Microscopía de campo oscuro

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La microscopía de campo oscuro (también llamada microscopía de fondo oscuro ) describe métodos de microscopía , tanto de luz como de microscopía electrónica , que excluyen el haz no dispersado de la imagen. En consecuencia, el campo alrededor de la muestra (es decir, donde no hay ninguna muestra que disperse el haz) generalmente es oscuro.

En los microscopios ópticos se debe utilizar una lente condensadora de campo oscuro , que dirige un cono de luz lejos de la lente del objetivo. Para maximizar el poder de captación de luz dispersa de la lente del objetivo, se utiliza la inmersión en aceite y la apertura numérica (NA) de la lente del objetivo debe ser menor a 1.0. Se pueden utilizar lentes objetivos con una NA más alta, pero solo si tienen un diafragma ajustable, que reduce la NA. A menudo, estas lentes objetivos tienen una NA que varía de 0,7 a 1,25. ^[1]

En microscopía óptica , el campo oscuro describe una técnica de iluminación utilizada para mejorar el contraste en muestras no teñidas . Funciona iluminando la muestra con luz que no será captada por la lente del objetivo y, por lo tanto, no formará parte de la imagen. Esto produce la apariencia clásica de un fondo oscuro, casi negro, con objetos brillantes sobre él.

Los pasos se ilustran en la figura donde se utiliza un microscopio invertido .

1. La luz entra al microscopio para iluminar la muestra.
2. Un disco de tamaño especial, el tope de parche (ver figura), bloquea parte de la luz de la fuente de luz, dejando un anillo exterior de iluminación. También se puede sustituir razonablemente por un anillo de fase ancho con un aumento bajo.
3. La lente condensadora enfoca la luz hacia la muestra.
4. La luz entra en la muestra. La mayor parte se transmite directamente, mientras que una parte se dispersa desde la muestra.
5. La luz dispersa entra en la lente del objetivo, mientras que la luz transmitida directamente simplemente no llega a la lente y no es recolectada debido a un bloqueo de iluminación directa (ver figura).
6. Sólo la luz dispersa se utiliza para producir la imagen, mientras que se omite la luz transmitida directamente.

La microscopía de campo oscuro es una técnica muy sencilla pero eficaz y muy adecuada para su uso en muestras biológicas vivas y no teñidas , como un frotis de un cultivo de tejidos o de organismos unicelulares individuales transmitidos por el agua. Teniendo en cuenta la sencillez de la configuración, la calidad de las imágenes obtenidas con esta técnica es impresionante.

Una limitación de la microscopía de campo oscuro es el bajo nivel de luz que se observa en la imagen final. Esto significa que la muestra debe estar muy iluminada, lo que puede dañarla.

Las técnicas de microscopía de campo oscuro están casi totalmente libres de halos o artefactos de tipo relieve típicos de la microscopía de contraste de interferencia diferencial . Esto se produce a expensas de la sensibilidad a la información de fase.

La interpretación de las imágenes de campo oscuro debe realizarse con mucho cuidado, ya que las características oscuras comunes de las imágenes de microscopía de campo claro pueden ser invisibles, y viceversa. En general, la imagen de campo oscuro carece de las bajas frecuencias espaciales asociadas con la imagen de campo claro, lo que hace que la imagen sea una versión de paso alto de la estructura subyacente.

Aunque la imagen de campo oscuro puede parecer a primera vista un negativo de la imagen de campo claro, en cada una de ellas se aprecian diferentes efectos. En la microscopía de campo claro, las características son visibles cuando la luz incidente proyecta una sombra sobre la superficie o cuando una parte de la superficie es menos reflectante, posiblemente por la presencia de hoyos o rasguños. Las características elevadas que son demasiado suaves para proyectar sombras no aparecerán en las imágenes de campo claro, pero la luz que se refleja en los lados de la característica será visible en las imágenes de campo oscuro.

• Comparación de las técnicas de transiluminación utilizadas para generar contraste en una muestra de papel tisú (1,559 μm/píxel cuando se visualiza a resolución completa)
• 
  Iluminación de campo oscuro, el contraste de la muestra proviene de la luz dispersada por la muestra.
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  Iluminación de campo claro , el contraste de la muestra proviene de la atenuación de la luz en la muestra.
• 
  Iluminación con luz polarizada cruzada , el contraste de la muestra proviene de la rotación de la luz polarizada a través de la muestra.
• 
  Iluminación de contraste de fase , el contraste de la muestra proviene de la interferencia de diferentes longitudes de trayectoria de la luz a través de la muestra.

Recientemente se ha aplicado la microscopía de campo oscuro en los dispositivos señaladores del ratón de ordenador para permitir que el ratón trabaje sobre vidrio transparente captando imágenes microscópicas de defectos y polvo en la superficie del vidrio.

Cuando se combina con imágenes hiperespectrales , la microscopía de campo oscuro se convierte en una herramienta poderosa para la caracterización de nanomateriales incrustados en células. En una publicación reciente, Patskovsky et al. utilizaron esta técnica para estudiar la adhesión de nanopartículas de oro (AuNP) dirigidas a células cancerosas CD44 +. ^[2]

Los estudios de campo oscuro en microscopía electrónica de transmisión desempeñan un papel importante en el estudio de cristales y defectos cristalinos, así como en la obtención de imágenes de átomos individuales.

En pocas palabras, la obtención de imágenes ^[3] implica inclinar la iluminación incidente hasta que un haz difractado, en lugar del haz incidente, pase a través de una pequeña abertura del objetivo en el plano focal posterior del lente objetivo. Las imágenes de campo oscuro, en estas condiciones, permiten mapear la intensidad difractada proveniente de una única colección de planos de difracción en función de la posición proyectada sobre la muestra y en función de la inclinación de la muestra.

En muestras de monocristales, las imágenes de campo oscuro de reflexión única de una muestra inclinada justo fuera de la condición de Bragg permiten "iluminar" solo aquellos defectos de red, como dislocaciones o precipitados, que doblan un solo conjunto de planos de red en su vecindad. El análisis de intensidades en tales imágenes puede usarse entonces para estimar la cantidad de esa curvatura. En muestras policristalinas, por otro lado, las imágenes de campo oscuro sirven para iluminar solo ese subconjunto de cristales que reflejan Bragg en una orientación dada.

Animación: imágenes de campo oscuro de cristales

Esta animación ilustra el movimiento de una apertura (centrada en la figura naranja de la izquierda) a lo largo del espectro de potencia (un sustituto digital del patrón de difracción óptica del plano focal posterior) que se muestra con el pico de CC (o haz no dispersado) debajo del centro. Solo los nanocristales con periodicidades proyectadas que difractan en la apertura se iluminan en la imagen de campo oscuro de la derecha. La apertura se mueve en incrementos de 1,25° alrededor del anillo asociado con la difracción de los espaciamientos reticulares de oro de 2,3  Å (111).

La obtención de imágenes con haz débil implica una óptica similar a la del campo oscuro convencional, pero utiliza un armónico del haz difractado en lugar del haz difractado en sí. De esta manera, se puede obtener una resolución mucho mayor de las regiones deformadas alrededor de los defectos.

La obtención de imágenes de campo oscuro anular requiere la formación de imágenes con electrones difractados en una abertura anular centrada en el haz no dispersado, pero sin incluirlo. Para ángulos de dispersión grandes en un microscopio electrónico de transmisión de barrido , a esto a veces se lo denomina obtención de imágenes de contraste Z debido a la dispersión mejorada de los átomos de alto número atómico.

Se trata de una técnica matemática intermedia entre el espacio directo y el recíproco (transformada de Fourier) para explorar imágenes con periodicidades bien definidas, como las imágenes de franjas reticulares de un microscopio electrónico. Al igual que con la obtención de imágenes de campo oscuro analógicas en un microscopio electrónico de transmisión, permite "iluminar" aquellos objetos en el campo de visión donde residen las periodicidades de interés. A diferencia de la obtención de imágenes de campo oscuro analógicas, también puede permitir mapear la fase de Fourier de las periodicidades y, por lo tanto, los gradientes de fase, que proporcionan información cuantitativa sobre la deformación reticular del vector.

• Imágenes de campo oscuro anular
• Microscopía de campo de luz
• Ondículas

Wikimedia Commons tiene medios relacionados con Microscopía de campo oscuro .

• Nikon - Estereomicroscopía > Iluminación de campo oscuro
• Expresiones moleculares
• Imprimación para iluminación de campo oscuro
• Gage SH . 1920. Microscopía de campo oscuro moderna y la historia de su desarrollo. Transactions of the American Microscopical Society 39(2):95–141.
• Microscopios de campo oscuro y de contraste de fases (Université Paris Sud)