Lisado de amebocitos de Limulus

El lisado de amebocitos de Limulus ( LAL ) es un extracto acuoso de células sanguíneas móviles ( amebocitos ) del cangrejo herradura del Atlántico Limulus polyphemus . El LAL reacciona con endotoxinas bacterianas como los lipopolisacáridos (LPS), que son componentes de la cápsula bacteriana , la membrana más externa de la envoltura celular de las bacterias gramnegativas . Esta reacción es la base de la prueba LAL , que se utiliza ampliamente para la detección y cuantificación de endotoxinas bacterianas .

En Asia, en ocasiones se utiliza una prueba similar de lisado de amebocitos de Tachypleus ( TAL ) basada en los cangrejos herradura locales Tachypleus gigas o Tachypleus tridentatus ^{. [1]} El ensayo de factor C recombinante (rFC) es un reemplazo de LAL y TAL basado en una reacción similar. ^[2]

El investigador médico estadounidense Fred Bang informó en 1956 que las bacterias gramnegativas, incluso si se eliminan, harán que la sangre del cangrejo herradura se convierta en un gel , un tipo de masa semisólida . Más tarde se reconoció que las células sanguíneas del animal, células móviles llamadas amebocitos , contienen gránulos con un factor de coagulación conocido como coagulógeno ; este se libera fuera de la célula cuando se encuentran endotoxinas bacterianas. Después de la coagulación y la posterior gelificación , se cree que el gel resultante contiene infecciones bacterianas en el sistema circulatorio semicerrado del animal . ^[3] El análisis moderno del lisado ha llevado a la comprensión de este sistema de cascada, con múltiples enzimas trabajando en secuencia para producir el gel. El punto de entrada de la coagulación inducida por endotoxinas es el factor de coagulación C de Limulus. ^[4]

En 1977, la Administración de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos (FDA) aprobó la LAL para la prueba de medicamentos, productos y dispositivos que entran en contacto con la sangre. Antes de esa fecha, se había utilizado para este fin una prueba mucho más lenta y costosa en conejos . ^[5]

Los cangrejos herradura se recogen y se extrae la sangre del pericardio del cangrejo herradura ; algunos cangrejos se devuelven luego al agua, mientras que otros se venden para ser comidos o utilizados como cebo. Las empresas que extraen LAL de los cangrejos herradura declararon antes de 2008 que las tasas de mortalidad estaban por debajo del 3%. ^[6] Un estudio de 2009 de la División de Pesca Marina de Massachusetts afirmó que estudios anteriores encontraron una mortalidad del 5 al 15% para los machos y una estimación del 29% para las hembras. El estudio en sí encontró un 22% para las hembras devueltas inmediatamente al agua y un 30% para las hembras mantenidas durante la noche para representar una práctica comercial. ^[7] Las células sanguíneas se separan del suero mediante centrifugación y luego se colocan en agua destilada, lo que hace que se hinchen y revienten ("lisan"). Esto libera los químicos del interior de la célula (el "lisado"), que luego se purifica y se liofiliza . Para analizar una muestra en busca de endotoxinas, se mezcla con lisado y agua; Las endotoxinas están presentes si se produce coagulación. ^[8]

Existen tres metodologías básicas: gel-clot, turbidimétrica y cromogénica . La principal aplicación de LAL es la prueba de productos farmacéuticos parenterales y dispositivos médicos que entran en contacto con sangre o líquido cefalorraquídeo . En los Estados Unidos, la FDA ha publicado una guía para la validación de la prueba LAL como prueba de endotoxinas para dichos productos. ^[9]

La cascada LAL también es desencadenada por el (1,3)-β-D-glucano , a través de un factor G diferente. Tanto las endotoxinas bacterianas como el (1,3)-β-D-glucano se consideran patrones moleculares asociados a patógenos , o PAMP, sustancias que provocan respuestas inflamatorias en los mamíferos . ^[10]

Uno de los aspectos que más tiempo requiere en las pruebas de endotoxinas con LAL es el pretratamiento de las muestras para superar la inhibición del ensayo que puede interferir con la prueba de LAL de modo que la recuperación de endotoxinas se vea afectada. Si el producto que se está probando hace que la recuperación de endotoxinas sea menor que la esperada, el producto es inhibidor de la prueba de LAL. Los productos que causan valores más altos que los esperados son potenciadores. La FDA exige superar las propiedades de inhibición y potenciación de un producto como parte de la validación de la prueba de LAL para su uso en las pruebas de liberación final de inyectables y dispositivos médicos. Se debe demostrar una recuperación adecuada de endotoxinas antes de que se pueda utilizar LAL para liberar el producto. ^[11]

La prueba LAL es una fuente importante de dependencia de productos animales en la industria biomédica y un desafío a las tres R de la ciencia en relación con el uso de animales en pruebas. Con informes de tasas de mortalidad más altas de lo previsto ^[7], se ha considerado más ético idear alternativas a la prueba. ^[12] Desde 2003, un sustituto de proteína recombinante para su uso en la prueba LAL ha estado disponible comercialmente. Denominado ensayo de factor C recombinante (rFC), se basa en la misma proteína del factor C de coagulación de Limulus , pero producida por células de insectos genéticamente modificadas (la secuencia específica del factor C utilizada no proviene necesariamente del cangrejo herradura del Atlántico). ^[5]

En lugar de emular toda la vía de coagulación, las pruebas rFC permiten que el factor C escinda un sustrato fluorogénico sintético , de modo que la muestra se ilumina cuando la endotoxina activa el factor. Dado que no contiene factor G, el (1,3)-β-D-glucano no causará falsos positivos . A partir de 2018, la evidencia disponible muestra que la prueba rFC no es peor que la prueba LAL. ^[13]

La adopción de la prueba rFC fue lenta, lo que comenzó a cambiar en 2012 cuando la FDA de EE. UU. y el Ministerio de Salud europeo la reconocieron como una alternativa aceptada. Su falta de mención en las farmacopeas siguió siendo un problema, ya que no existía un buen estándar para ejecutar la prueba en producción. ^[13] En 2016, se agregó a la Farmacopea Europea . ^[5] Una patente sobre rFC también limitó la adopción hasta su vencimiento en 2018. ^[13]

El 1 de junio de 2020, la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) decidió cancelar la propuesta de incluir la tecnología recombinante para las pruebas de endotoxinas en el capítulo 85, Endotoxinas bacterianas , y comenzar el desarrollo de un capítulo separado que amplíe el uso, la validación y la comparabilidad de las pruebas de endotoxinas basadas en reactivos derivados de forma recombinante. La USP propuso un capítulo 1085.1 separado, que solo sirve como guía, aunque los comentarios y las opiniones publicados el 11 de diciembre de 2020 muestran que las compañías farmacéuticas y la FDA no apoyan este capítulo y solicitan el estatus de compendio. ^[14]

La prueba de activación de monocitos (MAT) es otro método propuesto para detectar endotoxinas basado en monocitos en sangre humana . Mide la liberación de citocinas de estos debido a la presencia de pirógenos , básicamente reflejando el proceso por el cual estas toxinas causan fiebre en humanos (y conejos, como en la prueba de pirógenos original). ^[15] Un protocolo para la prueba MAT, utilizando células cultivadas, se describe en la Farmacopea Europea. ^[16]

Un estudio reciente que empleó monocitos modificados genéticamente pudo mejorar significativamente la sensibilidad de los ensayos de detección basados ​​en monocitos al reducir el tiempo de finalización del ensayo de más de 20 horas a 2 o 3 horas. ^[17]

• Enzima de coagulación de Limulus
• Lipopolisacárido

• cangrejoherradura.org
• Actualización de LAL
• Producto de detección de endotoxinas
• Directriz de prueba LAL de la FDA de 1987
• Reactivos de prueba LAL