Ensayo enzimático

Los ensayos enzimáticos son métodos de laboratorio para medir la actividad enzimática . Son fundamentales para el estudio de la cinética enzimática y la inhibición enzimática .

La cantidad o concentración de una enzima se puede expresar en cantidades molares , como con cualquier otra sustancia química, o en términos de actividad en unidades enzimáticas .

La actividad enzimática es una medida de la cantidad de enzima activa presente y, por lo tanto, depende de varias condiciones físicas, que deben especificarse .

Se calcula utilizando la siguiente fórmula:

${\displaystyle \mathrm {a} =\mathrm {n} _ {\text{t}}=\mathrm {r} \times \mathrm {V} }$

dónde

${\displaystyle \mathrm {a}}$= Actividad enzimática

${\displaystyle \mathrm {n} _ {\text{t}}}$= Moles de sustrato convertidos por unidad de tiempo

${\displaystyle \mathrm {r}}$= Velocidad de la reacción

${\displaystyle \mathrm {V}}$= Volumen de reacción

La unidad del SI es el katal , 1 katal = 1  mol s ⁻¹ (mol por segundo), pero se trata de una unidad excesivamente grande. Un valor más práctico y de uso común es la unidad enzimática (U) = 1 μmol min ⁻¹ (micromol por minuto). 1 U corresponde a 16,67 nanokatales . ^[1]

La actividad enzimática, tal como se expresa en katal, generalmente se refiere a la del sustrato natural objetivo asumido de la enzima. La actividad enzimática también se puede expresar como la de ciertos sustratos estandarizados, como la gelatina , que luego se mide en unidades de digestión de gelatina (GDU), o las proteínas de la leche, que luego se miden en unidades de coagulación de la leche (MCU). Las unidades GDU y MCU se basan en la velocidad con la que un gramo de la enzima digiere la gelatina o las proteínas de la leche, respectivamente. 1 GDU equivale aproximadamente a 1,5 MCU. ^[2]

Una mayor cantidad de sustrato aumentará la velocidad de reacción con las enzimas, sin embargo, una vez pasado cierto punto, la velocidad de reacción se estabilizará porque la cantidad de sitios activos disponibles se ha mantenido constante.

La actividad específica de una enzima es otra unidad común. Se trata de la actividad de una enzima por miligramo de proteína total (expresada en μmol min ⁻¹ mg ⁻¹ ). La actividad específica proporciona una medida de la pureza de la enzima en la mezcla. Son los micromoles de producto formados por una enzima en una cantidad determinada de tiempo (minutos) en condiciones dadas por miligramo de proteínas totales. La actividad específica es igual a la velocidad de reacción multiplicada por el volumen de reacción dividido por la masa de proteína total. La unidad del SI es katal/kg, pero una unidad más práctica es μmol/(mg*min).

La actividad específica es una medida de la procesividad enzimática (la capacidad de la enzima para ser procesada), a una concentración de sustrato específica (generalmente saturada) , y suele ser constante para una enzima pura.

Se puede realizar un proceso de titulación del sitio activo para eliminar errores que surgen de diferencias en los lotes de cultivo y/o enzimas mal plegadas y problemas similares. Esta es una medida de la cantidad de enzima activa, calculada, por ejemplo, titulando la cantidad de sitios activos presentes empleando un inhibidor irreversible. La actividad específica debe expresarse entonces como μmol min ⁻¹ mg ⁻¹ de enzima activa. Si se conoce el peso molecular de la enzima, se puede calcular el número de recambio , o μmol de producto por segundo por μmol de enzima activa, a partir de la actividad específica. El número de recambio se puede visualizar como el número de veces que cada molécula de enzima lleva a cabo su ciclo catalítico por segundo.

La velocidad de una reacción es la concentración de sustrato que desaparece (o producto producido) por unidad de tiempo (mol L ⁻¹ s ⁻¹ ).

El porcentaje de pureza es 100 % × (actividad específica de la muestra de enzima / actividad específica de la enzima pura). La muestra impura tiene una actividad específica menor porque parte de la masa no es en realidad enzima. Si se conoce la actividad específica de la enzima 100 % pura, entonces una muestra impura tendrá una actividad específica menor, lo que permite calcular la pureza y luego obtener un resultado claro.

Todos los ensayos enzimáticos miden el consumo de sustrato o la producción de producto a lo largo del tiempo. Existe una gran cantidad de métodos diferentes para medir las concentraciones de sustratos y productos y muchas enzimas se pueden analizar de varias formas diferentes. Los bioquímicos suelen estudiar las reacciones catalizadas por enzimas utilizando cuatro tipos de experimentos: ^[3]

• Experimentos de velocidad inicial . Cuando una enzima se mezcla con un gran exceso de sustrato, el intermediario enzima-sustrato se acumula en un transitorio inicial rápido. Luego, la reacción alcanza una cinética de estado estable en la que los intermediarios enzima-sustrato permanecen aproximadamente constantes con el tiempo y la velocidad de reacción cambia relativamente lentamente. Las velocidades se miden durante un período corto después de alcanzar el estado cuasi-estacionario, generalmente monitoreando la acumulación de producto con el tiempo. Debido a que las mediciones se llevan a cabo durante un período muy corto y debido al gran exceso de sustrato, se puede realizar la aproximación de que la cantidad de sustrato libre es aproximadamente igual a la cantidad de sustrato inicial. El experimento de velocidad inicial es el más simple de realizar y analizar, ya que está relativamente libre de complicaciones como la reacción inversa y la degradación de la enzima. Por lo tanto, es con mucho el tipo de experimento más utilizado en cinética enzimática.
• Experimentos de curva de progreso . En estos experimentos, los parámetros cinéticos se determinan a partir de expresiones para las concentraciones de especies en función del tiempo. La concentración del sustrato o producto se registra en el tiempo después del transitorio rápido inicial y durante un período lo suficientemente largo como para permitir que la reacción se acerque al equilibrio. Los experimentos de curva de progreso se utilizaron ampliamente en el período inicial de la cinética enzimática, pero ahora son menos comunes.
• Experimentos de cinética transitoria . En estos experimentos, se hace un seguimiento del comportamiento de la reacción durante el transitorio rápido inicial a medida que el intermedio alcanza el período de cinética de estado estable. Estos experimentos son más difíciles de realizar que cualquiera de las dos clases anteriores porque requieren técnicas especializadas (como la fotólisis instantánea de compuestos enjaulados) o una mezcla rápida (como flujo detenido , flujo enfriado o flujo continuo).
• Experimentos de relajación . En estos experimentos, se altera el equilibrio de la mezcla de enzima, sustrato y producto, por ejemplo, mediante un aumento de la temperatura , la presión o el pH, y se controla el retorno al equilibrio. El análisis de estos experimentos requiere la consideración de la reacción totalmente reversible. Además, los experimentos de relajación son relativamente insensibles a los detalles mecanísticos y, por lo tanto, no se suelen utilizar para la identificación de mecanismos, aunque pueden utilizarse en condiciones adecuadas.

Los ensayos enzimáticos se pueden dividir en dos grupos según su método de muestreo: ensayos continuos , donde el ensayo proporciona una lectura continua de la actividad, y ensayos discontinuos , donde se toman muestras, se detiene la reacción y luego se determina la concentración de sustratos/productos.

Los ensayos continuos son los más convenientes, ya que con un solo ensayo se obtiene la velocidad de reacción sin necesidad de realizar ningún trabajo adicional. Existen muchos tipos diferentes de ensayos continuos.

En los ensayos espectrofotométricos , se sigue el curso de la reacción midiendo el cambio en la cantidad de luz que absorbe la solución de ensayo. Si esta luz está en la región visible, se puede ver un cambio en el color del ensayo, y estos se denominan ensayos colorimétricos . El ensayo MTT , un ensayo redox que utiliza un colorante de tetrazolio como sustrato, es un ejemplo de ensayo colorimétrico.

La luz ultravioleta se utiliza a menudo, ya que las coenzimas comunes NADH y NADPH absorben la luz ultravioleta en sus formas reducidas , pero no en sus formas oxidadas . Por lo tanto, una oxidorreductasa que utiliza NADH como sustrato podría analizarse siguiendo la disminución de la absorbancia ultravioleta a una longitud de onda de 340 nm a medida que consume la coenzima. ^[4]

Ensayos directos versus ensayos acoplados

Incluso cuando la reacción enzimática no produce un cambio en la absorbancia de la luz, todavía es posible utilizar un ensayo espectrofotométrico para la enzima mediante un ensayo acoplado . En este caso, el producto de una reacción se utiliza como sustrato de otra reacción fácilmente detectable. Por ejemplo, la figura 1 muestra el ensayo acoplado para la enzima hexoquinasa , que se puede analizar acoplando su producción de glucosa-6-fosfato a la producción de NADPH, utilizando la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa .

La fluorescencia se produce cuando una molécula emite luz de una longitud de onda determinada después de absorber luz de una longitud de onda diferente. Los ensayos fluorométricos utilizan una diferencia en la fluorescencia del sustrato con respecto al producto para medir la reacción enzimática. Estos ensayos son, en general, mucho más sensibles que los ensayos espectrofotométricos, pero pueden sufrir interferencias causadas por impurezas y la inestabilidad de muchos compuestos fluorescentes cuando se exponen a la luz.

Un ejemplo de estos ensayos es el uso de las coenzimas nucleótidos NADH y NADPH. En este caso, las formas reducidas son fluorescentes y las formas oxidadas no fluorescentes. Por lo tanto, las reacciones de oxidación pueden ir seguidas de una disminución de la fluorescencia y las reacciones de reducción de un aumento. ^[5] También existen sustratos sintéticos que liberan un colorante fluorescente en una reacción catalizada por enzimas, como el 4-metilumbeliferil-β-D-galactósido para el ensayo de β-galactosidasa o el 4-metilumbeliferil-butirato para el ensayo de la lipasa de Candida rugosa . ^[6]

La calorimetría es la medición del calor liberado o absorbido por las reacciones químicas. Estos ensayos son muy generales, ya que muchas reacciones implican algún cambio en el calor y con el uso de un microcalorímetro no se requiere mucha enzima o sustrato. Estos ensayos se pueden utilizar para medir reacciones que son imposibles de analizar de otra manera. ^[7]

La quimioluminiscencia es la emisión de luz por una reacción química. Algunas reacciones enzimáticas producen luz y esta se puede medir para detectar la formación de productos. Este tipo de ensayos pueden ser extremadamente sensibles, ya que la luz producida se puede capturar con una película fotográfica durante días o semanas, pero pueden ser difíciles de cuantificar, porque no se detectará toda la luz liberada por una reacción.

La detección de peroxidasa de rábano picante mediante quimioluminiscencia enzimática (ECL) es un método común para detectar anticuerpos en el Western blotting . Otro ejemplo es la enzima luciferasa , que se encuentra en las luciérnagas y produce luz de forma natural a partir de su sustrato luciferina.

La dispersión de luz estática mide el producto de la masa molar promediada en peso y la concentración de macromoléculas en solución. Dada una concentración total fija de una o más especies durante el tiempo de medición, la señal de dispersión es una medida directa de la masa molar promediada en peso de la solución, que variará a medida que se formen o se disocien los complejos. Por lo tanto, la medición cuantifica la estequiometría de los complejos, así como la cinética. Los ensayos de dispersión de luz de la cinética de las proteínas son una técnica muy general que no requiere una enzima.

La termoforesis a microescala (MST) ^[8] mide el tamaño, la carga y la entropía de hidratación de las moléculas/sustratos en equilibrio. ^[9] El movimiento termoforético de un sustrato marcado con fluorescencia cambia significativamente a medida que es modificado por una enzima. Esta actividad enzimática se puede medir con alta resolución temporal en tiempo real. ^[10] El consumo de material del método MST totalmente óptico es muy bajo, solo se necesitan 5 μl de volumen de muestra y 10 nM de concentración de enzima para medir las constantes de velocidad enzimática para la actividad y la inhibición. La MST permite a los analistas medir la modificación de dos sustratos diferentes a la vez ( multiplexación ) si ambos sustratos están marcados con diferentes fluoróforos. De este modo, se pueden realizar experimentos de competencia de sustratos.

Los ensayos discontinuos son cuando se toman muestras de una reacción enzimática a intervalos y se mide la cantidad de producción de producto o consumo de sustrato en estas muestras.

Los ensayos radiométricos miden la incorporación de radiactividad a los sustratos o su liberación desde ellos. Los isótopos radiactivos que se utilizan con más frecuencia en estos ensayos son ¹⁴ C, ³² P, ³⁵ S y ¹²⁵ I. Dado que los isótopos radiactivos pueden permitir el marcaje específico de un solo átomo de un sustrato, estos ensayos son extremadamente sensibles y específicos. Se utilizan con frecuencia en bioquímica y, a menudo, son la única forma de medir una reacción específica en extractos crudos (las mezclas complejas de enzimas que se producen cuando se lisan las células).

La radiactividad generalmente se mide en estos procedimientos utilizando un contador de centelleo .

Los ensayos cromatográficos miden la formación de productos separando la mezcla de reacción en sus componentes mediante cromatografía . Esto se hace generalmente mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), pero también se puede utilizar la técnica más sencilla de cromatografía de capa fina . Aunque este enfoque puede necesitar mucho material, su sensibilidad se puede aumentar etiquetando los sustratos/productos con una etiqueta radiactiva o fluorescente. La sensibilidad del ensayo también se ha incrementado cambiando los protocolos a instrumentos cromatográficos mejorados (por ejemplo, cromatografía líquida de ultraalta presión) que funcionan a una presión de bomba unas pocas veces mayor que los instrumentos de HPLC (consulte Cromatografía líquida de alto rendimiento#Presión de bomba ). ^[11]

Varios factores afectan el resultado del ensayo y una revisión reciente resume los distintos parámetros que deben monitorearse para mantener un ensayo en funcionamiento.

La mayoría de las enzimas no toleran concentraciones de sal extremadamente altas, ya que los iones interfieren con los enlaces iónicos débiles de las proteínas . Las enzimas típicas son activas en concentraciones de sal de 1-500 mM. Como es habitual, existen excepciones, como las algas halófilas y las bacterias halófilas .

Todas las enzimas funcionan dentro de un rango de temperatura específico para el organismo. Los aumentos de temperatura generalmente conducen a aumentos en las velocidades de reacción. Existe un límite para el aumento porque las temperaturas más altas conducen a una disminución brusca de las velocidades de reacción. Esto se debe a la desnaturalización (alteración) de la estructura de la proteína resultante de la ruptura de los enlaces iónicos y de hidrógeno débiles que estabilizan la estructura tridimensional del sitio activo de la enzima. ^[12] La temperatura "óptima" para las enzimas humanas suele estar entre 35 y 40 °C. La temperatura media para los humanos es de 37 °C. Las enzimas humanas comienzan a desnaturalizarse rápidamente a temperaturas superiores a 40 °C. Las enzimas de las arqueas termófilas que se encuentran en las fuentes termales son estables hasta 100 °C. ^[13] Sin embargo, la idea de una velocidad "óptima" de una reacción enzimática es engañosa, ya que la velocidad observada a cualquier temperatura es el producto de dos velocidades, la velocidad de reacción y la velocidad de desnaturalización. Si utilizara un ensayo que mida la actividad durante un segundo, obtendría una actividad alta a altas temperaturas; sin embargo, si utilizara un ensayo que mida la formación de producto durante una hora, obtendría una actividad baja a estas temperaturas.

La mayoría de las enzimas son sensibles al pH y tienen rangos específicos de actividad. Todas tienen un pH óptimo. El pH puede detener la actividad enzimática desnaturalizando (alterando) la forma tridimensional de la enzima al romper los enlaces iónicos y de hidrógeno . La mayoría de las enzimas funcionan entre un pH de 6 y 8; sin embargo, la pepsina en el estómago funciona mejor a un pH de 2 y la tripsina a un pH de 8.

El aumento de la concentración de sustrato aumenta la velocidad de reacción (actividad enzimática). Sin embargo, la saturación de la enzima limita la velocidad de reacción. Una enzima está saturada cuando los sitios activos de todas las moléculas están ocupados la mayor parte del tiempo. En el punto de saturación, la reacción no se acelerará, sin importar cuánto sustrato adicional se agregue. El gráfico de la velocidad de reacción se estabilizará.

Grandes cantidades de macromoléculas en una solución alterarán las velocidades y las constantes de equilibrio de las reacciones enzimáticas, a través de un efecto llamado aglomeración macromolecular . ^[14]

• Ensayo MTT
• Hidrólisis del diacetato de fluoresceína
• para -Nitrofenilfosfato

• Enzima de restricción
• Ensayo de huella de ADNasa
• Cinética enzimática

• Medios relacionados con Ensayos enzimáticos en Wikimedia Commons
• "Protocolos de ensayos - OpenWetWare". OpenWetWare . Fundación BioBricks . Consultado el 27 de julio de 2022 .