Glicosintasa

El término glicosintasa se refiere a una clase de proteínas que han sido diseñadas para catalizar la formación de un enlace glicosídico . Las glicosintasas se derivan de las enzimas glicosidasas , que catalizan la hidrólisis de los enlaces glicosídicos. ^[2] Tradicionalmente se formaban a partir de la retención de glicosidasa mediante la mutación del aminoácido nucleofílico del sitio activo (generalmente un aspartato o glutamato ) a un pequeño aminoácido no nucleofílico (generalmente alanina o glicina ). Los enfoques más modernos utilizan la evolución dirigida para detectar sustituciones de aminoácidos que mejoran la actividad de la glicosintasa. ^[3]

Dos descubrimientos llevaron al desarrollo de las enzimas glicosintasas. El primero fue que un cambio del nucleófilo del sitio activo de una glicosidasa de un carboxilato a otro aminoácido dio como resultado una proteína correctamente plegada que no tenía actividad hidrolasa . ^[4] El segundo descubrimiento fue que algunas enzimas glicosidasas podían catalizar la hidrólisis de fluoruros de glicosilo que tenían la configuración anomérica incorrecta . ^[5] Las enzimas experimentaron una reacción de transglicosidación para formar un disacárido , que luego fue un sustrato para la actividad hidrolasa.

La primera glicosintasa descrita fue un mutante de la β-glucosidasa/galactosidasa de Agrobacterium sp. en la que el nucleófilo glutamato 358 se mutó a una alanina mediante mutagénesis dirigida al sitio . ^[6] Cuando se incubó con fluoruros de α-glicosilo y un azúcar aceptor, se descubrió que catalizaba la reacción de transglicosidación sin ninguna hidrólisis. Esta glicosintasa se utilizó para sintetizar una serie de productos di- y trisacáridos con rendimientos entre el 64% y el 92%.

El mecanismo de una glicosintasa es similar a la reacción de hidrólisis de las glicosidasas de retención, excepto que no se forma ningún intermediario covalente enzimático. La mutación del nucleófilo del sitio activo a un aminoácido no nucleófilo impide la formación de un intermediario covalente. Se requiere un donante de glicosilo activado con un buen grupo saliente anomérico (a menudo un flúor). El grupo saliente es desplazado por un alcohol del azúcar aceptor con la ayuda del aminoácido base general del sitio activo de la enzima.

La primera glicosintasa fue una exoglucosidasa de retención que catalizó la formación de glucósidos de glucosa y galactosa unidos por enlaces β 1-4 . Desde entonces, las enzimas glicosintasa se han ampliado para incluir mutantes de endoglicosidasa ^[7] , así como mutantes de glicosidasa inversora ^[8] . Los sustratos de la glicosintasa incluyen glucosa, galactosa, manosa , xilosa y ácido glucurónico ^[9] . Los métodos modernos para preparar glicosintasa utilizan la evolución dirigida para introducir modificaciones que mejoran la función de las enzimas. Este proceso se hizo disponible debido al desarrollo de pantallas de alto rendimiento para la actividad de la glicosintasa.

Las glicosintasas han sido útiles para la preparación de oligosacáridos ; sin embargo, su uso adolece de ciertas limitaciones. En primer lugar, la glicosintasa solo se puede utilizar para sintetizar enlaces glicosídicos para los que existe una glicosidasa conocida. Esa glicosidasa también debe convertirse primero en una glicosintasa, lo que no siempre es posible. En segundo lugar, el producto de la reacción de la glicosintasa es a menudo un mejor sustrato para la glicosintasa que el material de partida, lo que da lugar a la formación de múltiples productos de longitudes variables. Por último, las glicosintasas son específicas para el azúcar donante, pero a menudo tienen una especificidad débil para el azúcar aceptor. Esto puede dar lugar a una regioselectividad diferente según el aceptor, lo que da lugar a productos con diferentes enlaces glicosídicos. Un ejemplo es la β-glucosintasa de Agrobacterium sp., que forma un β-1,4-glucósido con glucosa como aceptor, pero forma un β-1,3-glucósido con xilosa como aceptor.

• Glucosidasa
• Familia 1 de las glicósidos hidrolasas