Pin de Dar

Las DARPins ( acrónimo de proteínas de repetición de anquirina diseñadas ) son proteínas miméticas de anticuerpos diseñadas genéticamente que generalmente exhiben una unión a proteínas objetivo altamente específica y de alta afinidad . Se derivan de proteínas de repetición de anquirina naturales , una de las clases más comunes de proteínas de unión en la naturaleza, que son responsables de diversas funciones como la señalización celular, la regulación y la integridad estructural de la célula. Las DARPins constan de al menos tres motivos o módulos de repetición, de los cuales los módulos más N- y más C-terminales se denominan "tapas", ya que protegen el núcleo hidrofóbico de la proteína. El número de módulos internos se indica como número (p. ej., N1C, N2C, N3C, ...) mientras que las tapas se indican con "N" o "C", respectivamente. La masa molecular de, p. ej., 14 o 18 kDa ( kilodaltons ) para DARPins de cuatro (N2C) o cinco (N3C) repeticiones es bastante pequeña para un biológico (aproximadamente el 10% del tamaño de una IgG ).

Las DARPin constituyen una nueva clase de terapias de proteínas pequeñas potentes, específicas y versátiles, y se utilizan como herramientas de investigación en diversas aplicaciones de investigación, diagnóstico y terapéuticas . [1] Molecular Partners AG , una empresa biofarmacéutica en etapa clínica con varias moléculas DARPin en desarrollo clínico y preclínico, actualmente está desarrollando DARPin terapéuticas tanto a través de su propio desarrollo como en paralelo con socios. Athebio AG se basa en mejorar aún más el andamiaje DARPin para un enfoque de modelo de asociación . [2]

Además, las DARPins se pueden utilizar como chaperonas de cristalización para proteínas solubles y de membrana, incluidos los receptores acoplados a proteína G (GPCR), ya sea como socios de unión o como fusiones rígidas a la proteína objetivo, un concepto que ahora se está extendiendo a la determinación de la estructura por crioEM. [3] [4] [5] [6]

Origen, estructura y generación

Un DARPin con cinco motivos repetidos de anquirina ( PDB : 2QYJ ​)

La plataforma DARPin fue descubierta y desarrollada en el laboratorio de Andreas Plückthun en la Universidad de Zúrich , Suiza , mientras estudiaba ingeniería y bibliotecas de anticuerpos recombinantes. [7] Las DARPin se derivan de proteínas anquirina naturales, una clase de proteína que media interacciones proteína-proteína de alta afinidad en la naturaleza.

Las bibliotecas DARPin se diseñaron mediante alineaciones de secuencias de varios miles de motivos de repetición de anquirina naturales (de aproximadamente 33 aminoácidos cada uno) combinados con diseño basado en la estructura y métodos de ADN recombinante . [7] Estas proteínas consisten en unidades estructurales repetitivas que forman un dominio proteico estable con una gran superficie de interacción potencial con el objetivo. Por lo general, las DARPins comprenden cuatro o cinco repeticiones, de las cuales la primera (repetición de recubrimiento N) y la última (repetición de recubrimiento C) sirven para proteger el núcleo proteico hidrofóbico del entorno acuoso. Las DARPins corresponden al tamaño promedio de los dominios proteicos de repetición de anquirina naturales. Las proteínas con menos de tres repeticiones (es decir, las repeticiones de recubrimiento y una repetición interna) no forman una estructura terciaria lo suficientemente estable. [8] La masa molecular de una DARPin depende del número total de repeticiones, como se muestra en el siguiente gráfico:

Se repite34567...
Masa aproximada (kDa)1014182226...

Se han generado bibliotecas de DARPins con residuos de interacción con dianas potenciales aleatorizados, con diversidades de más de 10 12 variantes, a nivel de ADN. A partir de estas bibliotecas, los bioquímicos pueden seleccionar DARPins para unirse a la diana de elección con afinidad picomolar y la especificidad se puede seleccionar utilizando la visualización de ribosomas [9] o la visualización de fagos [10] utilizando secuencias de señal que permiten la secreción cotraduccional. [11] Las DARPins se pueden diseñar para actuar como agonistas de receptores , antagonistas , agonistas inversos , inhibidores de enzimas o simples aglutinantes de proteínas diana. [1]

Propiedades y beneficios potenciales de los DARPins

Las DARPins se expresan en el citoplasma de Escherichia coli en niveles altos (más de 10 g/L en fermentación, 1 g/L en matraz de agitación) en forma soluble . [12] Las proteínas exhiben una alta estabilidad térmica y termodinámica ( punto medio de desnaturalización : generalmente desdoblamiento del equilibrio : ∆G > 9,5  kcal/mol ) que aumenta con el aumento del número de repeticiones. [7] [13] [14] Las DARPins son estables en el suero sanguíneo humano y se pueden diseñar para que no contengan epítopos de células T.

Debido a su alta especificidad, estabilidad, potencia y afinidad, así como a su arquitectura flexible, las DARPins tienen un modo de unión a cuerpos rígidos . [1] [9] Las construcciones multiespecíficas o multivalentes creadas por fusión genética sugieren que las DARPins fusionadas tienen propiedades de unión similares a las de las DARPins de dominio único. [1] La ausencia de cisteínas en el andamiaje permite la ingeniería de cisteínas específicas del sitio, lo que permite el acoplamiento dirigido del sitio de sustancias químicas a la molécula. Se pueden introducir aminoácidos no naturales para el mismo propósito. [15]

Potencialmente, las DARPins pueden proporcionar un beneficio clínico al superar las limitaciones de los enfoques terapéuticos convencionales, que normalmente se dirigen a una única vía de la enfermedad y, por lo tanto, pueden comprometer la eficacia. En muchos casos, la complejidad de una enfermedad resulta de la desregulación de múltiples vías. La tecnología DARPin se puede aprovechar para generar rápidamente miles de "multi-DARPins" diferentes donde los dominios de unión están conectados (es decir, mediante enlaces), lo que permite la orientación a varias vías de la enfermedad. Las DARPins y multi-DARPins también se pueden fusionar con elementos que no sean DARPin, como una toxina, [16] para generar terapias dirigidas, y su fabricación se ve facilitada por la resistencia de las DARPins a la agregación. La diversidad de formatos y la solidez de las multi-DARPins facilitan un enfoque empírico (como a través de una detección basada en resultados) para identificar de manera eficiente las DARPins con actividad potencial en vías de enfermedad específicas.

Los beneficios potenciales de las DARPins se deben en gran medida a sus características estructurales y biofísicas. Se cree que su pequeño tamaño (14-18 kDa) permite una mayor penetración en los tejidos, y su alta potencia (<5-100 pM) hace que las DARPins sean activas en bajas concentraciones. [17] Las DARPins son solubles a >100 g/L, y su alta estabilidad y solubilidad se consideran propiedades deseables para los compuestos farmacológicos. Las DARPins se pueden producir de forma rápida y rentable (es decir, a partir de E. coli ). Sus propiedades farmacocinéticas (PK) se pueden ajustar mediante la fusión con moléculas que extienden la vida media, como el polietilenglicol (PEG), o con la unión de las DARPins a la albúmina sérica humana. Debido a sus propiedades biofísicas favorables, [1] las DARPins se consideran altamente desarrollables utilizando procesos estándar, exhibiendo potencialmente un comportamiento de clase robusto.

Desarrollo clínico y aplicaciones

Los DARPins se han utilizado como herramientas de investigación, [1] como agentes de diagnóstico [17] y como agentes terapéuticos. [18] [19] [20] [21] MP0112, el primer candidato a DARPin en la clínica, es un inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y entró en ensayos clínicos para el tratamiento de la degeneración macular húmeda relacionada con la edad (DMRE húmeda, también conocida como degeneración macular neovascular relacionada con la edad) [16] y el edema macular diabético [22] a principios de 2010.

Actualmente, el MP0112 se está investigando en tres ensayos clínicos diferentes. Los dos primeros ensayos son estudios de seguridad y eficacia de abicipar en pacientes con DMAE húmeda para establecer comparaciones entre pacientes japoneses y no japoneses. [18] [20] El tercer estudio tiene como objetivo evaluar la seguridad y eficacia de abicipar en pacientes con EMD. [19]

En julio de 2014, Molecular Partners inició un primer estudio en humanos para investigar la seguridad, la tolerabilidad y los niveles sanguíneos de MP0250, un segundo candidato a DARPin, en pacientes con cáncer. [21]

Molecular Partners AG tiene varios DARPins adicionales en desarrollo preclínico con posibles indicaciones en varias áreas de enfermedades, incluidas la oftalmología , la oncología , la inmuno-oncología y la inmunología .

Referencias

  1. ^ abcdef Plückthun A (2015). "Proteínas de repetición de anquirina diseñadas (DARPins): proteínas de unión para investigación, diagnóstico y terapia". Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol . 55 (1): 489–511. doi : 10.1146/annurev-pharmtox-010611-134654 . PMID  25562645.
  2. ^ www.athebio.com
  3. ^ Mittl PR, Ernst P, Plückthun A (febrero de 2020). "Elucidación de la estructura asistida por chaperonas con DARPins". Current Opinion in Structural Biology . 60 : 93–100. doi :10.1016/j.sbi.2019.12.009. PMID  31918361. S2CID  210133068.
  4. ^ Deluigi M, Klipp A, Klenk C, Merklinger L, Eberle SA, Morstein L, Heine P, Mittl PR, Ernst P, Kamenecka TM, He Y, Vacca S, Egloff P, Honegger A, Plückthun A (enero de 2021). "Los complejos del receptor 1 de neurotensina con ligandos de moléculas pequeñas revelan determinantes estructurales del agonismo completo, parcial e inverso". Science Advances . 7 (5): eabe5504. Bibcode :2021SciA....7.5504D. doi :10.1126/sciadv.abe5504. PMC 7840143 . PMID  33571132. 
  5. ^ Deluigi M, Morstein L, Schuster M, Klenk C, Merklinger L, Cridge RR, de Zhang LA, Klipp A, Vacca S, Vaid TM, Mittl PR, Egloff P, Eberle SA, Zerbe O, Chalmers DK, Scott DJ, Plückthun A (enero de 2022). "La estructura cristalina del receptor α1B-adrenérgico revela determinantes moleculares del reconocimiento selectivo de ligandos". Nature Communications . 13 (1): 382. Bibcode :2022NatCo..13..382D. doi : 10.1038/s41467-021-27911-3 . PMC 8770593 . PMID  35046410. 
  6. ^ Castells-Graells, Roger; Meador, Kyle; Arbing, Mark A.; Sawaya, Michael R.; Gee, Morgan; Cascio, Duilio; Gleave, Emma; Debreczeni, Judit É.; Breed, Jason; Leopold, Karoline; Patel, Ankoor; Jahagirdar, Dushyant; Lyons, Bronwyn; Subramaniam, Sriram; Yeates, Todd (12 de septiembre de 2023). "Determinación de la estructura mediante crio-EM de pequeñas proteínas terapéuticas con una resolución de 3 Å utilizando un andamio de imágenes rígido". Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 120 (37): e2305494120. doi :10.1073/pnas.2305494120. ISSN  0027-8424. PMC 10500258 . Número de modelo:  PMID37669364. 
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  12. ^ Datos de archivo. Molecular Partners AG.
  13. ^ Kohl A, Binz HK, Forrer P, Stumpp MT, Plückthun A, Grütter MG (mayo de 2003). "Diseñado para ser estable: Estructura cristalina de una proteína de consenso con repetición de anquirina". Proc. Natl. Sci. EE. UU . . 100 (4): 1700–1775. Código Bibliográfico :2003PNAS..100.1700K. doi : 10.1073/pnas.0337680100 . PMC 149896 . PMID  12566564. 
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  19. ^ ab Número de ensayo clínico NCT02186119 para "Un estudio de abicipar pegol en pacientes con edema macular diabético" en Clinicaltrials.gov.
  20. ^ ab Número de ensayo clínico NCT02181504 para "Un estudio de abicipar pegol en pacientes japoneses con degeneración macular neovascular relacionada con la edad" en Clinicaltrials.gov.
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  22. ^ Número de ensayo clínico NCT01042678 para "Estudio de la inyección intravítrea de MP0112 en pacientes con edema macular diabético" en ClinicalTrials.gov
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