Inmunoensayo de polarización de fluorescencia
Clase de prueba bioquímica in vitro
Diagrama tridimensional de la teoría de polarización/anisotropía de fluorescencia

El inmunoensayo de polarización de fluorescencia ( FPIA ) es una clase de prueba bioquímica in vitro utilizada para la detección rápida de anticuerpos o antígenos en una muestra. FPIA es un ensayo homogéneo competitivo , que consiste en un método simple de preparación y lectura, sin el requisito de pasos de separación o lavado.

La base del ensayo es la anisotropía de fluorescencia , también conocida como polarización de fluorescencia. Si una molécula fluorescente está estacionaria y expuesta a luz polarizada en un plano , se excitará y, en consecuencia, emitirá radiación de regreso al plano polarizado. Sin embargo, si la molécula fluorescente excitada está en movimiento (rotación o traslación) durante la vida útil de la fluorescencia, emitirá luz en una dirección diferente a la del plano de excitación. La vida útil de la fluorescencia es la cantidad de tiempo entre el momento de absorción y el momento de emisión de la fluorescencia.

Por lo general, la velocidad a la que gira una molécula es indicativa de su tamaño. [1] Cuando una molécula marcada con fluorescencia (trazador) se une a otra molécula, el movimiento de rotación cambiará, lo que dará como resultado una intensidad alterada de la luz polarizada en el plano, lo que da como resultado una polarización de la fluorescencia alterada. [2] Los inmunoensayos de polarización de fluorescencia emplean un antígeno unido a un fluoróforo que, cuando se une al anticuerpo de interés, aumentará la polarización de la fluorescencia. El cambio en la polarización es proporcional a la cantidad de antígeno en la muestra y se mide mediante un analizador de polarización de fluorescencia. [3]

Historia

La polarización de la fluorescencia fue observada por primera vez por F. Weigert en 1920. Experimentó con soluciones de fluoresceína, eosina y otros colorantes a distintas temperaturas y viscosidades. Al observar que la polarización aumentaba con la viscosidad del disolvente y el tamaño de la molécula del colorante, pero disminuía con el aumento de la temperatura, dedujo que la polarización aumentaba con la disminución de la movilidad de las especies emisoras. [2] Entre 1925 y 1926, Francis Perrin detalló una teoría cuantitativa de la polarización de la fluorescencia en múltiples publicaciones importantes que siguen siendo relevantes hasta el día de hoy. [2]

Desde la contribución de Perrin, la técnica ha evolucionado desde la determinación de isotermas de unión bajo parámetros muy controlados hasta el estudio de interacciones de unión antígeno - anticuerpo , molécula pequeña - proteína y hormona - receptor . [4] Un inmunoensayo de polarización de fluorescencia se describió y utilizó por primera vez en la década de 1960. [5] [6] La característica homogénea competitiva permitió que el inmunoensayo de polarización de fluorescencia se automatizara mucho más fácilmente que otras técnicas de inmunoensayo como los radioinmunoensayos o los inmunoensayos ligados a enzimas . [4]

A pesar de haberse originado como un método para estudios de interacción directa, la técnica ha sido adoptada por el cribado de alto rendimiento (HTS) desde mediados de la década de 1990 para ayudar a facilitar el proceso de descubrimiento de fármacos mediante el estudio de interacciones enzimáticas complejas . [4]

Inmunoensayo homogéneo competitivo

Principio

La FPIA cuantifica el cambio en la polarización de fluorescencia de mezclas de reacción de trazador marcado con fluorescencia, antígeno de muestra y anticuerpo definido . Operar bajo temperatura y viscosidad fijas permite que la polarización de fluorescencia sea directamente proporcional al tamaño del fluoróforo. El trazador libre en solución tiene una polarización de fluorescencia menor que el trazador unido al anticuerpo con un movimiento browniano más lento. El trazador y el antígeno específico competirán para unirse al anticuerpo y si el antígeno está en baja concentración, más trazador se unirá al anticuerpo, lo que dará como resultado una mayor polarización de fluorescencia y viceversa. [7]

Una FPIA convencional sigue el procedimiento que se indica a continuación:

  1. Se añade una cantidad específica de muestra al tampón de reacción.
  2. Se deja que la solución se equilibre a temperatura ambiente durante aproximadamente dos minutos.
  3. La solución se evalúa en un analizador de polarización de fluorescencia para obtener una medición de referencia.
  4. Se añade a la solución una cantidad específica de antígeno conjugado con fluoróforo.
  5. La solución se equilibra nuevamente durante aproximadamente dos minutos.
  6. La solución se evalúa nuevamente mediante el analizador de polarización de fluorescencia.
  7. El valor de polarización de fluorescencia de la solución que contiene el trazador se compara con la línea base y la magnitud de la diferencia es proporcional a la cantidad de analito objetivo en la muestra. [1]

Aplicaciones

La FPIA ha surgido como una técnica viable para la cuantificación de pequeñas moléculas en mezclas, incluyendo: pesticidas , [8] micotoxinas [9] en alimentos, compuestos farmacéuticos en aguas residuales, [10] metabolitos en orina y suero indicativos del uso de drogas ( cannabinoides , anfetaminas , barbitúricos , cocaína , benzodiazepinas , metadona , opiáceos y PCP ), [11] [12] y varias toxinas de moléculas pequeñas . Así como con el análisis de interacciones hormona - receptor . [4]

Véase también

Referencias

  1. ^ ab Nielsen K, Lin M, Gall D, Jolley M (septiembre de 2000). "Inmunoensayo de polarización de fluorescencia: detección de anticuerpos contra Brucella abortus". Métodos . 22 (1): 71–6. doi :10.1006/meth.2000.1038. PMID  11020320.
  2. ^ abc Jameson D (2003). "Polarización de fluorescencia: pasado, presente y futuro". Química combinatoria y cribado de alto rendimiento . 6 (3): 167–176. doi :10.2174/138620703106298347. PMID  12678695 – vía ResearchGate.
  3. ^ Popelka S (1981). "Inmunoensayo de polarización de fluorescencia II. Analizador para medición rápida y precisa de polarización de fluorescencia con uso de cubetas desechables". Clin Chem . 27 (7): 1198–1201. doi : 10.1093/clinchem/27.7.1198 . PMID  7016373.
  4. ^ abcd Lea WA, Simeonov A (enero de 2011). "Ensayos de polarización de fluorescencia en el cribado de moléculas pequeñas". Opinión de expertos sobre el descubrimiento de fármacos . 6 (1): 17–32. doi :10.1517/17460441.2011.537322. PMC 3277431 . PMID  22328899. 
  5. ^ Watanabe F (1988). Teoría y aplicación del inmunoensayo de polarización de fluorescencia . Nueva York: Plenum Press. págs. 199-200.
  6. ^ Nasir M (1999). "Polarización de fluorescencia: una herramienta analítica para el inmunoensayo y el descubrimiento de fármacos". Química combinatoria y cribado de alto rendimiento . 2 (4): 177–190. doi :10.2174/1386207302666220204192916. PMID  10469879. S2CID  20003324 – vía ResearchGate.
  7. ^ Smith DS, Eremin SA (julio de 2008). "Inmunoensayos de polarización de fluorescencia y métodos relacionados para el cribado simple y de alto rendimiento de moléculas pequeñas". Química analítica y bioanalítica . 391 (5): 1499–507. doi :10.1007/s00216-008-1897-z. PMID  18264817. S2CID  24167641.
  8. ^ Eremin SA, Smith DS (mayo de 2003). "Inmunoensayos de polarización de fluorescencia para pesticidas". Química combinatoria y cribado de alto rendimiento . 6 (3): 257–66. doi :10.2174/138620703106298301. PMID  12678704.
  9. ^ Maragos C (diciembre de 2009). "Inmunoensayo de polarización de fluorescencia de micotoxinas: una revisión". Toxins . 1 (2): 196–207. doi : 10.3390/toxins1020196 . PMC 3202780 . PMID  22069541. 
  10. ^ Oberleitner L, Dahmen-Levison U, Garbe LA, Schneider RJ (mayo de 2017). "Aplicación del inmunoensayo de polarización de fluorescencia para la determinación de carbamazepina en aguas residuales". Journal of Environmental Management . 193 : 92–97. doi :10.1016/j.jenvman.2017.01.063. PMID  28192740.
  11. ^ Ramey KL, Kovacs SJ, Martin DE, Jorkasky DK (mayo de 1998). "Resultados de la detección de drogas en orina de voluntarios en estudios de farmacología clínica de fase I: ¿nos están engañando?". Journal of Clinical Pharmacology . 38 (5): 413–6. doi :10.1002/j.1552-4604.1998.tb04445.x. PMID  9602952. S2CID  21496845.
  12. ^ Edmonds D (12 de diciembre de 2000). «Método de diagnóstico de inmunoensayo de polarización de fluorescencia US 6159750A». Google Patents . Consultado el 6 de abril de 2017 .
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