Extravasación de leucocitos

En inmunología , la extravasación leucocitaria (también conocida comúnmente como cascada de adhesión leucocitaria o diapédesis , el paso de células a través de la pared intacta del vaso) es el movimiento de leucocitos (glóbulos blancos) fuera del sistema circulatorio ( extravasación ) y hacia el sitio del daño tisular o infección . Este proceso forma parte de la respuesta inmune innata , que implica el reclutamiento de leucocitos no específicos. Los monocitos también utilizan este proceso en ausencia de infección o daño tisular durante su desarrollo hasta convertirse en macrófagos .

La extravasación de leucocitos se produce principalmente en las vénulas poscapilares , donde las fuerzas de cizallamiento hemodinámicas se reducen al mínimo. Este proceso se puede entender en varios pasos: ^{[ cita requerida ]}

1. Quimioatracción
2. Adherencia por rodadura
3. Adherencia firme
4. Transmigración (endotelial)

Se ha demostrado que el reclutamiento de leucocitos se detiene cuando se suprime cualquiera de estos pasos.

Los glóbulos blancos (leucocitos) desempeñan la mayoría de sus funciones en los tejidos. Entre ellas se encuentran la fagocitosis de partículas extrañas, la producción de anticuerpos, la secreción de desencadenantes de la respuesta inflamatoria (histamina y heparina) y la neutralización de la histamina. En general, los leucocitos participan en la defensa de un organismo y lo protegen de las enfermedades promoviendo o inhibiendo las respuestas inflamatorias. Los leucocitos utilizan la sangre como medio de transporte para llegar a los tejidos del cuerpo. A continuación se presenta un breve resumen de cada uno de los cuatro pasos que actualmente se cree que intervienen en la extravasación de leucocitos:

Tras el reconocimiento y la activación por parte de los patógenos , los macrófagos residentes en el tejido afectado liberan citocinas como IL-1 , TNFα y quimiocinas . IL-1, TNFα y C5a ^[1] hacen que las células endoteliales de los vasos sanguíneos cercanos al sitio de la infección expresen moléculas de adhesión celular , incluidas las selectinas . Los leucocitos circulantes se localizan hacia el sitio de la lesión o infección debido a la presencia de quimiocinas. ^{[ cita requerida ]}

Como si fuera un velcro, los ligandos de carbohidratos de los leucocitos circulantes se unen a las moléculas de selectina de la pared interna del vaso, con una afinidad marginal . Esto hace que los leucocitos disminuyan su velocidad y comiencen a rodar por la superficie interna de la pared del vaso. Durante este movimiento de rodadura, se forman y se rompen enlaces transitorios entre las selectinas y sus ligandos .

Por ejemplo, el ligando de carbohidratos para la P-selectina, el ligando de la glucoproteína P-selectina-1 (PSGL-1), es expresado por diferentes tipos de leucocitos (glóbulos blancos). La unión del PSGL-1 en el leucocito a la P-selectina en la célula endotelial permite que el leucocito ruede a lo largo de la superficie endotelial. Esta interacción puede ajustarse mediante el patrón de glucosilación del PSGL-1, de modo que ciertas glucovariantes del PSGL-1 tendrán afinidades únicas para diferentes selectinas, lo que permite en algunos casos que las células migren a sitios específicos dentro del cuerpo (por ejemplo, la piel). ^[2]

Al mismo tiempo, las quimiocinas liberadas por los macrófagos activan los leucocitos rodantes y hacen que las moléculas de integrina de superficie pasen del estado predeterminado de baja afinidad a un estado de alta afinidad. Esto se logra mediante la activación yuxtacrina de las integrinas por las quimiocinas y los factores solubles liberados por las células endoteliales. En el estado activado, las integrinas se unen firmemente a los receptores complementarios expresados ​​en las células endoteliales, con alta afinidad. Esto provoca la inmovilización de los leucocitos, que varía en los vasos que contienen diferentes fuerzas de cizallamiento del flujo sanguíneo en curso. ^{[ cita requerida ]}

Los citoesqueletos de los leucocitos se reorganizan de tal manera que los leucocitos se extienden sobre las células endoteliales. De esta forma, los leucocitos extienden pseudópodos y pasan a través de los huecos entre las células endoteliales. Este paso de las células a través de la pared intacta del vaso se llama diapédesis . ^[3] Estos huecos pueden formarse a través de interacciones de los leucocitos con el endotelio, pero también de forma autónoma a través de la mecánica endotelial. ^[4] La transmigración del leucocito se produce cuando las proteínas PECAM , que se encuentran en las superficies del leucocito y de la célula endotelial, interactúan y tiran eficazmente de la célula a través del endotelio. Una vez atravesado el endotelio, el leucocito debe penetrar la membrana basal . El mecanismo de penetración es discutido, pero puede implicar la digestión proteolítica de la membrana, la fuerza mecánica o ambas. ^[5] El proceso completo de escape de los vasos sanguíneos se conoce como diapédesis . Una vez en el líquido intersticial , los leucocitos migran a lo largo de un gradiente quimiotáctico hacia el sitio de la lesión o infección.

Las fases de la extravasación leucocitaria representadas en el esquema son: aproximación, captura, rodamiento, activación, unión, fortalecimiento de la unión y propagación, deslizamiento intravascular, migración paracelular o migración transcelular.

Las selectinas se expresan poco después de la activación de las células endoteliales por parte de los macrófagos tisulares por citocinas. Las células endoteliales activadas expresan inicialmente moléculas de P-selectina, pero dentro de las dos horas posteriores a la activación se favorece la expresión de E-selectina. Las selectinas endoteliales se unen a los carbohidratos de las glucoproteínas transmembrana de los leucocitos , incluida la sialil-Lewis ^X.

• P-selectinas : la P-selectina se expresa en las células endoteliales activadas y las plaquetas . La síntesis de P-selectina puede ser inducida por la trombina , el leucotrieno B4,el fragmento de complemento C5a , la histamina , el TNFα o el LPS . Estas citocinas inducen la externalización de los cuerpos de Weibel-Palade en las células endoteliales, presentando P-selectinas preformadas en la superficie de la célula endotelial. Las P-selectinas se unen al PSGL-1 como ligando. ^[6]
• Selectinas E : la selectina E se expresa en las células endoteliales activadas. La síntesis de selectina E se produce poco después de la síntesis de selectina P, inducida por citocinas como IL-1 y TNFα. Las selectinas E se unen a PSGL-1 y ESL-1.
• L-selectinas : Las L-selectinas se expresan de forma constitutiva en algunos leucocitos y se sabe que se unen a GlyCAM-1 , MadCAM-1 y CD34 como ligandos.

La expresión suprimida de algunas selectinas da como resultado una respuesta inmunitaria más lenta. Si no se produce L-selectina, la respuesta inmunitaria puede ser diez veces más lenta, ya que las P-selectinas (que también pueden ser producidas por los leucocitos) se unen entre sí. Las P-selectinas pueden unirse entre sí con alta afinidad, pero se producen con menos frecuencia porque la densidad del sitio receptor es menor que con las moléculas más pequeñas de E-selectina. Esto aumenta la velocidad inicial de desplazamiento de los leucocitos, prolongando la fase de desplazamiento lento.

Las integrinas implicadas en la adhesión celular se expresan principalmente en los leucocitos. Las integrinas β2 de los leucocitos rodantes se unen a las moléculas de adhesión celular endotelial y detienen el movimiento celular.

• LFA-1 se encuentra en los leucocitos circulantes y se une a ICAM-1 e ICAM-2 en las células endoteliales.
• Mac-1 se encuentra en los leucocitos circulantes y se une a ICAM-1 en las células endoteliales.
• VLA-4 se encuentra en los leucocitos y las células endoteliales y facilita la quimiotaxis; también se une a VCAM-1.

La activación celular a través de quimiocinas extracelulares hace que las integrinas β2 preformadas se liberen de los depósitos celulares. Las moléculas de integrina migran a la superficie celular y se congregan en parches de alta avidez . Los dominios intracelulares de integrina se asocian con el citoesqueleto leucocitario, a través de la mediación con factores citosólicos como talina , α-actinina y vinculina . Esta asociación causa un cambio conformacional en la estructura terciaria de la integrina , lo que permite el acceso del ligando al sitio de unión. Los cationes divalentes (p. ej., Mg ²⁺ ) también son necesarios para la unión integrina-ligando.

Los ligandos de integrina ICAM-1 y VCAM-1 son activados por citocinas inflamatorias, mientras que ICAM-2 es expresado constitutivamente por algunas células endoteliales pero regulado negativamente por citocinas inflamatorias. ICAM-1 e ICAM-2 comparten dos dominios N-terminales homólogos ; ambos pueden unirse a LFA-1.

Durante la quimiotaxis, el movimiento celular se ve facilitado por la unión de las integrinas β1 a los componentes de la matriz extracelular : VLA-3, VLA-4 y VLA-5 a la fibronectina y VLA-2 y VLA-3 al colágeno y otros componentes de la matriz extracelular.

La extravasación está regulada por el entorno de citocinas de fondo producido por la respuesta inflamatoria y es independiente de antígenos celulares específicos . Las citocinas liberadas en la respuesta inmunitaria inicial inducen vasodilatación y reducen la carga eléctrica a lo largo de la superficie del vaso. El flujo sanguíneo se ralentiza, lo que facilita la unión intermolecular.

• IL-1 activa los linfocitos residentes y los endotelios vasculares
• El TNFα aumenta la permeabilidad vascular y activa los endotelios vasculares
• CXCL8 (IL-8) forma un gradiente quimiotáctico que dirige a los leucocitos hacia el sitio de la lesión/infección tisular ( CCL2 tiene una función similar a CXCL8, induciendo la extravasación de monocitos y el desarrollo en macrófagos); también activa las integrinas leucocitarias

En 1976, las imágenes SEM mostraron que había receptores de localización en las puntas de los leucocitos similares a microvellosidades que permitirían a los glóbulos blancos salir del vaso sanguíneo y entrar en el tejido. ^[7] Desde la década de 1990, se ha estudiado en profundidad la identidad de los ligandos implicados en la extravasación de leucocitos. Este tema finalmente se pudo estudiar a fondo en condiciones de esfuerzo cortante fisiológico utilizando una cámara de flujo típica. ^[8] Desde los primeros experimentos, se observó un fenómeno extraño. Se observó que las interacciones de unión entre los glóbulos blancos y las paredes de los vasos se volvían más fuertes bajo una fuerza mayor. Se descubrió que las selectinas (E-selectina, L-selectina y P-selectina) estaban implicadas en este fenómeno. El requisito del umbral de esfuerzo cortante parece contraintuitivo porque el aumento del esfuerzo cortante eleva la fuerza aplicada a los enlaces adhesivos y parecería que esto debería aumentar la capacidad de desalojo. Sin embargo, las células giran más lentamente y con mayor regularidad hasta que se alcanza un esfuerzo cortante óptimo donde la velocidad de giro es mínima. Este fenómeno paradójico no ha sido explicado satisfactoriamente a pesar del interés generalizado.

Una hipótesis inicialmente descartada que ha ido ganando interés es la hipótesis del enlace de captura, donde el aumento de la fuerza sobre la célula ralentiza las tasas de desprendimiento y alarga la vida útil del enlace y estabiliza el paso de rodadura de la extravasación de leucocitos. ^[9] La adhesión celular mejorada por el flujo es todavía un fenómeno inexplicable que podría resultar de un aumento dependiente del transporte en las tasas de adhesión o una disminución dependiente de la fuerza en las tasas de desprendimiento de los enlaces adhesivos. La L-selectina requiere un mínimo particular de cizallamiento para mantener el rodamiento de los leucocitos sobre el ligando-1 de la glucoproteína P-selectina (PSGL-1) y otros ligandos vasculares. Se ha planteado la hipótesis de que las fuerzas bajas disminuyen las tasas de desprendimiento de L-selectina-PSGL-1 (enlaces de captura), mientras que las fuerzas más altas aumentan las tasas de desprendimiento (enlaces deslizantes). Los experimentos han encontrado que una disminución dependiente de la fuerza en las tasas de desprendimiento dictaba el rodamiento mejorado por el flujo de las microesferas o neutrófilos portadores de L-selectina sobre PSGL-1. ^[5] Los enlaces de captura permiten que el aumento de la fuerza convierta las duraciones de vida cortas de los enlaces en duraciones de vida largas, lo que disminuye las velocidades de rodadura y aumenta la regularidad de los pasos de rodadura a medida que el esfuerzo cortante aumenta desde el umbral hasta un valor óptimo. A medida que aumenta el esfuerzo cortante, las transiciones a enlaces deslizantes acortan sus duraciones de vida de los enlaces y aumentan las velocidades de rodadura y disminuyen la regularidad de rodadura. Se plantea la hipótesis de que las alteraciones dependientes de la fuerza de las duraciones de vida de los enlaces gobiernan la adhesión celular dependiente de L-selectina por debajo y por encima del óptimo de esfuerzo cortante. Estos hallazgos establecen una función biológica para los enlaces de captura como un mecanismo para la adhesión celular mejorada por el flujo. ^[10] Si bien los leucocitos parecen experimentar un comportamiento de enlace de captura con el aumento del flujo que conduce a los pasos de anclaje y rodadura en la extravasación de leucocitos, la adhesión firme se logra a través de otro mecanismo, la activación de la integrina.

Otros ejemplos biológicos de un mecanismo de enlace de captura se observan en bacterias que se adhieren firmemente a las paredes del tracto urinario en respuesta a altas velocidades de fluido y grandes fuerzas de corte ejercidas sobre las células y bacterias con puntas adhesivas de fimbrias. ^{[9] [11]} Los mecanismos esquemáticos de cómo se propone que el aumento de la fuerza de corte causa interacciones de unión más fuertes entre las bacterias y las células objetivo muestran que el enlace de captura actúa de manera muy similar a una trampa de dedo china. Para un enlace de captura, la fuerza sobre la célula tira de la punta adhesiva de una fimbria para cerrarla más fuerte sobre su célula objetivo. A medida que aumenta la fuerza de las fuerzas, más fuerte es el enlace entre la fimbria y el receptor celular en la superficie de la célula objetivo. ^[11] Para un enlace críptico, la fuerza hace que la fimbria gire hacia la célula objetivo y tenga más sitios de unión capaces de unirse a los ligandos de la célula objetivo, principalmente moléculas de azúcar. Esto crea una interacción de enlace más fuerte entre las bacterias y la célula objetivo.

Las cámaras de flujo de placas paralelas se encuentran entre las cámaras de flujo más populares utilizadas para estudiar la interacción leucocito-endotelio in vitro. Se han utilizado para investigación desde finales de la década de 1980. ^[12] Aunque las cámaras de flujo han sido una herramienta importante para estudiar el rodamiento de leucocitos, existen varias limitaciones cuando se trata de estudiar las condiciones fisiológicas in vivo, ya que carecen de correspondencia con la geometría in vivo, incluida la relación escala/aspecto (microvasculatura frente a modelos de vasos grandes), las condiciones de flujo (por ejemplo, flujos convergentes frente a divergentes en bifurcaciones) y requieren grandes volúmenes de reactivos (~ ml) debido a su gran tamaño (altura > 250 μm y ancho > 1 mm). ^[13] Con el advenimiento de los dispositivos basados ​​en microfluidos, se han superado estas limitaciones. La CFD Research Corporation (CFDRC) produjo un nuevo modelo in vitro, llamado red microvascular sintética (SMN) SynVivo y lo desarrolló utilizando el proceso de litografía suave basado en polidimetilsiloxano (PDMS). El SMN puede recrear la vasculatura compleja in vivo, incluidas las características geométricas, las condiciones de flujo y los volúmenes de reactivos, proporcionando así un entorno biológicamente realista para estudiar el comportamiento de la extravasación celular, pero también para la administración y el descubrimiento de fármacos. ^{[14] [15]}

La deficiencia de adhesión leucocitaria (LAD) es una enfermedad genética asociada con un defecto en el proceso de extravasación leucocitaria, causado por una cadena β2 de integrina defectuosa (presente en LFA-1 y Mac-1). Esto afecta la capacidad de los leucocitos para detenerse y realizar diapédesis. Las personas con LAD sufren infecciones bacterianas recurrentes y problemas de cicatrización de heridas. La neutrofilia es un sello distintivo de la LAD.

En enfermedades generalizadas como la sepsis, la extravasación de leucocitos entra en una etapa descontrolada, en la que los neutrófilos blancos comienzan a destruir los tejidos del huésped a un ritmo sin precedentes, cobrándose la vida de unas 200.000 personas tan solo en los Estados Unidos. ^[16] La disfunción de los neutrófilos suele estar precedida por algún tipo de infección, que desencadena patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP). A medida que se intensifica la extravasación de leucocitos, los neutrófilos dañan más tejidos, que liberan radicales de oxígeno y proteasas. ^[16]

Estudios recientes con la red microvascular sintética (SMN) SynVivo permitieron estudiar terapias antiinflamatorias para tratar patologías causadas por disfunción de neutrófilos. La SMN permite el análisis exhaustivo de cada etapa de la extravasación leucocitaria, proporcionando así una metodología para cuantificar el efecto del fármaco en impedir la extravasación leucocitaria. Algunos de los hallazgos recientes demuestran el efecto de la hidrodinámica en las interacciones neutrófilo-endotelio. En otras palabras, la adhesión de los neutrófilos se ve fuertemente afectada por las fuerzas de cizallamiento, así como por las interacciones moleculares. Además, a medida que disminuye la velocidad de cizallamiento (por ejemplo, en las vénulas poscapilares), la inmovilización de los leucocitos se vuelve más fácil y, por lo tanto, más frecuente. Lo opuesto también es cierto; los vasos en los que las fuerzas de cizallamiento son altas dificultan la inmovilización de los leucocitos. Esto tiene grandes implicaciones en varias enfermedades, donde las interrupciones en el flujo sanguíneo afectan gravemente la respuesta del sistema inmunológico al impedir o acelerar la inmovilización de los leucocitos. Tener este conocimiento permite realizar mejores estudios del efecto de los fármacos sobre la extravasación de leucocitos. ^{[13] [16] [14]}

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