron células especializadas raras en el pulmón llamadas ionocitos pulmonares que expresan el regulador de conductancia transmembrana de la fibrosis quística . [26] [27]

Procedimientos experimentales

Flujo de trabajo típico de secuenciación de ARN de una sola célula. Se aíslan células individuales de una muestra en pocillos o gotitas, se generan y amplifican bibliotecas de ADNc, se secuencian las bibliotecas y se generan matrices de expresión para análisis posteriores, como la identificación del tipo de célula.

Los protocolos actuales de scRNA-Seq implican los siguientes pasos: aislamiento de células individuales y ARN, transcripción inversa (RT), amplificación, generación de bibliotecas y secuenciación. Las células individuales se separan mecánicamente en micropocillos (p. ej., BD Rhapsody, Takara ICELL8, Vycap Puncher Platform o CellMicrosystems CellRaft) o se encapsulan en gotitas (p. ej., 10x Genomics Chromium, Illumina Bio-Rad ddSEQ, 1CellBio InDrop, Dolomite Bio Nadia). [28] Las células individuales se marcan añadiendo perlas con oligonucleótidos con código de barras; tanto las células como las perlas se suministran en cantidades limitadas de modo que la co-ocupación con múltiples células y perlas es un evento muy raro. Una vez que se completa la transcripción inversa, los ADNc de muchas células se pueden mezclar para la secuenciación; las transcripciones de una célula en particular se identifican por el código de barras único de cada célula. [29] [30] Se pueden adjuntar identificadores moleculares únicos (UMI) a secuencias objetivo de ARNm/ADNc para ayudar a identificar artefactos durante la preparación de la biblioteca. [31]

Los desafíos para scRNA-Seq incluyen preservar la abundancia relativa inicial de ARNm en una célula e identificar transcripciones raras. [32] El paso de transcripción inversa es crítico ya que la eficiencia de la reacción de RT determina qué cantidad de la población de ARN de la célula será analizada finalmente por el secuenciador. La procesividad de las transcriptasas inversas y las estrategias de cebado utilizadas pueden afectar la producción de ADNc de longitud completa y la generación de bibliotecas sesgadas hacia el extremo 3' o 5' de los genes.

En la etapa de amplificación, actualmente se utiliza PCR o transcripción in vitro (IVT) para amplificar el ADNc. Una de las ventajas de los métodos basados ​​en PCR es la capacidad de generar ADNc de longitud completa. Sin embargo, la diferente eficiencia de la PCR en secuencias particulares (por ejemplo, contenido de GC y estructura de snapback) también puede amplificarse exponencialmente, produciendo bibliotecas con cobertura desigual. Por otro lado, mientras que las bibliotecas generadas por IVT pueden evitar el sesgo de secuencia inducido por PCR, secuencias específicas pueden transcribirse de manera ineficiente, causando así la pérdida de secuencia o generando secuencias incompletas. [33] [24] Se han publicado varios protocolos scRNA-Seq: Tang et al., [34] STRT, [35] SMART-seq, [36] CEL-seq, [37] RAGE-seq, [38] Quartz-seq [39] y C1-CAGE. [40] Estos protocolos difieren en términos de estrategias para la transcripción inversa, la síntesis y amplificación de ADNc y la posibilidad de acomodar códigos de barras específicos de secuencia (es decir, UMI ) o la capacidad de procesar muestras agrupadas. [41]

En 2017, se introdujeron dos enfoques para medir simultáneamente la expresión de ARNm y proteínas de una sola célula a través de anticuerpos marcados con oligonucleótidos conocidos como REAP-seq, [42] y CITE-seq. [43]

Aplicaciones

El scRNA-Seq se está utilizando ampliamente en disciplinas biológicas, incluido el desarrollo, la neurología , [44] la oncología , [45] [46] [47] las enfermedades autoinmunes , [48] y las enfermedades infecciosas . [49]

La secuenciación de ARNm ha proporcionado una perspectiva considerable sobre el desarrollo de embriones y organismos, incluido el gusano Caenorhabditis elegans [50] y la planaria regenerativa Schmidtea mediterranea [51] [52] Los primeros animales vertebrados en ser mapeados de esta manera fueron el pez cebra [53] [54] y el Xenopus laevis [55] En cada caso se estudiaron múltiples etapas del embrión, lo que permitió mapear todo el proceso de desarrollo célula por célula [10] Science reconoció estos avances como el Avance del Año 2018 [ 56]

Consideraciones experimentales

Al diseñar y realizar experimentos de RNA-Seq se tienen en cuenta diversos parámetros :

  • Especificidad tisular: la expresión génica varía dentro y entre los tejidos, y la secuenciación de ARN mide esta mezcla de tipos de células. Esto puede dificultar el aislamiento del mecanismo biológico de interés. La secuenciación de células individuales se puede utilizar para estudiar cada célula individualmente, lo que mitiga este problema.
  • Dependencia del tiempo: la expresión génica cambia con el tiempo y la secuenciación de ARN solo toma una instantánea. Se pueden realizar experimentos de evolución temporal para observar cambios en el transcriptoma.
  • Cobertura (también conocida como profundidad): el ARN contiene las mismas mutaciones observadas en el ADN, y su detección requiere una cobertura más profunda. Con una cobertura lo suficientemente alta, la secuenciación de ARN se puede utilizar para estimar la expresión de cada alelo. Esto puede proporcionar información sobre fenómenos como la impronta o los efectos reguladores cis . La profundidad de secuenciación necesaria para aplicaciones específicas se puede extrapolar a partir de un experimento piloto. [57]
  • Artefactos de generación de datos (también conocidos como variación técnica): los reactivos (por ejemplo, el kit de preparación de la biblioteca), el personal involucrado y el tipo de secuenciador (por ejemplo, Illumina , Pacific Biosciences ) pueden generar artefactos técnicos que podrían malinterpretarse como resultados significativos. Como con cualquier experimento científico, es prudente realizar RNA-Seq en un entorno bien controlado. Si esto no es posible o el estudio es un metanálisis , otra solución es detectar artefactos técnicos infiriendo variables latentes (normalmente análisis de componentes principales o análisis factorial ) y corrigiendo posteriormente estas variables. [58]
  • Gestión de datos: Un único experimento de RNA-Seq en humanos suele ocupar entre 1 y 5 Gb (comprimido), o más si se incluyen archivos intermedios. [59] Este gran volumen de datos puede plantear problemas de almacenamiento. Una solución es comprimir los datos utilizando esquemas computacionales multipropósito (p. ej., gzip ) o esquemas específicos de genómica. Estos últimos pueden basarse en secuencias de referencia o de novo. Otra solución es realizar experimentos de microarrays, que pueden ser suficientes para trabajos basados ​​en hipótesis o estudios de replicación (a diferencia de la investigación exploratoria).

Análisis

Un flujo de trabajo estándar de análisis de ARN-Seq. Las lecturas secuenciadas se alinean con un genoma o transcriptoma de referencia y, posteriormente, se procesan para una variedad de análisis basados ​​en hipótesis, descubrimiento y control de calidad.

Ensamblaje del transcriptoma

Se utilizan dos métodos para asignar lecturas de secuencias sin procesar a características genómicas (es decir, ensamblar el transcriptoma):

  • De novo: este enfoque no requiere un genoma de referencia para reconstruir el transcriptoma y se utiliza normalmente si el genoma es desconocido, incompleto o sustancialmente alterado en comparación con la referencia. [60] Los desafíos al utilizar lecturas cortas para el ensamblaje de novo incluyen 1) determinar qué lecturas deben unirse en secuencias contiguas ( contigs ), 2) robustez ante errores de secuenciación y otros artefactos, y 3) eficiencia computacional. El algoritmo principal utilizado para el ensamblaje de novo pasó de los gráficos de superposición, que identifican todas las superposiciones por pares entre lecturas, a los gráficos de Bruijn , que dividen las lecturas en secuencias de longitud k y colapsan todos los k-meros en una tabla hash. [61] Los gráficos de superposición se utilizaron con la secuenciación de Sanger, pero no se escalan bien a los millones de lecturas generadas con RNA-Seq. Ejemplos de ensambladores que utilizan grafos de Bruijn son Trinity, [60] Oases [62] (derivado del ensamblador genómico Velvet [63] ), Bridger [64] y rnaSPAdes. [65] La secuenciación de extremos emparejados y de lectura larga de la misma muestra puede mitigar los déficits en la secuenciación de lectura corta al servir como plantilla o esqueleto. Las métricas para evaluar la calidad de un ensamblaje de novo incluyen la longitud media de contig, el número de contig y N50 . [66]
Alineación de secuencias de ARN con lecturas cortas divididas en intrones. Alineación de lecturas cortas con una secuencia de ARNm y el genoma de referencia. El software de alineación debe tener en cuenta las lecturas cortas que se superponen a las uniones exón-exón (en rojo) y, por lo tanto, omiten secciones intrónicas del pre-ARNm y el genoma de referencia.
  • Guiado por el genoma: este enfoque se basa en los mismos métodos utilizados para la alineación del ADN, con la complejidad adicional de alinear lecturas que cubren porciones no continuas del genoma de referencia. [67] Estas lecturas no continuas son el resultado de la secuenciación de transcripciones empalmadas (ver figura). Normalmente, los algoritmos de alineación tienen dos pasos: 1) alinear porciones cortas de la lectura (es decir, sembrar el genoma) y 2) usar programación dinámica para encontrar una alineación óptima, a veces en combinación con anotaciones conocidas. Las herramientas de software que utilizan la alineación guiada por el genoma incluyen Bowtie , [68] TopHat (que se basa en los resultados de BowTie para alinear las uniones de empalme), [69] [70] Subread, [71] STAR, [67] HISAT2, [72] y GMAP. [73] La salida de las herramientas de alineación (mapeo) guiada por genoma puede ser utilizada además por herramientas como Cufflinks [70] o StringTie [74] para reconstruir secuencias de transcripción contiguas ( es decir , un archivo FASTA). La calidad de un ensamblaje guiado por genoma puede medirse con 1) métricas de ensamblaje de novo (por ejemplo, N50) y 2) comparaciones con secuencias de transcripción, unión de empalme, genoma y proteína conocidas usando precisión, recuperación o su combinación (por ejemplo, puntuación F1). [66] Además, la evaluación in silico podría realizarse usando lecturas simuladas. [75] [76]

Una nota sobre la calidad del ensamblaje: el consenso actual es que 1) la calidad del ensamblaje puede variar según la métrica utilizada, 2) las herramientas de ensamblaje que obtuvieron buenos resultados en una especie no necesariamente funcionan bien en la otra especie, y 3) la combinación de diferentes enfoques podría ser la más confiable. [77] [78] [79]

Cuantificación de la expresión génica

La expresión se cuantifica para estudiar los cambios celulares en respuesta a estímulos externos, las diferencias entre estados sanos y enfermos y otras cuestiones de investigación. Los niveles de transcripción se utilizan a menudo como un indicador de la abundancia de proteínas, pero a menudo no son equivalentes debido a eventos postranscripcionales como la interferencia del ARN y la descomposición mediada por sinsentidos . [80]

La expresión se cuantifica contando el número de lecturas que se asignaron a cada locus en el paso de ensamblaje del transcriptoma. La expresión se puede cuantificar para exones o genes utilizando contigs o anotaciones de transcripción de referencia. [10] Estos recuentos de lecturas de RNA-Seq observados se han validado de manera sólida frente a tecnologías más antiguas, incluidas las micromatrices de expresión y la qPCR . [57] [81] Las herramientas que cuantifican los recuentos son HTSeq, [82] FeatureCounts, [83] Rcount, [84] maxcounts, [85] FIXSEQ, [86] y Cuffquant. Estas herramientas determinan los recuentos de lecturas a partir de datos de RNA-Seq alineados, pero también se pueden obtener recuentos sin alineación con Sailfish [87] y Kallisto. [88] Luego, los recuentos de lecturas se convierten en métricas apropiadas para pruebas de hipótesis, regresiones y otros análisis. Los parámetros para esta conversión son:

  • Profundidad/cobertura de secuenciación : aunque la profundidad se especifica previamente al realizar múltiples experimentos de RNA-Seq, aún variará ampliamente entre experimentos. [89] Por lo tanto, el número total de lecturas generadas en un solo experimento generalmente se normaliza convirtiendo los recuentos en fragmentos, lecturas o recuentos por millón de lecturas mapeadas (FPM, RPM o CPM). La diferencia entre RPM y FPM se derivó históricamente durante la evolución de la secuenciación de fragmentos de un solo extremo a la secuenciación de extremos emparejados. En la secuenciación de un solo extremo, solo hay una lectura por fragmento ( es decir , RPM = FPM). En la secuenciación de extremos emparejados, hay dos lecturas por fragmento ( es decir , RPM = 2 x FPM). La profundidad de secuenciación a veces se denomina tamaño de la biblioteca , la cantidad de moléculas de ADNc intermediarias en el experimento.
  • Longitud del gen: los genes más largos tendrán más fragmentos/lecturas/conteos que los genes más cortos si la expresión de la transcripción es la misma. Esto se ajusta dividiendo el FPM por la longitud de una característica (que puede ser un gen, una transcripción o un exón), lo que da como resultado la métrica fragmentos por kilobase de característica por millón de lecturas mapeadas (FPKM). [90] Al observar grupos de características en muestras, FPKM se convierte en transcripciones por millón (TPM) dividiendo cada FPKM por la suma de FPKM dentro de una muestra. [91] [92] [93]
  • Salida total de ARN de la muestra: debido a que se extrae la misma cantidad de ARN de cada muestra, las muestras con más ARN total tendrán menos ARN por gen. Estos genes parecen tener una expresión reducida, lo que da como resultado falsos positivos en los análisis posteriores. [89] Las estrategias de normalización, que incluyen cuantiles, DESeq2, TMM y proporción mediana, intentan explicar esta diferencia comparando un conjunto de genes expresados ​​de manera no diferencial entre muestras y escalando en consecuencia. [94]
  • Varianza para la expresión de cada gen: se modela para tener en cuenta el error de muestreo (importante para genes con recuentos de lectura bajos), aumentar la potencia y disminuir los falsos positivos. La varianza se puede estimar como unadistribución normal , de Poisson o binomial negativa [95] [96] [97] y con frecuencia se descompone en varianza técnica y biológica.

Spike-ins para cuantificación absoluta y detección de efectos en todo el genoma

Los agregados de ARN son muestras de ARN en concentraciones conocidas que pueden usarse como estándares de oro en el diseño experimental y durante los análisis posteriores para la cuantificación absoluta y la detección de efectos en todo el genoma.

  • Cuantificación absoluta: la cuantificación absoluta de la expresión génica no es posible con la mayoría de los experimentos de secuenciación de ARN, que cuantifican la expresión relativa a todas las transcripciones. Es posible realizar la secuenciación de ARN con secuencias de adición de secuencias, muestras de ARN en concentraciones conocidas. Después de la secuenciación, se utilizan los recuentos de lecturas de las secuencias de adición de secuencias para determinar la relación entre los recuentos de lecturas de cada gen y las cantidades absolutas de fragmentos biológicos. [13] [98] En un ejemplo, esta técnica se utilizó en embriones de Xenopus tropicalis para determinar la cinética de la transcripción. [99]
  • Detección de efectos en todo el genoma: los cambios en los reguladores globales, incluidos los remodeladores de cromatina , los factores de transcripción (por ejemplo, MYC ), los complejos de acetiltransferasa y el posicionamiento de los nucleosomas no son congruentes con los supuestos de normalización y los controles de adición pueden ofrecer una interpretación precisa. [100] [101]

Expresión diferencial

El uso más simple pero a menudo más poderoso de RNA-Seq es encontrar diferencias en la expresión genética entre dos o más condiciones ( por ejemplo , tratado vs no tratado); este proceso se llama expresión diferencial. Los resultados se denominan con frecuencia genes expresados ​​diferencialmente (DEG) y estos genes pueden ser regulados al alza o a la baja ( es decir , más altos o más bajos en la condición de interés). Hay muchas herramientas que realizan la expresión diferencial . La mayoría se ejecutan en R , Python o la línea de comandos de Unix . Las herramientas comúnmente utilizadas incluyen DESeq, [96] edgeR, [97] y voom+limma, [95] [102] todas las cuales están disponibles a través de R/ Bioconductor . [103] [104] Estas son las consideraciones comunes al realizar la expresión diferencial:

  • Entradas: Las entradas de expresión diferencial incluyen (1) una matriz de expresión de RNA-Seq (M genes x N muestras) y (2) una matriz de diseño que contiene condiciones experimentales para N muestras. La matriz de diseño más simple contiene una columna, correspondiente a las etiquetas para la condición que se está probando. Otras covariables (también denominadas factores, características, etiquetas o parámetros) pueden incluir efectos de lote , artefactos conocidos y cualquier metadato que pueda confundir o mediar la expresión genética. Además de las covariables conocidas, las covariables desconocidas también se pueden estimar a través de enfoques de aprendizaje automático no supervisado que incluyen análisis de componentes principales , variables sustitutas [105] y PEER [58] . Los análisis de variables ocultas a menudo se emplean para datos de RNA-Seq de tejido humano, que normalmente tienen artefactos adicionales no capturados en los metadatos ( p. ej. , tiempo de isquemia, obtención de múltiples instituciones, rasgos clínicos subyacentes, recopilación de datos a lo largo de muchos años con mucho personal).
  • Métodos: La mayoría de las herramientas utilizan regresión o estadísticas no paramétricas para identificar genes expresados ​​diferencialmente, y se basan en recuentos de lecturas mapeados a un genoma de referencia (DESeq2, limma, edgeR) o en recuentos de lecturas derivados de cuantificación sin alineamiento (sleuth, [106] Cuffdiff, [107] Ballgown [108] ). [109] Después de la regresión, la mayoría de las herramientas emplean ajustes de valor p de tasa de error familiar (FWER) o tasa de falsos descubrimientos (FDR) para tener en cuenta múltiples hipótesis (en estudios humanos, ~20 000 genes codificadores de proteínas o ~50 000 biotipos).
  • Resultados: Un resultado típico consiste en filas correspondientes al número de genes y al menos tres columnas, el cambio de log fold de cada gen ( transformación de log de la relación en la expresión entre condiciones, una medida del tamaño del efecto ), valor p y valor p ajustado para comparaciones múltiples . Los genes se definen como biológicamente significativos si pasan los puntos de corte para el tamaño del efecto (cambio de log fold) y la significación estadística . Estos puntos de corte idealmente deberían especificarse a priori , pero la naturaleza de los experimentos de RNA-Seq es a menudo exploratoria, por lo que es difícil predecir los tamaños del efecto y los puntos de corte pertinentes con anticipación.
  • Dificultades: La razón de ser de estos métodos complejos es evitar la gran cantidad de dificultades que pueden llevar a errores estadísticos e interpretaciones engañosas. Las dificultades incluyen mayores tasas de falsos positivos (debido a comparaciones múltiples), artefactos en la preparación de muestras, heterogeneidad de las muestras (como antecedentes genéticos mixtos), muestras altamente correlacionadas, diseños experimentales de múltiples niveles no tenidos en cuenta y un diseño experimental deficiente . Una dificultad notable es ver los resultados en Microsoft Excel sin usar la función de importación para garantizar que los nombres de los genes sigan siendo texto. [110] Aunque es conveniente, Excel convierte automáticamente algunos nombres de genes ( SEPT1 , DEC1 , MARCH2 ) en fechas o números de punto flotante.
  • Elección de herramientas y evaluación comparativa: existen numerosos esfuerzos que comparan los resultados de estas herramientas, y DESeq2 tiende a superar moderadamente a otros métodos. [111] [112] [113] [114] [19] [109] [115] [116] Al igual que con otros métodos, la evaluación comparativa consiste en comparar los resultados de las herramientas entre sí y con estándares de oro conocidos .

Los análisis posteriores para una lista de genes expresados ​​diferencialmente vienen en dos sabores, validar observaciones y hacer inferencias biológicas. Debido a las trampas de la expresión diferencial y RNA-Seq, las observaciones importantes se replican con (1) un método ortogonal en las mismas muestras (como PCR en tiempo real ) o (2) otro experimento, a veces pre-registrado , en una nueva cohorte. Este último ayuda a asegurar la generalización y típicamente puede ser seguido con un metanálisis de todas las cohortes agrupadas. El método más común para obtener una comprensión biológica de alto nivel de los resultados es el análisis de enriquecimiento del conjunto de genes , aunque a veces se emplean enfoques de genes candidatos. El enriquecimiento del conjunto de genes determina si la superposición entre dos conjuntos de genes es estadísticamente significativa, en este caso la superposición entre genes expresados ​​diferencialmente y conjuntos de genes de vías/bases de datos conocidas ( por ejemplo , Gene Ontology , KEGG , Human Phenotype Ontology ) o de análisis complementarios en los mismos datos (como redes de coexpresión). Las herramientas comunes para el enriquecimiento de conjuntos de genes incluyen interfaces web ( por ejemplo , ENRICHR, g:profiler, WEBGESTALT) [117] y paquetes de software. Al evaluar los resultados del enriquecimiento, una heurística es buscar primero el enriquecimiento de la biología conocida como una comprobación de cordura y luego ampliar el alcance para buscar biología nueva.

Ejemplos de modos alternativos de empalme de ARN. Los exones se representan como bloques azules y amarillos, los intrones empalmados como líneas negras horizontales que conectan dos exones y las uniones exón-exón como líneas de conexión delgadas de color gris entre dos exones.

Empalme alternativo

El empalme de ARN es parte integral de los eucariotas y contribuye significativamente a la regulación y diversidad de proteínas, y ocurre en >90% de los genes humanos. [118] Existen múltiples modos de empalme alternativo : omisión de exón (modo de empalme más común en humanos y eucariotas superiores), exones mutuamente excluyentes, sitios donantes o aceptores alternativos, retención de intrones (modo de empalme más común en plantas, hongos y protozoos), sitio de inicio de transcripción alternativo (promotor) y poliadenilación alternativa. [118] Un objetivo de RNA-Seq es identificar eventos de empalme alternativo y probar si difieren entre condiciones. La secuenciación de lectura larga captura la transcripción completa y, por lo tanto, minimiza muchos de los problemas en la estimación de la abundancia de isoformas, como el mapeo de lectura ambigua. Para RNA-Seq de lectura corta, existen múltiples métodos para detectar empalme alternativo que se pueden clasificar en tres grupos principales: [119] [91] [120]

  • Basado en recuentos (también basado en eventos, empalme diferencial): estima la retención de exones. Algunos ejemplos son DEXSeq, [121] MATS, [122] y SeqGSEA. [123]
  • Basado en isoformas (también módulos de lectura múltiple, expresión diferencial de isoformas) : primero se estima la abundancia de isoformas y luego la abundancia relativa entre condiciones. Algunos ejemplos son Cufflinks 2 [124] y DiffSplice. [125]
  • Basado en la escisión de intrones: calcule el empalme alternativo utilizando lecturas divididas. Algunos ejemplos son MAJIQ [126] y Leafcutter. [120]

Las herramientas de expresión genética diferencial también se pueden utilizar para la expresión de isoformas diferenciales si las isoformas se cuantifican con anticipación con otras herramientas como RSEM. [127]

Redes de coexpresión

Las redes de coexpresión son representaciones derivadas de datos de genes que se comportan de manera similar en diferentes tejidos y condiciones experimentales. [128] Su propósito principal radica en la generación de hipótesis y en enfoques de culpabilidad por asociación para inferir funciones de genes previamente desconocidos. [128] Los datos de RNA-Seq se han utilizado para inferir genes involucrados en vías específicas basadas en la correlación de Pearson , tanto en plantas [129] como en mamíferos. [130] La principal ventaja de los datos de RNA-Seq en este tipo de análisis sobre las plataformas de microarrays es la capacidad de cubrir todo el transcriptoma, lo que permite la posibilidad de desentrañar representaciones más completas de las redes reguladoras de genes. La regulación diferencial de las isoformas de empalme del mismo gen se puede detectar y utilizar para predecir sus funciones biológicas. [131] [132] El análisis de redes de coexpresión de genes ponderados se ha utilizado con éxito para identificar módulos de coexpresión y genes centrales intramodulares basados ​​en datos de RNA seq. Los módulos de coexpresión pueden corresponder a tipos de células o vías. Los centros intramodulares altamente conectados pueden interpretarse como representantes de su respectivo módulo. Un gen propio es una suma ponderada de la expresión de todos los genes en un módulo. Los genes propios son biomarcadores útiles (características) para el diagnóstico y el pronóstico. [133] Se han propuesto enfoques de transformación estabilizadora de varianza para estimar coeficientes de correlación basados ​​en datos de secuenciación de ARN. [129]

Descubrimiento de variantes

RNA-Seq captura la variación del ADN, incluyendo variantes de un solo nucleótido , pequeñas inserciones/deleciones y variación estructural . La llamada de variantes en RNA-Seq es similar a la llamada de variantes de ADN y a menudo emplea las mismas herramientas (incluyendo SAMtools mpileup [134] y GATK HaplotypeCaller [135] ) con ajustes para tener en cuenta el empalme. Una dimensión única para las variantes de ARN es la expresión específica de alelos (ASE) : las variantes de un solo haplotipo podrían expresarse preferentemente debido a efectos reguladores que incluyen impronta y expresión de loci de rasgos cuantitativos y variantes raras no codificantes . [136] [137] Las limitaciones de la identificación de variantes de ARN incluyen que solo refleja regiones expresadas (en humanos, <5% del genoma), podría estar sujeta a sesgos introducidos por el procesamiento de datos (p. ej., los ensamblajes de transcriptomas de novo subestiman la heterocigosidad [138] ) y tiene menor calidad en comparación con la secuenciación directa de ADN.

Edición de ARN (alteraciones postranscripcionales)

Disponer de las secuencias genómicas y transcriptómicas coincidentes de un individuo puede ayudar a detectar ediciones postranscripcionales ( edición de ARN ). [3] Un evento de modificación postranscripcional se identifica si la transcripción del gen tiene un alelo/variante que no se observa en los datos genómicos.

Un evento de fusión de genes y el comportamiento de las lecturas de extremos emparejados que caen en ambos lados de la unión de genes. Las fusiones de genes pueden ocurrir en Trans , entre genes en cromosomas separados, o en Cis , entre dos genes en el mismo cromosoma.

Detección de genes de fusión

Los genes de fusión, que son consecuencia de diferentes modificaciones estructurales en el genoma, han ganado atención debido a su relación con el cáncer. [139] La capacidad de RNA-Seq para analizar el transcriptoma completo de una muestra de manera imparcial lo convierte en una herramienta atractiva para encontrar este tipo de eventos comunes en el cáncer. [4]

La idea surge del proceso de alinear las lecturas transcriptómicas cortas con un genoma de referencia. La mayoría de las lecturas cortas caerán dentro de un exón completo, y se esperaría que un conjunto más pequeño, pero aún grande, se mapeara en uniones exón-exón conocidas. Las lecturas cortas restantes sin mapear se analizarían más a fondo para determinar si coinciden con una unión exón-exón donde los exones provienen de diferentes genes. Esto sería evidencia de un posible evento de fusión, sin embargo, debido a la longitud de las lecturas, esto podría resultar muy ruidoso. Un enfoque alternativo es usar lecturas de extremos emparejados, cuando un número potencialmente grande de lecturas emparejadas mapearía cada extremo a un exón diferente, brindando una mejor cobertura de estos eventos (ver figura). No obstante, el resultado final consiste en múltiples y potencialmente novedosas combinaciones de genes que proporcionan un punto de partida ideal para una mayor validación.

Alteración del número de copias

Los análisis de alteración del número de copias (CNA) se utilizan comúnmente en los estudios sobre el cáncer. La ganancia y pérdida de genes tiene implicaciones en las vías de señalización y son un biomarcador clave de disfunción molecular en oncología. La obtención de la información de la CNA a partir de los datos de RNA-Seq no es sencilla debido a las diferencias en la expresión genética, que conducen a una variación de la profundidad de lectura de diferentes magnitudes entre los genes. Debido a estas dificultades, la mayoría de estos análisis se realizan habitualmente mediante secuenciación del genoma completo/secuenciación del exoma completo (WGS/WES). Pero las herramientas bioinformáticas avanzadas pueden obtener la CNA a partir de RNA-Seq. [140]

Otros análisis y aplicaciones emergentes

Las aplicaciones de RNA-Seq están creciendo día a día. Otras nuevas aplicaciones de RNA-Seq incluyen la detección de contaminantes microbianos, [141] la determinación de la abundancia de tipos celulares (desconvolución de tipos celulares), [8] la medición de la expresión de TE y la predicción de neoantígenos, etc. [8]

Historia

Las coincidencias de manuscritos de PubMed resaltan la creciente popularidad de RNA-Seq. Las coincidencias son para RNA-Seq (azul, términos de búsqueda: "RNA Seq" OR "RNA-Seq" OR "RNA sequencing" OR "RNASeq") [142] y RNA=Seq in medicine (oro, términos de búsqueda: ("RNA Seq" OR "RNA-Seq" OR "RNA sequencing" OR "RNASeq") AND "Medicine"). [143] La cantidad de manuscritos en PubMed que incluyen RNA-Seq sigue aumentando.

El ARN-Seq se desarrolló por primera vez a mediados de la década de 2000 con la llegada de la tecnología de secuenciación de próxima generación. [144] Los primeros manuscritos que utilizaron ARN-Seq incluso sin usar el término incluyen los de líneas celulares de cáncer de próstata [145] (fechado en 2006), Medicago truncatula [146] (2006), maíz [147] (2007) y Arabidopsis thaliana [148] (2007), mientras que el término "ARN-Seq" en sí se mencionó por primera vez en 2008. [13] [149] La cantidad de manuscritos que hacen referencia al ARN-Seq en el título o resumen (Figura, línea azul) aumenta continuamente con 6754 manuscritos publicados en 2018. La intersección del ARN-Seq y la medicina (Figura, línea dorada) tiene una celeridad similar. [150]

Aplicaciones a la medicina

La secuenciación de ARN tiene el potencial de identificar nuevas enfermedades biológicas, crear perfiles de biomarcadores para indicaciones clínicas, inferir vías farmacológicas y realizar diagnósticos genéticos. [151] [152] Estos resultados podrían personalizarse aún más para subgrupos o incluso para pacientes individuales, lo que podría poner de relieve una prevención, un diagnóstico y una terapia más eficaces. La viabilidad de este enfoque está determinada en parte por los costes en dinero y tiempo; una limitación relacionada es el equipo de especialistas necesario (bioinformáticos, médicos/clínicos, investigadores básicos, técnicos) para interpretar por completo la enorme cantidad de datos generados por este análisis. [153]

Esfuerzos de secuenciación a gran escala

Se ha dado mucho énfasis a los datos de RNA-Seq después de que los proyectos Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) y The Cancer Genome Atlas (TCGA) hayan utilizado este enfoque para caracterizar docenas de líneas celulares [154] y miles de muestras de tumores primarios, [155] respectivamente. ENCODE tenía como objetivo identificar regiones reguladoras de todo el genoma en diferentes cohortes de líneas celulares y los datos transcriptómicos son fundamentales para comprender el efecto descendente de esas capas reguladoras epigenéticas y genéticas. TCGA, en cambio, tenía como objetivo recopilar y analizar miles de muestras de pacientes de 30 tipos de tumores diferentes para comprender los mecanismos subyacentes de la transformación y progresión malignas. En este contexto, los datos de RNA-Seq brindan una instantánea única del estado transcriptómico de la enfermedad y analizan una población imparcial de transcripciones que permite la identificación de nuevas transcripciones, transcripciones de fusión y ARN no codificantes que podrían pasar desapercibidos con diferentes tecnologías.

Véase también

Referencias

Este artículo fue enviado a WikiJournal of Science para su revisión académica externa por pares en 2019 (informes de los revisores). El contenido actualizado fue reintegrado a la página de Wikipedia bajo una licencia CC-BY-SA-3.0 ( 2021 ). La versión de registro revisada es: Felix Richter, et al. (17 de mayo de 2021). "Una amplia introducción a RNA-Seq" (PDF) . WikiJournal of Science . 4 (2): 4. doi : 10.15347/WJS/2021.004 . ISSN  2470-6345. Wikidata  Q100146647.

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Lectura adicional

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Scholia tiene un perfil de tema para RNA-Seq .
  • Cresko B, Voelker R, Small C (2001). Bassham S, Catchen J (eds.). "RNA-seqlopedia". Universidad de Oregon.:una guía de alto nivel para diseñar e implementar un experimento de ARN-Seq.
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