Ensayo de cometas

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El ensayo de electroforesis en gel de células individuales ( SCGE , también conocido como ensayo cometa ) es una técnica sencilla y sensible para la detección de daños en el ADN a nivel de la célula eucariota individual . Fue desarrollado por primera vez por Östling & Johansson en 1984 y posteriormente modificado por Singh et al. en 1988. ^[1] Desde entonces ha aumentado su popularidad como técnica estándar para la evaluación de daños/reparación del ADN, biomonitoreo y pruebas de genotoxicidad. Implica la encapsulación de células en una suspensión de agarosa de bajo punto de fusión, la lisis de las células en condiciones neutras o alcalinas (pH>13) y la electroforesis de las células lisadas suspendidas. El término "cometa" se refiere al patrón de migración del ADN a través del gel de electroforesis, que a menudo se asemeja a un cometa. ^{[2] [3]}

El ensayo del cometa (electroforesis en gel de una sola célula) es un método simple para medir las roturas de cadenas de ácido desoxirribonucleico (ADN) en células eucariotas. Las células embebidas en agarosa en un portaobjetos de microscopio se lisan con detergente y alto contenido de sal para formar nucleoides que contienen bucles superenrollados de ADN unidos a la matriz nuclear. La electroforesis a pH alto da como resultado estructuras que se asemejan a los cometas, observadas mediante microscopía de fluorescencia; la intensidad de la cola del cometa en relación con la cabeza refleja el número de roturas de ADN. La base probable para esto es que los bucles que contienen una rotura pierden su superenrollamiento y quedan libres para extenderse hacia el ánodo. A esto le sigue un análisis visual con tinción del ADN y cálculo de la fluorescencia para determinar el grado de daño del ADN. Esto se puede realizar mediante puntuación manual o automáticamente mediante un software de imágenes. ^{[4] [5]}

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Una muestra de células, ya sea derivada de un cultivo celular in vitro o de un sujeto de prueba in vivo , se dispersa en células individuales y se suspende en agarosa fundida de bajo punto de fusión a 37 °C. Esta monosuspensión se vierte sobre un portaobjetos de microscopio . Se sostiene un cubreobjetos de vidrio en ángulo y se aplica la monosuspensión en el punto de contacto entre el cubreobjetos y el portaobjetos. A medida que se baja el cubreobjetos sobre el portaobjetos, la agarosa fundida se extiende para formar una capa fina. La agarosa se gelifica a 4 °C y se retira el cubreobjetos.

La agarosa forma una matriz de fibras de carbohidratos que encapsulan las células y las fijan en su lugar. La agarosa se considera neutra desde el punto de vista osmótico , por lo que las soluciones pueden penetrar el gel y afectar a las células sin que estas cambien de posición.

En un estudio in vitro , las células se expondrían a un agente de prueba (normalmente luz ultravioleta , radiación ionizante o una sustancia química genotóxica ) para inducir daños en el ADN de las células encapsuladas. Para la calibración , se suele utilizar peróxido de hidrógeno para proporcionar un nivel estandarizado de daño en el ADN.

A continuación, los portaobjetos se sumergen en una solución que provoca la lisis de las células . La solución de lisis que se suele utilizar en el ensayo cometa consiste en una sal acuosa muy concentrada (a menudo, se puede utilizar sal de mesa común) y un detergente (como Triton X-100 o sarcosinato ). El pH de la solución de lisis se puede ajustar (normalmente entre pH neutro y alcalino ) según el tipo de daño que esté investigando el investigador.

La sal acuosa altera las proteínas y sus patrones de unión dentro de la célula, así como el contenido de ARN de la célula. El detergente disuelve las membranas celulares . A través de la acción de la solución de lisis, las células son destruidas. Todas las proteínas, el ARN, las membranas y los componentes citoplasmáticos y nucleoplásmicos son alterados y difundidos en la matriz de agarosa. Solo queda el ADN de la célula, y se desenreda para llenar la cavidad en la agarosa que anteriormente llenaba toda la célula. Esta estructura se llama nucleoide (un término general para una estructura en la que se concentra el ADN).

Después de la lisis de las células (normalmente de 1 a 2 horas a 4 °C), los portaobjetos se lavan con agua destilada para eliminar todas las sales y se sumergen en una segunda solución: una solución de electroforesis . Una vez más, se puede ajustar el pH de esta solución en función del tipo de daño que se esté investigando.

Los portaobjetos se dejan durante unos 20 minutos en la solución de electroforesis antes de aplicarles un campo eléctrico . En condiciones alcalinas, la doble hélice del ADN se desnaturaliza y el nucleoide se convierte en monocatenario.

Se aplica un campo eléctrico (normalmente 1 V / cm ) durante unos 20 minutos. A continuación, los portaobjetos se neutralizan a pH 7, se tiñen con un colorante fluorescente específico para el ADN y se analizan utilizando un microscopio con un CCD ( dispositivo acoplado a carga , en esencia, una cámara digital ) conectado a una computadora con un software de análisis de imágenes .

El concepto subyacente al ensayo SCGE es que el ADN intacto conserva una asociación altamente organizada con las proteínas de la matriz en el núcleo. Cuando se daña, esta organización se altera. Las hebras individuales de ADN pierden su estructura compacta y se relajan, expandiéndose fuera de la cavidad hacia la agarosa. Cuando se aplica el campo eléctrico, el ADN, que tiene una carga negativa general, es atraído hacia el ánodo cargado positivamente. Las hebras de ADN intactas son demasiado grandes y no salen de la cavidad, mientras que cuanto más pequeños sean los fragmentos, más libertad tendrán para moverse en un período de tiempo determinado. Por lo tanto, la cantidad de ADN que sale de la cavidad es una medida de la cantidad de daño del ADN en la célula.

El análisis de la imagen mide la intensidad general de la fluorescencia de todo el nucleoide y la fluorescencia del ADN migrado y compara las dos señales. Cuanto más fuerte es la señal del ADN migrado, mayor es el daño presente. La estructura general se asemeja a un cometa (de ahí el término "ensayo de cometa") con una cabeza circular que corresponde al ADN intacto que permanece en la cavidad y una cola de ADN dañado. Cuanto más brillante y larga sea la cola, mayor es el nivel de daño.

El ensayo del cometa es una técnica versátil para detectar daños y, con ajustes al protocolo, se puede utilizar para cuantificar la presencia de una amplia variedad de lesiones que alteran el ADN (daño). Los daños que se detectan habitualmente son roturas de cadena simple y de cadena doble. A veces se afirma ^{[6] [7]} que se necesitan condiciones alcalinas y una desnaturalización completa del ADN para detectar roturas de cadena simple. Sin embargo, esto no es cierto, ya que tanto las roturas de cadena simple como de cadena doble también se detectan en condiciones neutras. ^{[8] [9] [10] [11]} Sin embargo, en condiciones alcalinas, se detectan estructuras de ADN adicionales como daño del ADN: sitios AP (sitios abásicos que carecen de un nucleótido de pirimidina o purina ) y sitios donde se está llevando a cabo la reparación por escisión . ^{[12] [13]}

El ensayo cometa es un ensayo de daño del ADN extremadamente sensible. Esta sensibilidad debe manejarse con cuidado ya que también es vulnerable a cambios físicos que pueden afectar la reproducibilidad de los resultados. Básicamente, se debe evitar cualquier cosa que pueda causar daño o desnaturalización del ADN, excepto el factor o factores que se están investigando. ^[14] La forma más común del ensayo es la versión alcalina, aunque todavía no hay un protocolo de ensayo alcalino definitivo. Debido a su configuración simple y económica, se puede utilizar en condiciones en las que no hay ensayos más complejos disponibles.

Estos incluyen pruebas de genotoxicidad, biomonitoreo humano y epidemiología molecular, ecogenotoxicología, así como investigación fundamental en daño y reparación del ADN. ^[15] Por ejemplo, Swain y Rao, utilizando el ensayo del cometa ^[16] informaron aumentos marcados en varios tipos de daños al ADN en neuronas y astrocitos del cerebro de ratas durante el envejecimiento , incluidas roturas de cadena simple, roturas de cadena doble y bases modificadas (8-OHdG y uracilo).

Un ensayo cometa puede determinar el grado de fragmentación del ADN en los espermatozoides. El grado de fragmentación del ADN se ha asociado con los resultados de la fertilización in vitro . ^{[17] [18]}

El cometa ha sido modificado para su uso con células espermáticas como herramienta para el diagnóstico de la infertilidad masculina ^{[19] [20] [21]}

Para descomponer estas proteínas de protamina fuertemente unidas con el fin de utilizar el cometa para el esperma, se requieren pasos adicionales en el protocolo de descondensación. ^[20]

• Dhawan y Anderson (2009): El ensayo del cometa en toxicología. doi :10.1039/9781847559746
• Avishai, Nanthawan; Rabinowitz, Claudette; Moiseeva, Elisabeth; Rinkevich, Baruch (2002). "Genotoxicidad del río Kishon, Israel: la aplicación de un ensayo celular in vitro ". Mutation Research . 518 (1): 21–37. Bibcode :2002MRGTE.518...21A. doi :10.1016/S1383-5718(02)00069-4. PMID  12063064.
• Collins, AR; Dobson, VL; Dusinska, M.; Kennedy, G.; Stetina, R. (1997). "El ensayo del cometa: ¿qué nos puede decir realmente?". Mutation Research . 375 (2): 183–193. Bibcode :1997MRFMM.375..183C. doi :10.1016/S0027-5107(97)00013-4. PMID  9202728.
• Klaude, M.; Eriksson, S.; Nygren, J.; Ahnstrom, G. (1996). "El ensayo del cometa: mecanismos y consideraciones técnicas". Mutation Research . 363 (2): 89–96. doi :10.1016/0921-8777(95)00063-1. PMID  8676929.
• McKelvey-Martin, Valerie J.; Ho, Edwin T.; McKeown, Stephanie R.; Johnston, S. Robin; McCarthy, Patsy J.; Rajab, Nor Fasilah; Downes, C. Stephen (1993). "Aplicaciones emergentes del ensayo de electroforesis en gel de células individuales (Comet). I. Manejo del carcinoma de vejiga humano de células transicionales invasivo. II. Hibridación fluorescente in situ Comets para la identificación de secuencias de ADN dañadas y reparadas en células individuales". Mutagénesis . 13 (1): 1–8. doi : 10.1093/mutage/13.1.1 . PMID  9491387.
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• Tice, RR; Agurell, E.; Anderson, D.; Burlinson, B.; Hartmann, A.; Kobayashi, H.; Miyamae, Y.; Rojas, E.; Ryu, J.-C.; Sasaki, YF (2000). "Ensayo de gel/cometa de célula única: pautas para pruebas de toxicología genética in vitro e in vivo". Mutagénesis ambiental y molecular . 35 (3): 206–221. Bibcode :2000EnvMM..35..206T. doi :10.1002/(SICI)1098-2280(2000)35:3<206::AID-EM8>3.0.CO;2-J. PMID  10737956.