Etiqueta de afinidad

Los marcadores de afinidad son una clase de inhibidores de enzimas que se unen covalentemente a su objetivo y provocan su inactivación. El sello distintivo de un marcador de afinidad es el uso de una porción de orientación para administrar de manera específica y reversible un grupo débilmente reactivo a la enzima que se une de manera irreversible a un residuo de aminoácido. La porción de orientación del marcador a menudo se asemeja al sustrato natural de la enzima, de modo que se utiliza un modo similar de unión no covalente antes del enlace covalente. ^{[1] [2]} Su utilidad en medicina puede verse limitada por la especificidad del primer paso de unión no covalente, mientras que la acción indiscriminada se puede utilizar para fines como el etiquetado de afinidad , una técnica para la validación de la unión específica del sustrato de los compuestos. ^[1]

Estas etiquetas no se limitan a las enzimas, sino que también pueden estar diseñadas para reaccionar con anticuerpos o ribozimas , aunque este uso es menos común. Aunque las proteínas como la hemoglobina no tienen un sitio activo, los bolsillos de unión pueden aprovecharse por su afinidad y, por lo tanto, pueden etiquetarse.

Las etiquetas de afinidad se pueden dividir en tres categorías distintas según sus grupos reactivos y su modo de administración. ^[3]

Esta categoría abarca el enfoque más simple de acoplar un electrófilo con baja reactividad intrínseca a una fracción de unión no covalente que frecuentemente imita al sustrato natural. La clave de esta designación es que la enzima no altera la reactividad del electrófilo y que la fracción de unión no covalente sirve para aumentar la presencia y la vida útil del electrófilo en el sitio activo ( molaridad efectiva ). El grupo débilmente reactivo puede reaccionar con grupos funcionales fuera del sitio activo o en otras proteínas, pero la selectividad la confiere la fracción de unión no covalente. Las firmas cinéticas de este tipo de inhibidor se pueden encontrar en saturación debido a que la reacción covalente (kinact) se convierte en el paso limitante de la velocidad a altas concentraciones de inhibidor. Un puñado de medicamentos como afatinib han obtenido la aprobación de la FDA a través de este enfoque. También se ha estudiado el enfoque inverso de usar un inhibidor débilmente nucleofílico para atacar a un electrófilo unido a proteínas. Este enfoque ha recibido mucha menos atención debido a la falta de electrófilos proteicos y solo se pueden utilizar aquellos con cofactores adecuados. ^{[1] [3]}

Las etiquetas de afinidad quiescentes representan un enfoque prometedor para inhibir enzimas utilizando funcionalidades reactivas "enmascaradas" que solo se descubren dentro del sitio activo. Este enfoque difiere de los inactivadores basados ​​en mecanismos en que la catálisis debe ser "fuera de la vía". Uno de los mejores ejemplos para explicar esta forma de catálisis es la inactivación de la dimetilargina dimetilaminohidrolasa (DDAH) por 4-halopiridinas. A pH fisiológico, el grupo 4-halo tiene una reactividad casi insignificante con los tiolatos, pero tras la protonación del nitrógeno, la reactividad aumenta aproximadamente 4500 veces. Esta protonación se produce fuera de la vía por un residuo de aspartato que normalmente no participa en la catálisis. Tras el ataque de la cisteína del sitio activo y la pérdida del haluro, la enzima se modifica irreversiblemente. Este requisito de la catálisis ajusta la selectividad de la modificación. ^[3] Esta clase no se limita a las halopiridinas y se han utilizado grupos funcionales que incluyen epóxidos y peptidil aciloximetil cetonas. La firma cinética de esta clase se asemeja a la de las etiquetas de afinidad clásicas. Este término se ha utilizado anteriormente para describir las etiquetas de afinidad que contienen grupos débilmente reactivos, pero la literatura reciente ha comenzado a abordar el requisito de la catálisis fuera de la vía. ^[4]

Las etiquetas de fotoafinidad se caracterizan por una reactividad no enzimática producida por la exposición a la luz y una fracción de orientación no covalente para mejorar la molaridad efectiva de este grupo reactivo en el sitio activo. Si bien esta técnica parece sólida en teoría, con frecuencia se observa un bajo grado de etiquetado debido principalmente a la extinción de las especies reactivas por el solvente u otras especies en solución. Sin embargo, esta extinción puede ser ventajosa ya que es un proceso tan rápido que una vez que se forma la especie reactiva, no se difundirá en un grado apreciable y solo reaccionará con moléculas a las que está inmediatamente adyacente.

Los marcadores de fotoafinidad no son muy prometedores para la inhibición o el uso de fármacos, pero son adecuados para identificar los sitios de unión de ligandos. Los grupos reactivos como los nitrenos o los 2-aril-5-carboxitetrazoles se emplean a menudo para generar carbenos altamente reactivos y no selectivos o intermediarios de nitrilo-imina moderadamente selectivos, respectivamente. ^{[2] [3]}

Al caracterizar una enzima, es esencial identificar los residuos de aminoácidos responsables de la catálisis. Si bien es cierto que la cristalografía de rayos X proporcionará información tridimensional más detallada sobre el sitio activo, solo se obtiene una imagen estática y pueden surgir dificultades con la cocristalización del sustrato o de los imitadores debido al recambio enzimático.

El ejemplo clásico del uso de marcadores de afinidad para este propósito es el mapeo de la topografía del sitio activo de la quimotripsina. Mediante el uso de tres marcadores de afinidad diferentes que colocaban grupos reactivos (halometilcetonas o fosfofluoruros) en diferentes regiones del núcleo del sustrato natural, se pudieron determinar las posiciones relativas y la identidad de tres aminoácidos diferentes. ^[1] Otro ejemplo notable del uso del etiquetado de afinidad para determinar el sitio activo de una enzima es el trabajo realizado por Grachev et al., que dio como resultado la caracterización de la subunidad β de la ARN polimerasa central como la subunidad responsable de la formación de enlaces fosfodiéster en el proceso de transcripción procariota. ^[5]

La unidad básica de la proteómica basada en la actividad es la sonda, que normalmente consta de dos elementos: un grupo reactivo (RG, a veces llamado "cabeza nuclear") y una etiqueta. Además, algunas sondas pueden contener un grupo de unión que mejora la selectividad. El grupo reactivo normalmente contiene un electrófilo especialmente diseñado que se une covalentemente a un residuo nucleofílico en el sitio activo de una enzima activa. Una enzima que se inhibe o modifica postraduccionalmente no reaccionará con una sonda basada en la actividad. La etiqueta puede ser un reportero como un fluoróforo o una etiqueta de afinidad como la biotina o un alquino o azida para su uso con la cicloadición 1,3-dipolar de Huisgen (también conocida como química de clic).

• Inhibición del suicidio