Dispersión de luz multiángulo

Este artículo puede resultar demasiado técnico para la mayoría de los lectores . Por favor, ayúdenos a mejorarlo para que sea comprensible para los no expertos , sin eliminar los detalles técnicos. ( Mayo de 2014 ) ( Aprenda cómo y cuándo eliminar este mensaje )

La dispersión de luz multiángulo ( MALS ) describe una técnica para medir la luz dispersada por una muestra en una pluralidad de ángulos. Se utiliza para determinar tanto la masa molar absoluta como el tamaño medio de las moléculas en solución , detectando cómo dispersan la luz . Lo más frecuente es utilizar un haz colimado de una fuente láser , en cuyo caso la técnica puede denominarse dispersión de luz láser multiángulo ( MALLS ). La inserción de la palabra láser tenía como objetivo tranquilizar a quienes estaban acostumbrados a realizar mediciones de dispersión de luz con fuentes de luz convencionales, como las lámparas de arco de Hg, de que ahora se podían realizar mediciones de ángulo bajo. ^{[ cita requerida ]}

Hasta la llegada de los láseres y sus haces finos asociados de ancho estrecho, el ancho de los haces de luz convencionales utilizados para realizar dichas mediciones impedía la recopilación de datos en ángulos de dispersión más pequeños. En los últimos años, dado que todos los instrumentos comerciales de dispersión de luz utilizan fuentes láser, se ha eliminado la necesidad de mencionar la fuente de luz y se utiliza el término MALS en todo el texto.

El término "multiángulo" se refiere a la detección de luz dispersa en diferentes ángulos discretos, medidos, por ejemplo, por un único detector que se mueve sobre un rango que incluye los ángulos particulares seleccionados o una matriz de detectores fijados en ubicaciones angulares específicas. Se presenta un análisis del fenómeno físico relacionado con esta dispersión de luz estática , incluidas algunas aplicaciones, métodos de análisis de datos y representaciones gráficas asociadas con el mismo.

La medición de la luz dispersada de una muestra iluminada constituye la base de la denominada medición clásica de dispersión de luz . Históricamente, estas mediciones se realizaban utilizando un único detector ^{[1] [2]} que giraba en un arco alrededor de la muestra iluminada. El primer instrumento comercial (formalmente llamado "fotómetro de dispersión") fue el fotómetro de dispersión de luz Brice-Phoenix introducido a mediados de la década de 1950 y seguido por el fotómetro Sofica introducido a fines de la década de 1960.

Las mediciones se expresaban generalmente como intensidades dispersas o irradiancia dispersa. Dado que la recopilación de datos se realizó a medida que el detector se colocaba en diferentes ubicaciones en el arco, cada posición correspondiendo a un ángulo de dispersión diferente, el concepto de colocar un detector separado en cada ubicación angular de interés ^[3] era bien entendido, aunque no se implementó comercialmente ^[4] hasta fines de la década de 1970. Múltiples detectores que tienen diferente eficiencia cuántica tienen diferente respuesta y, por lo tanto, deben normalizarse en este esquema. Brunsting y Mullaney ^[5] desarrollaron un sistema interesante basado en el uso de película de alta velocidad en 1974. Permitió registrar todo el rango de intensidades dispersas en la película con un escaneo posterior del densitómetro que proporcionaba las intensidades dispersas relativas. El uso entonces convencional de un solo detector rotado alrededor de una muestra iluminada con intensidades recolectadas en ángulos específicos se denominó dispersión de luz diferencial ^[6] a partir del término mecánico cuántico sección transversal diferencial , ^[7] σ(θ) expresado en milibarns/estereorradián. Las mediciones de la sección transversal diferencial se hacían comúnmente, por ejemplo, para estudiar la estructura del núcleo atómico mediante la dispersión de nucleones desde ellos, ^[8] como los neutrones . Es importante distinguir entre dispersión de luz diferencial y dispersión de luz dinámica , ambas denominadas por las siglas DLS. Esta última se refiere a una técnica que es bastante diferente, que mide la fluctuación de la luz dispersada debido a la interferencia constructiva y destructiva, estando vinculada la frecuencia al movimiento térmico, movimiento browniano de las moléculas o partículas en solución o suspensión.

Una medición MALS requiere un conjunto de elementos auxiliares. El más importante de ellos es un haz de luz colimado o enfocado (generalmente de una fuente láser que produce un haz colimado de luz monocromática) que ilumina una región de la muestra. En los instrumentos modernos, el haz generalmente está polarizado en un plano perpendicular al plano de medición, aunque se pueden usar otras polarizaciones, especialmente cuando se estudian partículas anisotrópicas. Las mediciones anteriores, antes de la introducción de los láseres, se realizaban utilizando haces de luz enfocados, aunque no polarizados, de fuentes como lámparas de arco de Hg. ^{[ cita requerida ]} Otro elemento necesario es una celda óptica para contener la muestra que se está midiendo. Alternativamente, se pueden emplear celdas que incorporen medios para permitir la medición de muestras que fluyen. Si se deben medir las propiedades de dispersión de partículas individuales, se debe proporcionar un medio para introducir dichas partículas una a la vez a través del haz de luz en un punto generalmente equidistante de los detectores circundantes.

Aunque la mayoría de las mediciones basadas en MALS se realizan en un plano que contiene un conjunto de detectores colocados normalmente de manera equidistante de una muestra ubicada en el centro a través de la cual pasa el haz de iluminación, también se han desarrollado versiones tridimensionales ^{[9] [10]} en las que los detectores se encuentran en la superficie de una esfera con la muestra controlada para pasar a través de su centro donde intersecta la trayectoria del haz de luz incidente que pasa a lo largo de un diámetro de la esfera. El primer marco ^[9] se utiliza para medir partículas de aerosol, mientras que el segundo ^[10] se utilizó para examinar organismos marinos como el fitoplancton .

La medición tradicional de la dispersión de luz diferencial era prácticamente idéntica a la técnica MALS que se utiliza actualmente. Aunque la técnica MALS generalmente recopila datos multiplexados de forma secuencial a partir de las salidas de un conjunto de detectores discretos, la medición anterior de la dispersión de luz diferencial también recopilaba datos de forma secuencial a medida que un único detector se movía de un ángulo de recopilación al siguiente. Por supuesto, la implementación de MALS es mucho más rápida, pero se recopilan los mismos tipos de datos y se interpretan de la misma manera. Por lo tanto, los dos términos se refieren al mismo concepto. Para las mediciones de dispersión de luz diferencial, el fotómetro de dispersión de luz tiene un solo detector, mientras que el fotómetro de dispersión de luz MALS generalmente tiene una pluralidad de detectores.

Otro tipo de dispositivo MALS fue desarrollado en 1974 por Salzmann et al. ^[11] basado en un detector de patrones de luz inventado por George et al. ^[12] para Litton Systems Inc. en 1971. El detector Litton fue desarrollado para muestrear la distribución de energía de la luz en el plano focal trasero de una lente esférica para muestrear relaciones geométricas y la distribución de densidad espectral de objetos registrados en transparencias de película.

La aplicación del detector Litton por Salzman et al. proporcionó mediciones en 32 pequeños ángulos de dispersión entre 0° y 30°, y un promedio sobre un amplio rango de ángulos azimutales, ya que los ángulos más importantes son los ángulos hacia adelante para la dispersión de luz estática. En 1980, Bartholi et al. ^[13] habían desarrollado un nuevo enfoque para medir la dispersión en ángulos de dispersión discretos mediante el uso de un reflector elíptico para permitir la medición en 30 ángulos polares sobre el rango 2,5° ≤ θ ≤ 177,5° con una resolución de 2,1°.

La comercialización de sistemas multiángulo comenzó en 1977 cuando Science Spectrum, Inc. ^[14] patentó un sistema capilar de flujo continuo para un sistema de bioensayo personalizado desarrollado para la USFDA . El primer instrumento MALS comercial que incorporaba 8 detectores discretos fue entregado a SC Johnson and Son, por Wyatt Technology Company, en 1983, ^[15] seguido en 1984 con la venta del primer instrumento de flujo de 15 detectores (Dawn-F) ^[16] a AMOCO. En 1988, se introdujo una configuración tridimensional ^[9] específicamente para medir las propiedades de dispersión de partículas de aerosol individuales. Casi al mismo tiempo, se construyó el dispositivo submarino para medir las propiedades de luz dispersa de fitoplancton individual. ^[10] Las señales se recogieron mediante fibras ópticas y se transmitieron a fotomultiplicadores individuales. Alrededor de diciembre de 2001, se comercializó un instrumento que mide 7 ángulos de dispersión utilizando un detector CCD (BI-MwA: Brookhaven Instruments Corp, Hotlsville, NY).

La literatura asociada con las mediciones realizadas con fotómetros MALS es extensa. ^{[17] [18]} tanto en referencia a mediciones por lotes de partículas/moléculas como a mediciones posteriores al fraccionamiento por medios cromatográficos como cromatografía de exclusión por tamaño ^[19] (SEC), cromatografía de fase inversa ^[20] (RPC) y fraccionamiento de flujo de campo ^[21] (FFF).

La interpretación de las mediciones de dispersión realizadas en ubicaciones multiangulares se basa en cierto conocimiento de las propiedades a priori de las partículas o moléculas medidas. Las características de dispersión de diferentes clases de dichos dispersores se pueden interpretar mejor mediante la aplicación de una teoría adecuada. Por ejemplo, las siguientes teorías son las que se aplican con mayor frecuencia.

La dispersión de Rayleigh es la más simple y describe la dispersión elástica de la luz u otra radiación electromagnética por objetos mucho más pequeños que la longitud de onda incidente. Este tipo de dispersión es responsable del color azul del cielo durante el día y es inversamente proporcional a la cuarta potencia de la longitud de onda.

La aproximación Rayleigh–Gans es un medio para interpretar las mediciones MALS con el supuesto de que las partículas dispersantes tienen un índice de refracción, n ₁ , muy cercano al índice de refracción del medio circundante, n ₀ . Si fijamos m = n ₁ /n ₀ y suponemos que |m - 1| << 1 , entonces dichas partículas pueden considerarse como compuestas de elementos muy pequeños, cada uno de los cuales puede representarse como una partícula dispersante de Rayleigh. Por lo tanto, se supone que cada elemento pequeño de la partícula más grande se dispersa independientemente de cualquier otro.

La teoría de Lorenz–Mie ^[22] se utiliza para interpretar la dispersión de la luz por partículas esféricas homogéneas. La aproximación de Rayleigh–Gans y la teoría de Lorenz–Mie producen resultados idénticos para esferas homogéneas en el límite como |1 − m | → 0 .

La teoría de Lorenz-Mie puede generalizarse a partículas esféricamente simétricas según la referencia. ^[23] Erma ha tratado formas y estructuras más generales. ^[24]

Los datos de dispersión se representan generalmente en términos de la denominada relación de Rayleigh en exceso, definida como la relación de Rayleigh de la solución o del evento de partícula individual de la que se resta la relación de Rayleigh del propio fluido portador y otras contribuciones de fondo, si las hubiera. La relación de Rayleigh medida en un detector que se encuentra en un ángulo θ y que subtiende un ángulo sólido ΔΩ se define como la intensidad de la luz por unidad de ángulo sólido por unidad de intensidad incidente, I ₀ , por unidad de volumen de dispersión iluminado ΔV . El volumen de dispersión ΔV desde el que la luz dispersada llega al detector está determinado por el campo de visión del detector, generalmente restringido por aberturas, lentes y diafragmas. Consideremos ahora una medición MALS realizada en un plano a partir de una suspensión de N partículas/moléculas idénticas por ml iluminada por un fino haz de luz producido por un láser. Suponiendo que la luz está polarizada perpendicularmente al plano de los detectores. La intensidad de la luz dispersada medida por el detector en un ángulo θ en exceso de la dispersada por el fluido de suspensión sería

${\displaystyle I(\theta )={\frac {I_{0}N\Delta V}{(kr)^{2}}}i(\theta )}$,

donde i(θ) es la función de dispersión ^[1] de una partícula individual, k = 2πn ₀ /λ ₀ , n ₀ es el índice de refracción del fluido en suspensión y λ ₀ es la longitud de onda de vacío de la luz incidente. La relación de Rayleigh en exceso, R(θ) , se obtiene entonces mediante

${\displaystyle R(\theta )={\frac {I(\theta )r^{2}}{I_{0}\Delta V}}=Ni(\theta )/k^{2}}$.

Incluso para una esfera homogénea simple de radio a cuyo índice de refracción, n, es casi igual al índice de refracción "n ₀ " del fluido en suspensión, es decir, la aproximación de Rayleigh-Gans, la función de dispersión en el plano de dispersión es la cantidad relativamente compleja

${\displaystyle i(\theta )={\frac {k^{2}V^{2}\left|{m-1}\right|^{2}}{4\pi ^{2}}}G^{2}\left({2ka\sin {\frac {\theta }{2}}}\right)}$, dónde

${\displaystyle G(\xi )={\frac {3}{\xi ^{2}}}(\sin \xi -\xi \cos \xi )}$,    ,    ${\displaystyle k={\frac {2\pi n_{0}}{\lambda _{0}}}}$${\displaystyle V={\frac {4}{3}}\pi a^{3}}$

y λ ₀ es la longitud de onda de la luz incidente en el vacío.

El método MALS se utiliza con mayor frecuencia para caracterizar la masa y el tamaño de las moléculas en solución. Las primeras implementaciones de MALS, como las que analiza Bruno H. Zimm en su artículo "Aparatos y métodos para la medición e interpretación de la variación angular de la dispersión de la luz; resultados preliminares en soluciones de poliestireno" ^[1], implicaban el uso de un único detector rotado alrededor de una muestra contenida en un recipiente transparente. Las mediciones MALS de muestras que no fluyen como esta se conocen comúnmente como "mediciones por lotes". Al crear muestras en varias concentraciones bajas conocidas y detectar la luz dispersada sobre la muestra en ángulos variables, se puede crear un gráfico de Zimm ^[25] al trazar: vs donde c es la concentración de la muestra y k es un factor de estiramiento utilizado para poner kc y en el mismo rango numérico.${\displaystyle {\frac {K^{*}c}{R_{\theta }}}}$${\displaystyle \sin ^{2}{\frac {\theta }{2}}+kc}$${\displaystyle \sin ^{2}{\frac {\theta }{2}}}$

Cuando se traza un gráfico, se puede extrapolar tanto al ángulo cero como a la concentración cero, y el análisis del gráfico dará el radio cuadrático medio de las moléculas de muestra a partir de la pendiente inicial de la línea c=0 y la masa molar de la molécula en el punto donde tanto la concentración como el ángulo son iguales a cero. Las mejoras del gráfico de Zimm, que incorporan todos los datos recopilados (comúnmente denominado "ajuste global"), han reemplazado en gran medida al gráfico de Zimm en los análisis de lotes modernos. ^[26]

Con la llegada de la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), las mediciones MALS comenzaron a utilizarse junto con un detector de concentración en línea para determinar la masa molar absoluta y el tamaño de las fracciones de muestra que se eluyen de la columna, en lugar de depender de técnicas de calibración. Estas mediciones MALS en modo de flujo se han extendido a otras técnicas de separación, como el fraccionamiento de flujo de campo , la cromatografía de intercambio iónico y la cromatografía de fase inversa .

La dependencia angular de los datos de dispersión de la luz se muestra a continuación en una figura de una mezcla de esferas de poliestireno que se separó mediante SEC. Las dos muestras más pequeñas (más a la derecha) eluyeron en último lugar y no muestran dependencia angular. La segunda muestra a la derecha muestra una variación angular lineal con un aumento de la intensidad a menores ángulos de dispersión. La muestra más grande, a la izquierda, eluye primero y muestra una variación angular no lineal.

El acoplamiento del MALS con un detector de concentración en línea después de un método de separación de muestras como SEC permite calcular la masa molar de la muestra eluida además de su radio cuadrático medio. La figura siguiente representa una separación cromatográfica de agregados de BSA. Se muestran la señal de dispersión de luz de 90° de un detector MALS y los valores de masa molar para cada corte de elución.

Como el método MALS puede proporcionar la masa molar y el tamaño de las moléculas, permite estudiar la unión proteína-proteína, la oligomerización y la cinética de autoensamblaje, asociación y disociación. Al comparar la masa molar de una muestra con su concentración, se puede determinar la afinidad de unión y la estequiometría de las moléculas que interactúan.

La relación de ramificación de un polímero se relaciona con el número de unidades de ramificación en un polímero ramificado aleatoriamente y el número de brazos en polímeros ramificados en estrella y fue definida por Zimm y Stockmayer como

${\displaystyle g={\frac {R_{b}^{2}}{R_{l}^{2}}}}$

Donde es el radio cuadrático medio de las macromoléculas ramificadas y lineales con masas molares idénticas. ^[27] Al utilizar MALS junto con un detector de concentración como se describió anteriormente, se crea un gráfico logarítmico del radio cuadrático medio frente a la masa molar. La pendiente de este gráfico produce la relación de ramificación, g. ^[28]$Estilo de visualización R^{2}}$

Además de la ramificación, el gráfico logarítmico de tamaño vs. masa molar indica la forma o conformación de una macromolécula. Un aumento en la pendiente del gráfico indica una variación en la conformación de un polímero de esférico a espiral aleatorio o lineal. La combinación del radio cuadrático medio de MALS con el radio hidrodinámico obtenido a partir de mediciones de DLS produce el factor de forma ρ = , para cada fracción de tamaño macromolecular.$estilo de visualización r_{h}}$${\displaystyle {\frac {r_{g}}{r_{h}}}}$

Otras aplicaciones de MALS incluyen el dimensionamiento de nanopartículas , ^{[29] [30] [31]} estudios de agregación de proteínas , interacciones proteína-proteína , movilidad electroforética o potencial zeta. Las técnicas MALS se han adoptado para el estudio de la estabilidad de fármacos farmacéuticos y su uso en nanomedicina .