Espectroscopia Raman de resonancia
Técnica de espectroscopia Raman
Diagrama de niveles de energía que muestra dispersión y fluorescencia.
Diagrama de niveles de energía que muestra la relación entre Rayleigh, Raman y la dispersión Raman por resonancia y la fluorescencia.

La espectroscopia de resonancia Raman ( espectroscopia RR o RRS ) es una variante de la espectroscopia Raman en la que la energía del fotón incidente es cercana en energía a una transición electrónica de un compuesto o material bajo examen. [1] Esta similitud en energía ( resonancia ) conduce a una intensidad mucho mayor de la dispersión Raman de ciertos modos vibracionales, en comparación con la espectroscopia Raman ordinaria.

La espectroscopia Raman por resonancia tiene una sensibilidad mucho mayor que la espectroscopia Raman sin resonancia, lo que permite el análisis de compuestos con intensidades de dispersión Raman inherentemente débiles o en concentraciones muy bajas. [2] [3] También mejora selectivamente solo ciertas vibraciones moleculares (las del grupo químico que experimenta la transición electrónica), lo que simplifica los espectros. [3] Para moléculas grandes como las proteínas , esta selectividad ayuda a identificar modos vibracionales de partes específicas de la molécula o proteína , como la unidad hemo dentro de la mioglobina . [4] La espectroscopia Raman por resonancia se ha utilizado en la caracterización de compuestos y complejos inorgánicos, [5] proteínas, [6] [7] ácidos nucleicos, [8] pigmentos, [8] y en arqueología e historia del arte. [8]

Teoría

En la dispersión Raman, los fotones chocan con una muestra y se dispersan con una diferencia de energía: los fotones dispersos pueden ser más altos o más bajos en energía (tener una longitud de onda más corta o más larga ) que los fotones incidentes. Esta diferencia de energía es causada por la excitación de la muestra a un nivel de energía vibracional más alto o más bajo: si la muestra estaba inicialmente en un estado vibracional excitado, el fotón disperso puede ser más alto en energía que el fotón incidente ( dispersión Raman anti-Stokes ). De lo contrario, el fotón disperso tiene un módulo de energía más bajo que el fotón entrante ( dispersión Raman de Stokes ). Entre los dos fenómenos, el desplazamiento de Stokes y el desplazamiento anti-Stokes, el primero es el más probable que ocurra. Como consecuencia, la intensidad relativa de los espectros Raman adquiridos en modo Stokes es más intensa que la otra. Para la mayoría de los materiales, la dispersión Raman es extremadamente débil en comparación con la dispersión Rayleigh , en la que la luz se dispersa sin pérdida de energía. [9] Por lo tanto , la luz dispersada Raman, que contiene información sobre las transiciones vibracionales , es difícil de observar para muchas sustancias.

La espectroscopia Raman de resonancia aprovecha un aumento en la intensidad de la dispersión Raman cuando los fotones incidentes coinciden con la energía de una transición electrónica . Si la energía del fotón que golpea la muestra es igual o cercana a la de una transición electrónica en la muestra, ciertos modos vibracionales activos de Raman (aquellos que producen desplazamiento nuclear en la misma dirección que la transición electrónica [10] ) exhibirán una dispersión mucho mejorada, hasta 10 6 veces en comparación con el Raman sin resonancia. [3] Para los modos totalmente simétricos , esta mayor intensidad de dispersión resulta de la llamada dispersión de término A o de Franck-Condon , debido a las superposiciones de Franck-Condon no nulas entre los estados fundamental y excitado. Los modos no totalmente simétricos también pueden mejorarse mediante la dispersión de término B o de Herzberg-Teller, si la simetría del modo está contenida en el producto directo de las dos simetrías de estado electrónico. [11] La mejora de la resonancia es más evidente en el caso de las transiciones π-π* y menos evidente para las transiciones centradas en el metal (d–d) . [5] Al igual que la espectroscopia Raman ordinaria, la RRS observa transiciones vibracionales que producen un cambio distinto de cero en la polarizabilidad de la molécula o el material que se está estudiando.

La dispersión Raman por resonancia se diferencia de la fluorescencia en que se produce sin relajación vibracional durante la vida útil del estado electrónico excitado. Por lo tanto, presenta anchos de línea mucho más estrechos que la fluorescencia. [11] Sin embargo, la fluorescencia y la dispersión Raman por resonancia ocurren simultáneamente en muchos materiales, y la interferencia de la fluorescencia puede complicar la recopilación de espectros Raman por resonancia. [3]

Variantes

Por lo general, la espectroscopia Raman por resonancia se realiza de la misma manera que la espectroscopia Raman ordinaria, utilizando una única fuente de luz láser para excitar la muestra. La diferencia es la elección de la longitud de onda del láser, que debe seleccionarse para que coincida con la energía de una transición electrónica en la muestra. Por lo tanto, a menudo se utiliza un láser sintonizable para la espectroscopia Raman por resonancia, ya que se puede utilizar un único láser para generar muchas longitudes de onda de excitación posibles para que coincidan con diferentes muestras. [8] Al utilizar múltiples láseres, láseres pulsados ​​y/o ciertas técnicas de preparación de muestras, se puede realizar una gama de variantes más sofisticadas de RRS, que incluyen:

  • Espectroscopia Raman de resonancia resuelta en el tiempo : mediante el uso de láseres pulsados ​​con un retraso controlable entre pulsos, la espectroscopia Raman de resonancia se puede utilizar para monitorear los cambios en la muestra a lo largo del tiempo, después de un cambio fotoquímico inducido por láser o un aumento de temperatura. [12] Este método se ha utilizado para examinar la dinámica de los estados electrónicos excitados, [13] la unión de oxígeno u otros gases a proteínas que contienen hemo , [14] y la dinámica de las proteínas . [12] [15]
  • Espectroscopia hiper-Raman de resonancia : la excitación de la muestra se produce por absorción de dos fotones , en lugar de por absorción de un solo fotón. Esta disposición permite la excitación de modos que están prohibidos en la espectroscopia de resonancia Raman ordinaria, con aumento de la intensidad debido a la resonancia, y también simplifica la recolección de luz dispersa. Es especialmente útil para moléculas que son tanto polares como polarizables. [16]
  • Espectroscopia Raman de resonancia mejorada por superficie : un híbrido de RRS y dispersión Raman mejorada por superficie . La muestra se aplica a nanopartículas conductoras y se utiliza un láser que coincide con la resonancia plasmónica de superficie de las nanopartículas para la excitación. Si la longitud de onda del plasmón de superficie coincide con la de una transición electrónica en la muestra, la dispersión Raman se mejorará en gran medida en comparación con la RRS ordinaria. [17]
  • Microscopía Raman por resonancia : se utiliza un microscopio para enfocar el láser de excitación sobre un punto particular de la muestra y se recogen los espectros de muchos de esos puntos. La intensidad Raman en diferentes puntos se puede reunir entonces en una imagen microscópica de la muestra. Mediante la elección adecuada de la longitud de onda de excitación, se puede realizar un mapa microscópico de la distribución de solo un componente de interés. [18]

Aplicaciones

Ejemplo de espectros Raman resonantes y no resonantes
Espectros Raman de resonancia (arriba) y no resonancia (abajo) de MoS 2 sobre silicio. Nótese que la excitación a 633 nm, cerca de una transición electrónica, provoca la aparición de bandas que son demasiado débiles para ser visibles con la excitación a 532 nm. Figura cortesía de David Tuschel.[1]

Debido a su selectividad y sensibilidad, la espectroscopia Raman por resonancia se utiliza normalmente para estudiar vibraciones moleculares en compuestos que tendrían espectros Raman muy débiles y/o complejos en ausencia de mejora de resonancia. Al igual que la espectroscopia Raman ordinaria, la espectroscopia Raman por resonancia es compatible con muestras en agua, que tiene una intensidad de dispersión muy débil y poca contribución a los espectros. Sin embargo, la necesidad de un láser de excitación con una longitud de onda que coincida con la de una transición electrónica en el analito de interés limita en cierta medida la aplicabilidad del método. [8]

Pigmentos y colorantes

Los tintes y pigmentos, todos los cuales exhiben transiciones electrónicas en la parte visible del espectro electromagnético, estuvieron entre las primeras sustancias en ser estudiadas por espectroscopia de resonancia Raman. Los espectros de resonancia Raman de betacaroteno y licopeno en muestras de plantas intactas fueron reportados en 1970. [8] Desde entonces, el método ha sido utilizado para medir de forma no invasiva los niveles de estos nutrientes en la piel humana. [19] Los espectros de resonancia Raman de otros pigmentos de polieno, como el esferoideno y el retinal , han sido utilizados para identificar diferencias en la conformación del cromóforo en proteínas fotoactivas. [20] [21] La espectroscopia de resonancia Raman ha sido utilizada en arqueología para identificar tintes y pigmentos en artefactos culturales, y la capacidad de RRS para distinguir diferentes tintas y tintes modernos ha encontrado aplicación en la ciencia forense . [8]

Proteínas

Las proteínas han sido ampliamente examinadas mediante espectroscopia de resonancia Raman. Los cofactores unidos a proteínas que absorben en el rango de longitud de onda visible, como el hemo , las flavinas o los complejos de metales de transición , pueden examinarse mediante RRS con una superposición espectral mínima con el resto de la molécula. [7] [22] Este método se ha utilizado para examinar la unión de gases en hemoproteínas [23] y el ciclo catalítico de varias enzimas. [24] Utilizando la excitación con láser ultravioleta , es posible excitar selectivamente las cadenas laterales de aminoácidos aromáticos ( fenilalanina , tirosina y triptófano ) para deducir el entorno local y las interacciones de enlaces de hidrógeno por estos residuos. [25] Con la excitación ultravioleta de longitud de onda más corta ("profunda"), también es posible excitar los enlaces peptídicos de una proteína para examinar la estructura secundaria . Se ha examinado el plegamiento y la desnaturalización de proteínas utilizando espectroscopia Raman de resonancia UV profunda de la cadena principal del polipéptido, con longitudes de onda de excitación inferiores a 200 nm. [25]

Ácidos nucleicos y virus

La espectroscopia de resonancia Raman con excitación ultravioleta se puede utilizar para examinar la química, la estructura y las interacciones intermoleculares de los ácidos nucleicos , específicamente las bases. Las interacciones entre los ácidos nucleicos y los compuestos que se unen al ADN, como los fármacos, se pueden examinar excitando selectivamente las nucleobases o el propio fármaco. [8] Los espectros de resonancia Raman del ADN se pueden utilizar para identificar el ADN bacteriano en células vivas, y para cuantificar el ADN en diferentes condiciones de cultivo, e incluso para distinguir diferentes especies bacterianas. [8] Los virus también se han estudiado utilizando la espectroscopia de resonancia Raman UV; el método tiene la capacidad de interrogar por separado la estructura del ácido nucleico o los componentes de la proteína de la cápside del virus, a través de la elección de la longitud de onda de excitación adecuada. [26]

Nanomateriales

La espectroscopia Raman de resonancia también se ha utilizado para caracterizar la estructura y las propiedades fotofísicas de las nanopartículas . Utilizando láseres ajustados a las transiciones electrónicas visibles e infrarrojas cercanas de los nanotubos de carbono , es posible mejorar las bandas vibracionales sensibles a la estructura de los nanotubos. [8] También se ha demostrado que los nanocables de materiales semiconductores inorgánicos , incluidos el fosfuro de galio y el telururo de mercurio encapsulado en carbono, exhiben espectros Raman de resonancia con luz de excitación visible. [27] [28]

Véase también

Referencias

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Lectura adicional

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