Anticuerpos policlonales

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Los anticuerpos policlonales (pAbs) son anticuerpos secretados por diferentes linajes de células B dentro del cuerpo (mientras que los anticuerpos monoclonales provienen de un solo linaje celular). Son un conjunto de moléculas de inmunoglobulina que reaccionan contra un antígeno específico , cada una de las cuales identifica un epítopo diferente .

El procedimiento general para producir anticuerpos policlonales es el siguiente:

1. Preparación de antígenos
2. Selección y preparación de adyuvantes
3. Selección de animales
4. Proceso de inyección
5. Extracción de suero sanguíneo

Se inyecta un conjugado de antígeno/adyuvante en un animal seleccionado para iniciar una respuesta inmunitaria amplificada. Después de una serie de inyecciones durante un período de tiempo específico, se espera que el animal haya creado anticuerpos contra el conjugado. Luego se extrae sangre del animal y se purifica para obtener el anticuerpo de interés.

La inoculación se realiza en un mamífero adecuado , como un ratón, un conejo o una cabra. A menudo se prefieren los mamíferos más grandes, ya que la cantidad de suero que se puede recolectar es mayor. Se inyecta un antígeno en el mamífero. Esto induce a los linfocitos B a producir inmunoglobulinas IgG específicas para el antígeno. Esta IgG policlonal se purifica a partir del suero del mamífero .

Por el contrario, los anticuerpos monoclonales se derivan de una sola línea celular.

Existen muchas metodologías para la producción de anticuerpos policlonales en animales de laboratorio. Las directrices institucionales que rigen el uso de animales y los procedimientos relacionados con estas metodologías generalmente están orientadas a consideraciones humanitarias y conductas apropiadas para el uso de adyuvantes (agentes que modifican el efecto de otros agentes mientras que tienen pocos o ningún efecto directo cuando se administran por sí mismos). Esto incluye la selección de adyuvantes, vías y sitios de administración, volúmenes de inyección por sitio y número de sitios por animal. Las políticas institucionales generalmente incluyen volúmenes permitidos de sangre por recolección y precauciones de seguridad que incluyen la inmovilización y sedación o anestesia adecuadas de los animales para prevenir lesiones a los animales o al personal.

El objetivo principal de la producción de anticuerpos en animales de laboratorio es obtener antisueros de alta afinidad y alto título para su uso en pruebas de experimentación o de diagnóstico. Los adyuvantes se utilizan para mejorar o potenciar la respuesta inmunitaria a los antígenos. La mayoría de los adyuvantes proporcionan un lugar de inyección y un depósito de antígeno que permite una liberación lenta del antígeno en los ganglios linfáticos de drenaje.

Muchos adyuvantes también contienen o actúan directamente como:

1. surfactantes que promueven la concentración de moléculas de antígenos proteicos en una gran superficie, y
2. Moléculas o propiedades inmunoestimulantes. Los adyuvantes se utilizan generalmente con antígenos proteicos solubles para aumentar los títulos de anticuerpos e inducir una respuesta prolongada con memoria acompañante.

Estos antígenos por sí solos son generalmente inmunógenos deficientes. La mayoría de los antígenos proteicos complejos inducen múltiples clones de células B durante la respuesta inmunitaria, por lo que la respuesta es policlonal. Las respuestas inmunitarias a los antígenos no proteicos son generalmente deficientes o se ven potenciadas por los adyuvantes y no existe memoria sistémica.

Actualmente también se están produciendo anticuerpos a partir del aislamiento de linfocitos B humanos para producir mezclas específicas de anticuerpos monoclonales recombinantes. La empresa de biotecnología Symphogen desarrolla este tipo de anticuerpos para aplicaciones terapéuticas. Es la primera empresa de investigación que ha alcanzado la fase dos de ensayos con mezclas de anticuerpos monoclonales que imitan la diversidad de los fármacos de anticuerpos policlonales. Esta producción evita la transmisión viral y priónica y este es el proceso sencillo.

Los animales que se utilizan con frecuencia para la producción de anticuerpos policlonales incluyen pollos, cabras, cobayas, hámsteres, caballos, ratones, ratas y ovejas. Sin embargo, el conejo es el animal de laboratorio más utilizado para este propósito. La selección de animales debe basarse en:

1. la cantidad de anticuerpos necesarios,
2. la relación entre el donante del antígeno y el productor de anticuerpos del receptor (generalmente, cuanto más distante sea la relación filogenética, mayor será el potencial de una respuesta de anticuerpos de alto título) y
3. las características necesarias [p. ej., clase, subclase (isotipo), naturaleza fijadora del complemento] de los anticuerpos que se van a producir. La inmunización y las flebotomías están asociadas al estrés y, al menos cuando se utilizan conejos y roedores, se prefieren animales libres de patógenos específicos (SPF). El uso de dichos animales puede reducir drásticamente la morbilidad y la mortalidad debidas a organismos patógenos, especialmente Pasteurella multocida en conejos.

Generalmente, se utilizan cabras o caballos cuando se requieren grandes cantidades de antisueros. Muchos investigadores prefieren los pollos debido a su distancia filogenética con respecto a los mamíferos. Los pollos transfieren grandes cantidades de IgY (IgG) a la yema del huevo y la recolección de anticuerpos de los huevos elimina la necesidad del procedimiento de sangrado invasivo. Los huevos de una semana pueden contener 10 veces más anticuerpos que el volumen de sangre de conejo obtenido de un sangrado semanal. Sin embargo, existen algunas desventajas cuando se utilizan ciertos anticuerpos derivados de pollos en inmunoensayos. El IgY de pollo no fija el componente C1 del complemento de mamíferos y no funciona como anticuerpo precipitante utilizando soluciones estándar.

Aunque los ratones son los más utilizados para la producción de anticuerpos monoclonales, su pequeño tamaño suele impedir su uso para obtener cantidades suficientes de anticuerpos policlonales séricos. Sin embargo, los anticuerpos policlonales en ratones pueden recogerse del líquido ascítico utilizando cualquiera de las diversas metodologías de producción de ascitis.

Cuando se utilizan conejos, se deben utilizar animales adultos jóvenes (2,5–3,0 kg o 5,5–6,5 lb) para la inmunización primaria debido a la vigorosa respuesta de anticuerpos. La función inmunitaria alcanza su punto máximo en la pubertad y las respuestas primarias a nuevos antígenos disminuyen con la edad. En general, se prefieren los conejos hembras porque son más dóciles y se ha informado que generan una respuesta inmunitaria más vigorosa que los machos. Se deben utilizar al menos dos animales por antígeno cuando se utilizan animales exógamos. Este principio reduce el potencial fracaso total resultante de la falta de respuesta a los antígenos de animales individuales.

El tamaño, el grado de agregación y la natividad relativa de los antígenos proteicos pueden afectar drásticamente la calidad y la cantidad de anticuerpos producidos. Los polipéptidos pequeños (< 10  kDa ) y los antígenos no proteicos generalmente necesitan ser conjugados o reticulados con proteínas transportadoras inmunogénicas más grandes para aumentar la inmunogenicidad y proporcionar epítopos de células T. En general, cuanto más grande sea la proteína inmunogénica, mejor. Las proteínas más grandes, incluso en cantidades más pequeñas, generalmente dan como resultado una mejor participación de las células procesadoras de antígenos presentadoras de antígeno para una respuesta inmunitaria satisfactoria. La inyección de proteínas solubles, no agregadas, tiene una mayor probabilidad de inducir tolerancia en lugar de una respuesta de anticuerpos satisfactoria.

La hemocianina de lapa (KLH) y la albúmina sérica bovina son dos proteínas transportadoras ampliamente utilizadas. La poli-L-lisina también se ha utilizado con éxito como estructura principal para péptidos. Aunque el uso de poli-L-lisina reduce o elimina la producción de anticuerpos contra proteínas extrañas, puede provocar un fallo en la producción de anticuerpos inducida por péptidos. Recientemente, los liposomas también se han utilizado con éxito para la administración de péptidos pequeños y esta técnica es una alternativa a la administración con adyuvantes de emulsión oleosa.

La selección de la cantidad de antígeno para la inmunización varía según las propiedades del antígeno y del adyuvante seleccionado. En general, se necesitan cantidades de proteína de microgramos a miligramos en el adyuvante para generar títulos altos de anticuerpos. La dosis de antígeno generalmente está asociada a la especie, más que al peso corporal. La llamada "ventana" de inmunogenicidad en cada especie es amplia, pero un exceso o una falta de antígeno puede inducir tolerancia, supresión o desviación inmunitaria hacia la inmunidad celular en lugar de una respuesta humoral satisfactoria. Se han informado niveles óptimos y habituales de antígeno proteico para inmunizar especies específicas en los siguientes rangos:

1. conejo, 50–1000 μg;
2. ratón, 10–50 μg;
3. conejillo de indias, 50–500 μg; y
4. cabra, 250–5000 μg.

Se informa que las dosis óptimas de "cebado" están en el extremo inferior de cada rango.

La afinidad de los anticuerpos séricos aumenta con el tiempo (meses) después de la inyección de mezclas de antígeno y adyuvante y a medida que el antígeno en el sistema disminuye. Las dosis de antígeno ampliamente utilizadas para inmunizaciones de "refuerzo" o secundarias suelen ser la mitad o igual a las dosis iniciales. Los antígenos deben estar libres de subproductos de preparación y sustancias químicas como gel de poliacrilamida, SDS, urea, endotoxinas, material particulado y valores extremos de pH.

Cuando se utiliza un péptido para generar el anticuerpo, es extremadamente importante diseñar los antígenos de forma adecuada. Existen varios recursos que pueden ayudar en el diseño, así como empresas que ofrecen este servicio. Expasy ha agregado un conjunto de herramientas públicas en su página ProtScale que requieren cierto grado de conocimiento del usuario para navegar. Para una herramienta de puntuación de péptidos más simple, existe una herramienta Antigen Profiler disponible que le permitirá puntuar secuencias de péptidos individuales en función de una base de datos de mapeo de epítopos de relación de inmunógenos anteriores utilizados para generar anticuerpos. Finalmente, como regla general, los péptidos deben seguir algunos criterios básicos.

Al examinar péptidos para síntesis e inmunización, se recomienda evitar determinados residuos y secuencias debido a posibles problemas de síntesis. Entre estas características se incluyen algunas de las más comunes:

• Repeticiones extremadamente largas del mismo aminoácido (por ejemplo, RRRR)
• Dobletes de serina (S), treonina (T), alanina (A) y valina (V)
• Finalizar o iniciar una secuencia con una prolina (P)
• Glutamina (Q) o asparagina (N) en el extremo n
• Péptidos sobrepesados ​​con residuos hidrofóbicos (p.ej. V, A, L, I, etc....)

Los investigadores también deben considerar el estado de natividad de los antígenos proteicos cuando se utilizan como inmunógenos y la reacción con los anticuerpos producidos. Los anticuerpos contra proteínas nativas reaccionan mejor con proteínas nativas y los anticuerpos contra proteínas desnaturalizadas reaccionan mejor con proteínas desnaturalizadas. Si se van a utilizar anticuerpos obtenidos en transferencias de membrana (proteínas sometidas a condiciones desnaturalizantes), entonces se deben producir anticuerpos contra proteínas desnaturalizadas. Por otro lado, si se van a utilizar anticuerpos para reaccionar con una proteína nativa o bloquear un sitio activo de proteína, entonces se deben producir anticuerpos contra la proteína nativa. Los adyuvantes a menudo pueden alterar la natividad de la proteína. Generalmente, los antígenos proteicos absorbidos en un adyuvante de emulsión de aceite en agua preformado , retienen una mayor estructura de proteína nativa que aquellos en emulsiones de agua en aceite.

Los antígenos siempre deben prepararse utilizando técnicas que garanticen que están libres de contaminación microbiana. La mayoría de las preparaciones de antígenos proteicos pueden esterilizarse pasándolas por un filtro de 0,22 μm. Los abscesos sépticos suelen producirse en los sitios de inoculación de los animales cuando se utilizan preparaciones contaminadas. Esto puede provocar el fracaso de la inmunización contra el antígeno en cuestión.

Existen muchos adyuvantes inmunológicos disponibles comercialmente . La selección de adyuvantes específicos o tipos varía dependiendo de si se van a utilizar para investigación y producción de anticuerpos o en el desarrollo de vacunas. Los adyuvantes para uso en vacunas solo necesitan producir anticuerpos protectores y una buena memoria sistémica, mientras que los que se utilizan para la producción de antisueros necesitan inducir rápidamente anticuerpos de alto título y alta avidez. Ningún adyuvante es ideal para todos los propósitos y todos tienen ventajas y desventajas. El uso de adyuvantes generalmente está acompañado de efectos secundarios indeseables de diversa gravedad y duración. La investigación sobre nuevos adyuvantes se centra en sustancias que tienen una toxicidad mínima y al mismo tiempo mantienen una inmunoestimulación máxima. Los investigadores siempre deben ser conscientes del posible dolor y la angustia asociados con el uso de adyuvantes en animales de laboratorio.

Los adyuvantes más utilizados para la producción de anticuerpos son el de Freund, el de alumbre, el sistema adyuvante Ribi y el de Titermax.

Digoxina Immune Fab es el fragmento de unión al antígeno de los anticuerpos policlonales generados contra el derivado de Digitalis como un hapteno unido a una proteína y se utiliza para revertir la toxicidad potencialmente mortal de la digoxina o digitoxina . ^{[1] [2] [3]}

La inmunoglobulina Rho(D) se elabora a partir de plasma humano obtenido de donantes Rh negativos con anticuerpos contra el antígeno D. Se utiliza para proporcionar una unión inmunitaria pasiva del antígeno, lo que evita una respuesta inmunitaria activa materna que podría provocar una enfermedad hemolítica en el recién nacido . ^{[4] [5]}

Rozrolimupab es un anticuerpo policlonal humano recombinante anti- RhD compuesto por 25 anticuerpos IgG1 únicos y se utiliza para el tratamiento de la púrpura trombocitopénica inmunitaria y la prevención de la isoinmunización en mujeres embarazadas Rh negativas .

REGN-COV2 ( Regeneron Pharmaceuticals ): tratamiento potencial para personas con COVID-19 y para prevenir la infección por coronavirus SARS-CoV-2 .

El uso de anticuerpos policlonales (PAb) en lugar de anticuerpos monoclonales tiene sus ventajas. Las habilidades técnicas necesarias para producir anticuerpos policlonales no son tan exigentes. Son económicos de fabricar y se pueden generar con bastante rapidez, demorando hasta varios meses en producirse. Los PAb son heterogéneos, lo que les permite unirse a una amplia gama de epítopos de antígenos. Debido a que los PAb se producen a partir de una gran cantidad de clones de células B, es más probable que se unan con éxito a un antígeno específico. Los PAb permanecen estables en diferentes entornos, como un cambio en el pH o la concentración de sal, lo que les permite ser más aplicables en ciertos procedimientos. Además, dependiendo de la cantidad necesaria, los PAb se pueden producir en grandes cantidades en relación con el tamaño del animal utilizado. ^{[6] [7] [8]}

• Célula B plasmática
• Clon (biología de células B)
• Respuesta policlonal

• Artículo de Nature News sobre la terapia con anticuerpos policlonales
• Medidas inmunológicas de antigenicidad (libro de texto en línea, consulte la sección 11.1.)
• Anticuerpo policlonal en Diccionario de Biología Celular y Molecular
• Generación de anticuerpos en openwetware (descripción técnica para investigadores)
• Anticuerpos policlonales y monoclonales