Inmunoensayo

Inmunoensayo
Ilustración de los componentes básicos de un inmunoensayo, que incluye un analito (verde), un anticuerpo (negro) y una etiqueta detectable (amarilla)
Malla	D007118
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Un inmunoensayo ( IA ) es una prueba bioquímica que mide la presencia o concentración de una macromolécula o una molécula pequeña en una solución mediante el uso de un anticuerpo (generalmente) o un antígeno (a veces). La molécula detectada por el inmunoensayo a menudo se denomina " analito " y en muchos casos es una proteína , aunque puede ser otro tipo de moléculas, de diferentes tamaños y tipos, siempre que se desarrollen los anticuerpos adecuados que tengan las propiedades requeridas para el ensayo. Los analitos en líquidos biológicos como suero u orina se miden con frecuencia mediante inmunoensayos con fines médicos y de investigación. ^[1]

Los inmunoensayos se presentan en muchos formatos y variaciones diferentes. Los inmunoensayos se pueden realizar en varios pasos, en los que se añaden reactivos y se eliminan o separan en diferentes puntos del ensayo. Los ensayos de varios pasos suelen denominarse inmunoensayos de separación o inmunoensayos heterogéneos. Algunos inmunoensayos se pueden realizar simplemente mezclando los reactivos y las muestras y realizando una medición física. Dichos ensayos se denominan inmunoensayos homogéneos o, con menos frecuencia, inmunoensayos sin separación.

En los inmunoensayos se suele utilizar un calibrador. Los calibradores son soluciones que se sabe que contienen el analito en cuestión y, por lo general, se conoce la concentración de dicho analito. La comparación de la respuesta de un ensayo a una muestra real con la respuesta del ensayo producida por los calibradores permite interpretar la intensidad de la señal en términos de la presencia o concentración del analito en la muestra.

Los inmunoensayos se basan en la capacidad de un anticuerpo para reconocer y unirse a una macromolécula específica en lo que podría ser una mezcla compleja de macromoléculas. En inmunología, la macromolécula particular unida por un anticuerpo se denomina antígeno y la zona del antígeno a la que se une el anticuerpo se denomina epítopo .

En algunos casos, un inmunoensayo puede utilizar un antígeno para detectar la presencia de anticuerpos que reconocen ese antígeno en una solución. En otras palabras, en algunos inmunoensayos, el analito puede ser un anticuerpo en lugar de un antígeno.

Además de la unión de un anticuerpo a su antígeno, la otra característica clave de todos los inmunoensayos es un medio para producir una señal medible en respuesta a la unión. La mayoría de los inmunoensayos, aunque no todos, implican la unión química de anticuerpos o antígenos con algún tipo de etiqueta detectable. Existe una gran cantidad de etiquetas en los inmunoensayos modernos, y permiten la detección a través de diferentes medios. Muchas etiquetas son detectables porque emiten radiación, producen un cambio de color en una solución, fluorescen bajo la luz o pueden ser inducidas a emitir luz.

A Rosalyn Sussman Yalow y Solomon Berson se les atribuye el desarrollo de los primeros inmunoensayos en la década de 1950. Yalow aceptó el Premio Nobel por su trabajo en inmunoensayos en 1977, convirtiéndose en la segunda mujer estadounidense en ganar el premio. ^[2]

Los inmunoensayos se volvieron considerablemente más simples de realizar y más populares cuando se demostraron técnicas para unir químicamente enzimas a anticuerpos a fines de la década de 1960. ^[3]

En 1983, el profesor Anthony Campbell ^[4] de la Universidad de Cardiff sustituyó el yodo radiactivo utilizado en los inmunoensayos por un éster de acridinio que produce su propia luz: la quimioluminiscencia . Este tipo de inmunoensayo se utiliza actualmente en unos 100 millones de pruebas clínicas al año en todo el mundo, lo que permite a los médicos medir una amplia gama de proteínas, patógenos y otras moléculas en muestras de sangre. ^[5]

En 2012, la industria de inmunoensayos comerciales generó ganancias por 17.000.000.000 de dólares y se pensaba que tenía perspectivas de un crecimiento anual lento de entre el 2 y el 3 por ciento. ^[6]

Los inmunoensayos emplean una variedad de marcadores diferentes para permitir la detección de anticuerpos y antígenos. Los marcadores suelen estar químicamente unidos o conjugados con el anticuerpo o antígeno deseado.

Posiblemente una de las etiquetas más populares para usar en inmunoensayos es enzimas . Los inmunoensayos que emplean enzimas se conocen como inmunoensayos enzimáticos (EIA), de los cuales los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) y la técnica de inmunoensayo enzimático multiplicado (EMIT) son los tipos más comunes.

Las enzimas que se utilizan en las pruebas ELISA incluyen la peroxidasa de rábano picante (HRP), la fosfatasa alcalina (AP) o la glucosa oxidasa . Estas enzimas permiten la detección a menudo porque producen un cambio de color observable en presencia de ciertos reactivos. En algunos casos, estas enzimas se exponen a reactivos que hacen que produzcan luz o quimioluminiscencia. Existen varios tipos de ELISA: directa, indirecta, sándwich y competitiva. ^[7]

Se pueden incorporar isótopos radiactivos a los reactivos de inmunoensayo para producir un radioinmunoensayo (RIA). La radiactividad emitida por los complejos anticuerpo-antígeno unidos se puede detectar fácilmente utilizando métodos convencionales.

Los RIA fueron unos de los primeros inmunoensayos desarrollados, pero han caído en desuso en gran medida debido a la dificultad y los peligros potenciales que presenta trabajar con radiactividad. ^{[8] [9]}

Un enfoque más nuevo para los inmunoensayos implica la combinación de la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT qPCR) y las técnicas de inmunoensayo tradicionales. En estos ensayos, denominados PCR inmunocuantitativo en tiempo real (iqPCR), la etiqueta utilizada es una sonda de ADN . ^{[10] [11]}

Los reporteros fluorogénicos como la ficoeritrina se utilizan en varios inmunoensayos modernos. ^[12] Los microarrays de proteínas son un tipo de inmunoensayo que a menudo emplea reporteros fluorogénicos. ^[13]

Algunas etiquetas funcionan mediante electroquimioluminiscencia (ECL), en la que la etiqueta emite luz detectable en respuesta a la corriente eléctrica. ^{[14] [15]}

Si bien en los inmunoensayos se suele emplear algún tipo de etiqueta, existen determinados tipos de ensayos que no dependen de etiquetas, sino que emplean métodos de detección que no requieren la modificación o el etiquetado de los componentes del ensayo. La resonancia de plasmón de superficie es un ejemplo de técnica que puede detectar la unión entre un anticuerpo no marcado y antígenos. ^[16] Otro inmunoensayo sin etiquetas demostrado implica medir el cambio de resistencia en un electrodo a medida que los antígenos se unen a él. ^[17]

Los inmunoensayos se pueden realizar en distintos formatos. En general, un inmunoensayo se clasificará en una de varias categorías según cómo se realice. ^[18]

En un inmunoensayo competitivo y homogéneo, el analito no marcado de una muestra compite con el analito marcado para unirse a un anticuerpo. A continuación, se mide la cantidad de analito marcado no unido. En teoría, cuanto más analito hay en la muestra, más analito marcado se desplaza y luego se mide; por lo tanto, la cantidad de analito marcado no unido es proporcional a la cantidad de analito en la muestra.

• El inmunoensayo de polarización de fluorescencia (FPIA) mide la señal de polarización de fluorescencia después de la incubación, sin separar las etiquetas unidas y libres. Las moléculas de análogo de analito marcadas libres se añaden a la muestra y su movimiento browniano difiere cuando están unidas a un anticuerpo (Ab) grande en comparación con cuando están libres en solución. El analito compite por unirse al Ab y, si el analito marcado se une al Ab, se produce una señal. La intensidad de la señal es inversamente proporcional a la concentración del analito. ^[19]
• En la técnica de inmunoensayo multiplicado por enzimas (EMIT) , las moléculas de análogos de analito libres marcadas con una enzima (por ejemplo, la enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa) compiten con el analito que se está probando. La enzima activa reduce el NAD (sin señal) a NADH (que absorbe a 340 nm), por lo que la absorbancia se monitorea a 340 nm. Cuando el analito marcado se une al Ab, la enzima se vuelve inactiva y la etiqueta libre genera una señal. La intensidad de la señal es directamente proporcional a la concentración del analito. ^[19]
• El inmunoensayo de canalización de oxígeno luminiscente (LOCI) genera especies de oxígeno singlete en microperlas acopladas al analito, y cuando el analito se une a la respectiva molécula de Ab, acoplada a otro tipo de perla, el analito reacciona con el oxígeno singlete, generando señales de quimioluminiscencia proporcionales a la concentración del complejo analito-Ab. ^[19]
• En la interacción cinética de micropartículas en solución (KIMS) y el inmunoensayo de inhibición turbidimétrica potenciado por partículas (PETINIA) , los anticuerpos libres se unen a los conjugados de micropartículas de fármacos para formar agregados que se absorben en el rango visible en ausencia del analito. En presencia del analito, el anticuerpo se une al analito libre, lo que evita la agregación de micropartículas y provoca una reducción de la absorbancia. La señal es inversamente proporcional a la concentración del analito. ^[19]
• El inmunoensayo de donante de enzima clonada (CEDIA) implica la ingeniería genética de una enzima (por ejemplo, beta-galactosidasa) en dos fragmentos inactivos: un donante de enzima pequeño (ED) conjugado con el análogo del fármaco y un aceptor de enzima más grande (EA). Cuando los dos fragmentos se asocian, la enzima completa convierte un sustrato en un producto coloreado escindido. Si hay moléculas de analito del fármaco presentes, compiten con el fármaco marcado con ED en solución por los sitios de Ab limitados. El análogo del fármaco marcado con ED libre se unirá al EA, generando una señal colorimétrica directamente proporcional a la cantidad de analito. ^[19]

Al igual que en un inmunoensayo competitivo y homogéneo, el analito no marcado de una muestra compite con el analito marcado para unirse a un anticuerpo. En los ensayos heterogéneos, el analito marcado y no unido se separa o se elimina por lavado y se mide el analito marcado y unido restante.

Al mezclar una muestra con anticuerpos marcados, el analito seleccionado se une a los anticuerpos marcados. Los anticuerpos marcados no unidos se eliminan y se miden los anticuerpos marcados unidos. La intensidad de la señal es directamente proporcional a la cantidad de analito en la muestra.

El analito en la muestra desconocida se une al sitio del anticuerpo y luego el anticuerpo marcado se une al analito. Luego se mide la cantidad de anticuerpo marcado en el sitio. Será directamente proporcional a la concentración del analito porque el anticuerpo marcado no se unirá si el analito no está presente en la muestra desconocida. Este tipo de inmunoensayo también se conoce como ensayo sándwich, ya que el analito se coloca "en un sándwich" entre dos anticuerpos.

Una amplia gama de pruebas médicas son inmunoensayos, llamados inmunodiagnósticos en este contexto. Muchas pruebas de embarazo caseras son inmunoensayos, que detectan el marcador de embarazo gonadotropina coriónica humana . ^[20] Más específicamente, son pruebas cualitativas que detectan si hay hCG presente, utilizando una configuración de flujo lateral . ^[21] La prueba rápida de antígenos de COVID-19 también es una prueba cualitativa de flujo lateral. ^[22]

Otros inmunoensayos clínicos son cuantitativos; miden cantidades. Los inmunoensayos pueden medir los niveles de CK-MB para evaluar enfermedades cardíacas, insulina para evaluar hipoglucemia , antígeno prostático específico para detectar cáncer de próstata , y algunos también se utilizan para la detección y/o medición cuantitativa de algunos compuestos farmacéuticos (consulte la técnica de inmunoensayo de multiplicación enzimática para obtener más detalles). ^[23]

Las pruebas de drogas también comienzan con un inmunoensayo cualitativo rápido. ^[24]

Los inmunoensayos se utilizan en los laboratorios antidopaje deportivos para analizar las muestras de sangre de los atletas en busca de la hormona de crecimiento humana recombinante prohibida (rhGH, rGH, hGH, GH). ^[25]

El inmunoensayo fotoacústico mide las señales acústicas de baja frecuencia generadas por las nanopartículas metálicas . Iluminadas por una luz modulada en una longitud de onda de resonancia plasmónica, las nanopartículas generan una señal acústica fuerte, que se puede medir utilizando un micrófono. ^[26] El inmunoensayo fotoacústico se puede aplicar a las pruebas de flujo lateral, que utilizan nanopartículas coloidales. ^[27]

"Manual de inmunoensayo", 3.ª edición, David Wild, Ed., Elsevier, 2008

• Inmunoensayo en los encabezados de temas médicos (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU.
• Capítulos 5 y 6 del libro “Química bioanalítica” de Susan R. Mikkelsen