Animal libre de gérmenes

Los organismos libres de gérmenes son organismos multicelulares que no tienen microorganismos viviendo en ellos o sobre ellos. Dichos organismos se crían utilizando varios métodos para controlar su exposición a agentes virales , bacterianos o parasitarios . ^[1] Cuando se introduce una microbiota conocida en un organismo libre de gérmenes, generalmente se lo denomina organismo gnotobiótico , sin embargo, técnicamente hablando, los organismos libres de gérmenes también son gnotobióticos porque se conoce el estado de su comunidad microbiana . ^[2] Debido a la falta de un microbioma , muchos organismos libres de gérmenes presentan déficits de salud, como defectos en el sistema inmunológico y dificultades con la adquisición de energía. ^{[3] [4]} Por lo general, los organismos libres de gérmenes se utilizan en el estudio de un microbioma donde se requiere un control cuidadoso de los contaminantes externos. ^[5]

Los organismos libres de gérmenes se generan mediante distintos medios, pero una práctica común compartida por muchos de ellos es algún tipo de paso de esterilización seguido de aislamiento del entorno circundante para evitar la contaminación .  

Las aves de corral libres de gérmenes suelen pasar por varios pasos de esterilización mientras aún están en la etapa de vida del huevo. Esto puede implicar lavarlas con lejía o una solución antibiótica para esterilizar la superficie del huevo. Luego, los huevos se transfieren a una incubadora estéril donde se crían hasta la eclosión. Una vez que nacen, se les proporciona agua esterilizada y un alimento irradiado con rayos gamma. Esto evita la introducción de microbios extraños en sus tractos intestinales. Las incubadoras y los productos de desecho de los animales se controlan continuamente para detectar una posible contaminación. Por lo general, cuando se utilizan en experimentos, se introduce un microbioma conocido en los animales a los pocos días de edad. La contaminación aún se monitorea y controla después de este punto, pero se espera la presencia de microbios. ^{[6] [7] [8]}

Los ratones pasan por un proceso ligeramente diferente debido a la falta de una etapa de vida de huevo. Para crear un ratón libre de gérmenes, se crea un embrión a través de fertilización in vitro y luego se trasplanta a una madre libre de gérmenes. Si este método no está disponible, un ratón puede nacer a través de un parto por cesárea , pero esto conlleva un mayor riesgo de contaminación. Este proceso utiliza una madre no libre de gérmenes que se sacrifica y esteriliza antes del nacimiento de las crías. Después del parto por cesárea, las crías deben transferirse a una incubadora estéril con una madre libre de gérmenes para alimentarlas y crecer. ^{[9] [10]} Estos métodos solo son necesarios para la generación de una línea de ratones libres de gérmenes. Una vez que se genera una línea, toda la progenie estará libre de gérmenes a menos que esté contaminada. Esta progenie puede usarse luego para experimentación. Por lo general, para los experimentos, cada ratón se aloja por separado en un aislador estéril para evitar la contaminación cruzada entre ratones. A los ratones se les proporciona comida y agua esterilizadas para evitar la contaminación. Los métodos de esterilización pueden variar entre experimentos debido a las diferentes dietas o medicamentos a los que están expuestos los ratones. Los aisladores y los productos de desecho se controlan continuamente para detectar una posible contaminación y garantizar una esterilidad completa. Al igual que con las aves de corral, se puede introducir un microbioma conocido en los animales, pero se sigue controlando la contaminación. ^{[11] [12] [13]}

Los nematodos también pueden cultivarse libres de gérmenes. La descendencia libre de gérmenes del nematodo C. elegans , que se utiliza en la investigación, puede producirse rompiendo los gusanos adultos para liberar los huevos. El método estándar para esto es introducir una población de gusanos adultos en una solución de lejía. Esta solución de lejía rompe los gusanos adultos, descomponiéndolos mientras que simultáneamente libera y esteriliza la superficie de los huevos. Los huevos esterilizados se lavan y se transfieren a una placa de agar que contiene alimento para los gusanos. C. elegans consume bacterias, por lo que antes de que los huevos puedan transferirse a la placa, el alimento debe matarse ya sea por calor o irradiación. Este método para crear nematodos libres de gérmenes tiene el beneficio adicional de sincronizar la edad de los gusanos, de modo que todos tengan edades similares a medida que crecen. Por lo general, los gusanos deberán transferirse a una nueva placa a medida que consumen todo el alimento en la placa actual, y cada placa también debe haber sido tratada con calor o radiación. Las placas se pueden proteger de la contaminación externa cubriéndolas y aislándolas de posibles fuentes de contaminación. ^[14]

Las semillas se esterilizan superficialmente con productos químicos, como etanol o una solución antibiótica, para producir una planta libre de gérmenes. Luego, las semillas se cultivan en agua u otros medios hasta la germinación. Después de la germinación, las semillas se transfieren a tierra estéril o tierra con una microbiota específica para su uso en experimentos. Las semillas también se pueden transferir directamente a la tierra y dejar que germinen. Si las plantas se transfieren a tierra estéril, normalmente hay dos tipos de métodos de crecimiento. El primero es donde toda la planta se mantiene estéril y en el otro, solo el sistema de raíces se mantiene estéril. El método se elige en función de los requisitos del experimento. Las plantas se cultivan en aisladores que se revisan con frecuencia para detectar contaminación junto con la tierra en la que crecen las plantas. ^{[15] [16]}

Las moscas de la fruta, específicamente la especie Drosophila , han sido uno de los organismos modelo más utilizados . La especie Drosophila se ha utilizado principalmente en el campo de la genética . Hay dos métodos principales para producir moscas gnotobióticas o axénicas . Uno de ellos es recolectar los huevos y descorionarlos. Un corion es la membrana externa que rodea al embrión. En condiciones asépticas, los huevos se lavan dos veces durante 2,5 minutos cada vez, en una solución de hipoclorito de sodio al 0,6%. Luego se colocan con el recipiente de muestras en 90 ml de lejía. A continuación, se lavan tres veces en agua esterilizada. Los huevos descorionados se colocan luego en viales que contienen dieta estéril. ^[17]

El segundo método consiste en el uso de antibióticos . Los medios, como la dieta estándar de levadura y harina de maíz, se complementan con estreptomicina o una combinación de antibióticos. La concentración del antibiótico es de 400 μg/ml. Una vez que la dieta de levadura y harina de maíz se ha enfriado, se añaden 4 ml de solución que contiene 10 g de estreptomicina disueltos en 100 ml de etanol por litro de alimento. A continuación, los medios se vierten en viales y los huevos recién cosechados se transfieren a los viales. ^[18]

Debido a la falta de un microbioma saludable , muchos organismos libres de gérmenes presentan importantes déficits de salud. Los métodos utilizados para producir organismos libres de gérmenes también pueden tener efectos secundarios negativos en el organismo. Se observaron tasas de eclosión reducidas en huevos de gallina incubados con cloruro de mercurio , mientras que el tratamiento con ácido peracético no causó un efecto significativo en las tasas de eclosión. ^[8] Los pollos también exhibieron defectos en el crecimiento y la salud del intestino delgado. ^[6] Se ha demostrado que los ratones libres de gérmenes tienen defectos en su sistema inmunológico y en la absorción de energía debido a la falta de un microbioma saludable. ^{[3] [4]} También hay una fuerte evidencia de interacciones entre el microbioma del ratón y su desarrollo y salud cerebral . ^{[13] [19] [20]} Las plantas libres de gérmenes exhiben graves defectos de crecimiento debido a la falta de simbiontes que les proporcionen los nutrientes necesarios. ^{[16] [21]}

Los animales libres de gérmenes se utilizan rutinariamente para establecer la causalidad en los estudios del microbioma. ^{[22] [23]} Esto se hace comparando animales con un microbioma intestinal comensal estándar con uno libre de gérmenes, o colonizando un animal libre de gérmenes con un organismo de interés. La microbiota intestinal puede variar entre las instalaciones de investigación, lo que puede ser un factor de confusión en los experimentos y ser una causa de falta de reproducibilidad. ^[24] Se han desarrollado varios microbiomas de control que corrigen los principales defectos de salud que se presentan comúnmente en animales libres de gérmenes y pueden actuar como una comunidad de control reproducible. ^{[25] [26]} Se han utilizado animales libres de gérmenes para demostrar un papel causal del microbioma intestinal en diversos entornos, como el desarrollo neuronal , ^[27] la longevidad, ^[28] la inmunoterapia contra el cáncer, ^[29] y muchos otros contextos relacionados con la salud. ^[30]

• Cultivo axénico