Conteo de células

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El recuento celular es uno de los diversos métodos para el recuento o cuantificación similar de células en las ciencias de la vida , incluidos el diagnóstico y el tratamiento médicos . Es un subconjunto importante de la citometría , con aplicaciones en la investigación y la práctica clínica. Por ejemplo, el hemograma completo puede ayudar a un médico a determinar por qué un paciente se siente mal y qué hacer para ayudarlo. Los recuentos de células en medios líquidos (como sangre , plasma , linfa o enjuague de laboratorio) generalmente se expresan como una cantidad de células por unidad de volumen , expresando así una concentración (por ejemplo, 5000 células por mililitro).

Numerosos procedimientos en biología y medicina requieren el recuento de células. Mediante el recuento de células en un volumen pequeño conocido , se puede medir la concentración. Algunos ejemplos de la necesidad de contar células incluyen:

• En medicina, la concentración de diferentes células sanguíneas , como glóbulos rojos y glóbulos blancos , puede proporcionar información crucial sobre el estado de salud de una persona (ver: hemograma completo ).
• En terapia celular , para controlar la dosis de células administrada a un paciente.
• De manera similar, la concentración de bacterias , virus y otros patógenos en la sangre o en otros fluidos corporales puede revelar información sobre el progreso de una enfermedad infecciosa y sobre el grado de éxito con el que el sistema inmunológico está lidiando con la infección .
• Para muchos experimentos de biología molecular es necesario conocer la concentración de células , a fin de ajustar en consecuencia la cantidad de reactivos y productos químicos que se aplicarán en el experimento.
• Los estudios que examinan la tasa de crecimiento de los microorganismos (en otras palabras, qué tan rápido se dividen para crear nuevas células) requieren el recuento de células.
• Calcular la fracción de células muertas y vivas como medida de la viabilidad celular, como por ejemplo de las células expuestas al veneno.

Existen varios métodos para realizar el recuento de células. Algunos son primitivos y no requieren equipo especial, por lo que pueden realizarse en cualquier laboratorio biológico , mientras que otros dependen de sofisticados aparatos electrónicos.

Una cámara de recuento es un portaobjetos de microscopio que está especialmente diseñado para permitir el recuento de células. Los hemocitómetros y las cámaras de recuento Sedgewick Rafter son dos tipos de cámaras de recuento. El hemocitómetro tiene dos cámaras cuadriculadas en su parte media, que se cubren con un portaobjetos de vidrio especial durante el recuento. Se coloca una gota de cultivo celular en el espacio entre la cámara y la cubierta de vidrio, llenándolo mediante acción capilar . ^[1] Al observar la muestra bajo el microscopio , el investigador usa la rejilla para contar manualmente el número de células en un área determinada de tamaño conocido. La distancia de separación entre la cámara y la cubierta está predefinida, por lo que se puede calcular el volumen del cultivo contado y con él la concentración de células. La viabilidad celular también se puede determinar si se agregan colorantes de viabilidad al fluido.

Su ventaja es que son baratos y rápidos, lo que los convierte en el método de recuento preferido en experimentos biológicos rápidos en los que solo es necesario determinar si un cultivo celular ha crecido como se esperaba. Por lo general, el cultivo examinado debe diluirse, de lo contrario, la alta densidad de células haría imposible el recuento. La necesidad de dilución es una desventaja, ya que cada dilución agrega inexactitud a la medición. ^[2]

Para cuantificar el número de células en un cultivo, las células pueden simplemente ser sembradas en una placa de Petri con medio de crecimiento . Si las células están distribuidas eficientemente en la placa, puede suponerse generalmente que cada célula dará lugar a una sola colonia o Unidad Formadora de Colonias (UFC) . Las colonias pueden entonces ser contadas, y en base al volumen conocido de cultivo que fue esparcido en la placa, puede calcularse la concentración celular. Esto a menudo se lleva a cabo siguiendo la norma ASTM D5465. ^[3]

Al igual que con las cámaras de recuento, los cultivos generalmente deben diluirse en gran medida antes de sembrarlos; de lo contrario, en lugar de obtener colonias individuales que se puedan contar, se formará lo que se denomina un "césped": miles de colonias superpuestas. Además, sembrar en placas es el método más lento de todos: la mayoría de los microorganismos necesitan al menos 12 horas para formar colonias visibles.

Aunque este método puede requerir mucho tiempo, proporciona una estimación precisa del número de células viables (ya que sólo ellas podrán crecer y formar colonias visibles). Por ello, se utiliza ampliamente en experimentos cuyo objetivo es cuantificar el número de células resistentes a fármacos u otras condiciones externas (por ejemplo, el experimento de Luria-Delbrück o el ensayo de protección con gentamicina ). Además, la enumeración de colonias en placas de agar se puede facilitar en gran medida mediante el uso de contadores de colonias .

Un contador Coulter es un aparato que permite contar células y medir su volumen. Se basa en el hecho de que las células presentan una gran resistencia eléctrica ; en otras palabras, casi no conducen electricidad . En un contador Coulter, las células, que nadan en una solución que conduce la electricidad, son succionadas una a una hacia un pequeño espacio. Flanqueando el espacio hay dos electrodos que conducen la electricidad. Cuando no hay células en el espacio, la electricidad fluye sin interrupción, pero cuando una célula es succionada hacia el espacio, la corriente encuentra resistencia. El contador Coulter cuenta el número de eventos de este tipo y también mide la corriente (y, por lo tanto, la resistencia), que se correlaciona directamente con el volumen de la célula atrapada. Un sistema similar es la tecnología de conteo de células CASY .

Los contadores Coulter y CASY son mucho más económicos que los citómetros de flujo y para aplicaciones que requieren cantidades y tamaños de células, como la investigación del ciclo celular , son el método de elección. Su ventaja sobre los métodos anteriores es la gran cantidad de células que se pueden procesar en poco tiempo, es decir: miles de células por segundo. Esto ofrece una gran precisión y significación estadística .

La citometría de flujo es, con diferencia, el método más sofisticado y costoso para el recuento de células. En un citómetro de flujo, las células fluyen en una corriente estrecha frente a un haz de láser . El haz las golpea una a una y un detector de luz capta la luz que se refleja en las células.

Los citómetros de flujo tienen muchas otras funciones, como analizar la forma de las células y sus estructuras internas y externas, así como medir la cantidad de proteínas específicas y otros componentes bioquímicos en las células. Por lo tanto, rara vez se compran citómetros de flujo con el único propósito de contar células. ^{[ cita requerida ]}

Los enfoques recientes consideran el uso de imágenes de microscopía de alta calidad sobre las cuales se utiliza un algoritmo de clasificación estadística para realizar la detección y el recuento automatizados de células como una tarea de análisis de imágenes . ^[4] Generalmente se realiza con una tasa de error constante como un proceso de tipo fuera de línea (por lotes). Se puede emplear una variedad de técnicas de clasificación de imágenes para este propósito. ^[5]

En la actualidad, el recuento celular estereológico con decisión manual para la inclusión de objetos según reglas de recuento estereológico imparciales sigue siendo el único método adecuado para la cuantificación celular imparcial en secciones de tejido histológico, por lo que no es lo suficientemente adecuado para ser completamente automatizado. ^[6]

Las suspensiones celulares son turbias . Las células absorben y dispersan la luz. Cuanto mayor sea la concentración de células, mayor será la turbidez. Los espectrofotómetros pueden medir la intensidad de la luz con mucha precisión. El cultivo celular se coloca en una cubeta transparente y se mide la absorción en relación con el medio solo. La densidad óptica (DO) es directamente proporcional a la biomasa en la suspensión celular en un rango determinado que es específico para el tipo de célula. El uso de la espectrofotometría para medir la turbidez de los cultivos se conoce como turbidometría .

Esto ha hecho que la espectrofotometría sea el método de elección para las mediciones del crecimiento bacteriano y aplicaciones relacionadas. El inconveniente de la espectrofotometría es su incapacidad para proporcionar un recuento absoluto o distinguir entre células vivas y muertas.

La microbiología de impedancia es una técnica microbiológica rápida que se utiliza para medir la concentración microbiana (principalmente bacterias , pero también levaduras ) de una muestra mediante el control de los parámetros eléctricos del medio de cultivo. Se basa en el hecho de que el metabolismo de las bacterias transforma los compuestos no cargados (o débilmente cargados) en compuestos altamente cargados, modificando así las propiedades eléctricas del medio de cultivo . La concentración microbiana se estima en función del tiempo necesario para que los parámetros eléctricos controlados se desvíen del valor de referencia inicial.

Existen diferentes instrumentos (construidos en un laboratorio o disponibles comercialmente) para medir la concentración bacteriana mediante microbiología de impedancia. ^{[7] [8] [9] [10] [11]}