Cromatografía de fase inversa
Método cromatográfico que utiliza una fase estacionaria no polar

La cromatografía líquida de fase reversa ( RP-LC ) es un modo de cromatografía líquida en el que se utilizan fases estacionarias no polares y fases móviles polares para la separación de compuestos orgánicos. [1] [2] [3] La gran mayoría de las separaciones y análisis que utilizan cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) en los últimos años se realizan utilizando el modo de fase reversa. En el modo de fase reversa, los componentes de la muestra se retienen en el sistema cuanto más hidrófobos sean. [4]

Los factores que afectan la retención y separación de solutos en el sistema cromatográfico de fase inversa son los siguientes:

a. La naturaleza química de la fase estacionaria , es decir, los ligandos unidos en su superficie, así como su densidad de enlace, es decir, la extensión de su cobertura.

b. La composición de la fase móvil . Tipo de disolventes a granel cuyas mezclas afectan la polaridad de la fase móvil, de ahí el nombre de modificador para un disolvente añadido para afectar la polaridad de la fase móvil.

C. Los aditivos, como los tampones, afectan el pH de la fase móvil , lo que afecta el estado de ionización de los solutos y su polaridad.

Para retener los componentes orgánicos en mezclas, las fases estacionarias, empaquetadas dentro de columnas, consisten en sustratos hidrófobos, unidos a la superficie de partículas de gel de sílice poroso en varias geometrías (esféricas, irregulares), en diferentes diámetros (sub-2, 3, 5, 7, 10 um), con diámetros de poro variables (60, 100, 150, 300, A). La superficie de la partícula está cubierta por hidrocarburos unidos químicamente , como C3, C4, C8, C18 y más. Cuanto más largo sea el hidrocarburo asociado con la fase estacionaria, más tiempo se retendrán los componentes de la muestra. Algunas fases estacionarias también están hechas de partículas poliméricas hidrófobas, o partículas de grupos orgánicos de sílice hibridados, para el método en el que se utilizan fases móviles a pH extremo. La mayoría de los métodos actuales de separación de materiales biomédicos utilizan columnas C-18, a veces llamadas por nombres comerciales, como ODS (octadecilsilano) o RP-18. 

Las fases móviles son mezclas de agua y disolventes orgánicos polares, la gran mayoría de los cuales son metanol y acetonitrilo . Estas mezclas suelen contener diversos aditivos como tampones ( acetato , fosfato , citrato ), surfactantes (alquilaminas o alquilsulfonatos ) y aditivos especiales ( EDTA ). El objetivo de utilizar suplementos de un tipo u otro es aumentar la eficiencia, la selectividad y controlar la retención de solutos. 

Fases estacionarias

Caricatura idealizada de gel de sílice antes y después del tratamiento con octadeciltriclorosilano ( C 18 H 37 SiCl 3 . La mayoría de los grupos silanol (rojo) se convierten en grupos alquilsiloxi hidrófobos. [5]

La historia y evolución de las fases estacionarias de fase inversa se describen en detalle en un artículo de Majors, Dolan, Carr y Snyder. [6]

En la década de 1970, la mayoría de las cromatografías líquidas se realizaban utilizando partículas sólidas como fases estacionarias, hechas de gel de sílice o alúmina sin modificar . Este tipo de técnica ahora se conoce como cromatografía de fase normal . Dado que la fase estacionaria es hidrófila en esta técnica y la fase móvil es no polar (que consiste en disolventes orgánicos como hexano y heptano), las biomoléculas con propiedades hidrófilas en la muestra se adsorben fuertemente a la fase estacionaria. Además, no se disolvieron fácilmente en los disolventes de la fase móvil. Al mismo tiempo, las moléculas hidrófobas experimentan menos afinidad con la fase estacionaria polar y se eluyen a través de ella temprano sin suficiente retención. Esta fue la razón por la que durante la década de 1970 las partículas a base de sílice se trataron con hidrocarburos, inmovilizados o unidos en su superficie, y las fases móviles se cambiaron a acuosas y de naturaleza polar, para acomodar sustancias biomédicas.

El uso de una fase estacionaria hidrófoba y fases móviles polares es esencialmente lo inverso de la cromatografía de fase normal, ya que la polaridad de las fases móvil y estacionaria se ha invertido, de ahí el término cromatografía de fase inversa. [7] [8] Como resultado, las moléculas hidrófobas en la fase móvil polar tienden a adsorberse a la fase estacionaria hidrófoba, y las moléculas hidrófilas en la muestra pasan a través de la columna y se eluyen primero. [7] [9] Las moléculas hidrófobas se pueden eluir de la columna disminuyendo la polaridad de la fase móvil utilizando un disolvente orgánico (no polar), lo que reduce las interacciones hidrófobas. Cuanto más hidrófoba sea la molécula, más fuertemente se unirá a la fase estacionaria y mayor será la concentración de disolvente orgánico que se requerirá para eluir la molécula.

Muchos de los parámetros matemáticos de la teoría de la cromatografía y las consideraciones experimentales utilizadas en otros métodos cromatográficos también se aplican a la RP-LC (por ejemplo, el factor de selectividad, la resolución cromatográfica, el recuento de placas, etc.). Se puede utilizar para la separación de una amplia variedad de moléculas. Se utiliza típicamente para la separación de proteínas, [10] porque los solventes orgánicos utilizados en la cromatografía de fase normal pueden desnaturalizar muchas proteínas.

En la actualidad, la RP-LC es una técnica analítica de uso frecuente. Existe una gran variedad de fases estacionarias disponibles para su uso en RP-LC, lo que permite una gran flexibilidad en el desarrollo de los métodos de separación. [11] [12]

Fases estacionarias a base de sílice

Las partículas de gel de sílice se utilizan comúnmente como fase estacionaria en la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) por varias razones, [13] [14] entre ellas:

  1. Gran área de superficie : las partículas de gel de sílice tienen una gran área de superficie, lo que permite interacciones directas con solutos o después de la unión de una variedad de ligandos para interacciones versátiles con las moléculas de muestra, lo que conduce a mejores separaciones.
  2. Estabilidad química y térmica e inercia : [15] El gel de sílice es químicamente estable, ya que normalmente no reacciona ni con los disolventes de la fase móvil ni con los compuestos que se separan, lo que da como resultado análisis precisos, repetibles y confiables.
  3. Amplia aplicabilidad : [16] El gel de sílice es versátil y se puede modificar con varios grupos funcionales, lo que lo hace adecuado para una amplia gama de analitos y aplicaciones.
  4. Separación eficiente : Las propiedades únicas de las partículas de gel de sílice, combinadas con su gran área superficial y su tamaño de poro de partícula promedio controlado, [17] facilitan una separación eficiente y precisa de compuestos en HPLC.
  5. Reproducibilidad : Las partículas de gel de sílice pueden ofrecer una alta reproducibilidad de lote a lote, lo que es crucial para realizar análisis de HPLC consistentes y confiables a lo largo de décadas.
  6. Control del diámetro de partícula y del tamaño de poro : [18] [19] El gel de sílice se puede diseñar para tener tamaños de poro específicos, lo que permite un control preciso de la separación en función del tamaño molecular.
  7. Rentabilidad : La sílice es el elemento más abundante en la Tierra, por lo que su gel es una opción rentable para aplicaciones de HPLC, lo que la hace ampliamente adoptada en los laboratorios.

La Farmacopea de los Estados Unidos (USP) ha clasificado las columnas de HPLC por tipos L#. [20] La columna más popular en esta clasificación es una sílice unida a cadena de carbono octadecilo (C18) (clasificación USP L1). [21] A esto le siguen la sílice unida a C8 (L7), la sílice pura (L3), la sílice unida a ciano (CN) (L10) y la sílice unida a fenilo (L11). Tenga en cuenta que C18, C8 y fenilo son fases estacionarias de fase inversa dedicadas, mientras que las columnas CN se pueden utilizar en un modo de fase inversa dependiendo de las condiciones del analito y de la fase móvil. No todas las columnas C18 tienen propiedades de retención idénticas. La funcionalización de la superficie de la sílice se puede realizar en una reacción monomérica o polimérica con diferentes organosilanos de cadena corta utilizados en un segundo paso para cubrir los grupos silanol restantes ( protección final ). Si bien el mecanismo de retención general sigue siendo el mismo, diferencias sutiles en las químicas de superficie de diferentes fases estacionarias provocarán cambios en la selectividad.

Las columnas modernas tienen una polaridad diferente según el ligando unido a la fase estacionaria. PFP es pentafluorofenilo. CN es ciano. NH2 es amino. ODS es octadecilo o C18. ODCN es una columna de modo mixto que consta de C18 y nitrilo. [22]

Los recientes avances en soportes cromatográficos e instrumentación para cromatografía líquida (LC) facilitan separaciones rápidas y altamente eficientes, utilizando varias geometrías de fases estacionarias. [23] Se han propuesto varias estrategias analíticas, como el uso de soportes monolíticos a base de sílice , temperaturas elevadas de la fase móvil y columnas rellenas con partículas superficialmente porosas sub-3 μm (núcleo fusionado o sólido) [24] o con partículas totalmente porosas sub-2 μm para su uso en sistemas LC de ultra alta presión (UHPLC). [25]

Fases móviles

Boyes y Dong publicaron un artículo completo sobre las tendencias modernas y las mejores prácticas de selección de fase móvil en cromatografía de fase inversa. [26] Una fase móvil en cromatografía de fase inversa consiste en mezclas de agua o tampones acuosos, a los que se agregan solventes orgánicos, para eluir analitos de una columna de fase inversa de manera selectiva. [7] [27] Los solventes orgánicos agregados deben ser miscibles con agua, y los dos solventes orgánicos más comunes utilizados son acetonitrilo y metanol . También se pueden usar otros solventes como etanol o 2-propanol ( alcohol isopropílico ) y tetrahidrofurano (THF). El solvente orgánico también se denomina modificador, ya que se agrega a la solución acuosa en la fase móvil para modificar la polaridad de la fase móvil. El agua es el solvente más polar en la fase móvil de fase inversa; por lo tanto, reducir la polaridad de la fase móvil agregando modificadores mejora su fuerza de elución. Los dos modificadores orgánicos más utilizados son el acetonitrilo y el metanol, aunque el acetonitrilo es la opción más popular. También se puede utilizar isopropanol (2-propanol), debido a sus fuertes propiedades de elución, pero su uso está limitado por su alta viscosidad, que da lugar a contrapresiones más altas. Tanto el acetonitrilo como el metanol son menos viscosos que el isopropanol, aunque una mezcla de 50:50 por ciento de metanol:agua también es muy viscosa y provoca contrapresiones altas.

Los tres disolventes son esencialmente transparentes a la luz ultravioleta. Esta es una propiedad crucial para la cromatografía de fase reversa común, ya que los componentes de la muestra suelen detectarse mediante detectores de luz ultravioleta. El acetonitrilo es más transparente que los demás en el rango de longitudes de onda ultravioleta bajas, por lo que se utiliza casi exclusivamente para separar moléculas con cromóforos débiles o nulos (grupos absorbentes de luz ultravioleta-visible), como los péptidos. La mayoría de los péptidos solo absorben en longitudes de onda bajas en el espectro ultravioleta (normalmente menos de 225 nm) y el acetonitrilo proporciona una absorbancia de fondo mucho menor en longitudes de onda bajas que los otros disolventes comunes.

El pH de la fase móvil puede tener un papel importante en la retención de un analito y puede cambiar la selectividad de ciertos analitos. [28] [29] Para las muestras que contienen solutos con grupos funcionales ionizados, como aminas , carboxilos , fosfatos , fosfonatos , sulfatos y sulfonatos , la ionización de estos grupos se puede controlar utilizando tampones de fase móvil. [30]

Por ejemplo, los grupos carboxílicos en los solutos se cargan cada vez más negativamente a medida que el pH de la fase móvil aumenta por encima de su pKa, por lo que toda la molécula se vuelve más polar y menos retenida en la fase estacionaria apolar. En este caso, aumentar el pH de la fase móvil por encima de 4-5 = pH (que es el rango de pKa típico para los grupos carboxílicos) aumenta su ionización, por lo tanto disminuye su retención. Por el contrario, usar una fase móvil a un pH inferior a 4 [31] aumentará su retención, porque disminuirá su grado de ionización, volviéndolos menos polares.

Las mismas consideraciones se aplican a las sustancias que contienen grupos funcionales básicos, como las aminas, cuyos rangos de pKa están alrededor de 8 y superiores, se retienen más, a medida que aumenta el pH de la fase móvil, acercándose a 8 y más, porque están menos ionizadas, por lo tanto, son menos polares. Sin embargo, en el caso de fases móviles de pH alto, la mayoría de las columnas de fase reversa tradicionales basadas en gel de sílice generalmente están limitadas para su uso con fases móviles a pH 8 y superiores, por lo tanto, el control sobre la retención de aminas en este rango es limitado. [32]

La elección del tipo de tampón es un factor importante en el desarrollo del método RP-HPLC, ya que puede afectar la retención, la selectividad y la resolución de los analitos de interés. [26] Al seleccionar un tampón para RP-HPLC, hay una serie de factores a considerar, incluidos:

  • El pH deseado de la fase móvil : los tampones son más efectivos alrededor de su valor de pKa, por lo que es importante elegir un tampón con un pKa que esté cerca del pH deseado de la fase móvil necesaria.
  • La solubilidad del tampón en el disolvente orgánico : El tampón debe ser compatible con el disolvente orgánico que se está utilizando en la fase móvil, principalmente con los disolventes orgánicos comunes mencionados anteriormente, acetonitrilo, metanol e isopropanol.
  • El límite de UV del tampón : en caso de detección por UV, el tampón debe tener una absorción de UV que sea inferior a la longitud de onda de detección de los analitos de interés. Esto evitará que el tampón interfiera en la detección de esos analitos.
  • La compatibilidad del tampón con el detector : si se utiliza espectrometría de masas (MS) para la detección, el tampón debe ser compatible con el instrumento de espectrometría de masas (MS). [33] Algunos tampones, como los que contienen sales de fosfato, no se pueden utilizar con los detectores de MS, ya que no son volátiles como se necesita e interfieren con la detección de MS al suprimir la ionización de los analitos, lo que hace que no sean detectados por MS.

Algunos de los tampones más comunes utilizados en RP-HPLC incluyen: [34]

  • Tampones de fosfato : los tampones de fosfato son versátiles y se pueden utilizar para lograr una amplia gama de valores de pH, gracias a sus 3 valores de pKa. También tienen un fondo UV muy bajo para la detección UV. Sin embargo, no son apropiados para la detección MS.
  • Tampones de acetato : los tampones de acetato también son versátiles y se pueden utilizar para alcanzar el rango de valores de pH que se utilizan normalmente en RP-LC. En términos de detección de UV a longitudes de onda inferiores a 220 nm, no es tan favorable. El tampón de acetato de amonio es compatible con MS.
  • Tampones de formato : los tampones de formato son similares al tampón de acetato en cuanto al rango de pH utilizado y la detección UV limitada por debajo de los 225 nm. Su acetato de amonio también es compatible con MS.
  • Tampones de amonio : los tampones de amonio son volátiles y se utilizan a menudo en métodos LC-MS. También son limitados para la detección de UV bajo.

Los analitos cargados se pueden separar en una columna de fase reversa mediante el uso de apareamiento iónico (también llamado interacción iónica). Esta técnica se conoce como cromatografía de apareamiento iónico en fase reversa. [35]

La elución se puede realizar de forma isocrática (la composición agua-disolvente no cambia durante el proceso de separación) o utilizando un gradiente de solución (la composición agua-disolvente cambia durante el proceso de separación, generalmente disminuyendo la polaridad).

Véase también

Referencias

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  • Tablas que resumen los diferentes tipos de fases inversas e información sobre el proceso de funcionalización.
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