Amplicón
Fragmento de ADN o ARN obtenido mediante reacciones en cadena de amplificación (PCR, LCR)
Plantilla de secuencia de amplicón preparada para la amplificación. La secuencia objetivo que se va a amplificar está coloreada en verde.

En biología molecular , un amplicón es un fragmento de ADN o ARN que es la fuente y/o el producto de eventos de amplificación o replicación . Puede formarse artificialmente, utilizando varios métodos, incluidas las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) o las reacciones en cadena de la ligasa (LCR), o de forma natural a través de la duplicación de genes . En este contexto, la amplificación se refiere a la producción de una o más copias de un fragmento genético o secuencia diana, específicamente el amplicón. Como se refiere al producto de una reacción de amplificación, amplicón se utiliza indistintamente con términos de laboratorio comunes, como "producto de PCR".

La amplificación artificial se utiliza en investigación , [1] ciencia forense , [2] y medicina [1] para fines que incluyen la detección y cuantificación de agentes infecciosos , [3] identificación de restos humanos, [4] y extracción de genotipos del cabello humano. [2]

La duplicación natural de genes desempeña un papel importante en la evolución . También está implicada en varias formas de cáncer humano, incluido el linfoma primario de células B del mediastino y el linfoma de Hodgkin . [5] En este contexto, el término amplicón puede referirse tanto a una sección de ADN cromosómico que se ha extirpado, amplificado y reinsertado en otra parte del genoma , como a un fragmento de ADN extracromosómico conocido como doble minuto , cada uno de los cuales puede estar compuesto por uno o más genes . La amplificación de los genes codificados por estos amplicones generalmente aumenta la transcripción de esos genes y, en última instancia, el volumen de proteínas asociadas . [6]

Estructura

Los amplicones en general son secuencias genéticas de repetición directa (cabeza a cola) o de repetición invertida (cabeza a cabeza o cola a cola) y pueden tener una estructura lineal o circular. [7] Los amplicones circulares consisten en duplicaciones invertidas imperfectas recocidas en un círculo [8] y se cree que surgen de amplicones lineales precursores. [9]

Durante la amplificación artificial, la longitud del amplicón está determinada por los objetivos experimentales. [10]

Tecnología

El análisis de amplicones ha sido posible gracias al desarrollo de métodos de amplificación como la PCR , y a tecnologías cada vez más económicas y de mayor rendimiento para la secuenciación de ADN o la secuenciación de próxima generación , como la secuenciación de semiconductores iónicos , conocida popularmente como la marca del desarrollador, Ion Torrent. [11]

Las tecnologías de secuenciación de ADN, como la secuenciación de próxima generación, han hecho posible el estudio de amplicones en la biología y la genética del genoma , incluida la investigación genética del cáncer , [12] la investigación filogenética y la genética humana . [13] Por ejemplo, utilizando el gen 16S rRNA , que forma parte de cada genoma bacteriano y arqueológico y está altamente conservado, las bacterias pueden clasificarse taxonómicamente mediante la comparación de la secuencia del amplicón con secuencias conocidas. Esto funciona de manera similar en el dominio fúngico con el gen 18S rRNA, así como con la región no codificante ITS1 . [14]

Independientemente del enfoque utilizado para amplificar los amplicones, se debe utilizar alguna técnica para cuantificar el producto amplificado. [15] Generalmente, estas técnicas incorporan un paso de captura y un paso de detección, aunque la forma en que se incorporan estos pasos depende del ensayo individual .

Los ejemplos incluyen el ensayo de monitorización del VIH-1 de Amplicor ( RT-PCR ), que tiene la capacidad de reconocer el VIH en el plasma ; el QT del VIH-1 ( NASBA ), que se utiliza para medir la carga viral plasmática amplificando un segmento del ARN del VIH; y la amplificación mediada por transcripción , que emplea un ensayo de protección de hibridación para distinguir las infecciones por Chlamydia trachomatis . [15] En cada enfoque están involucrados varios pasos de detección y captura para evaluar el producto de amplificación, o amplicón. Con la secuenciación de amplicones, se concatenan y secuencian el gran número de amplicones diferentes resultantes de la amplificación de una muestra habitual. Después de que se realiza la clasificación de control de calidad mediante diferentes métodos, los recuentos de taxones idénticos representan su abundancia relativa en la muestra.

Aplicaciones

La PCR se puede utilizar para determinar el sexo a partir de una muestra de ADN humano. [16] Los loci de inserción del elemento Alu se seleccionan, se amplifican y se evalúan en términos de tamaño del fragmento. El ensayo de sexo utiliza AluSTXa para el cromosoma X , AluSTYa para el cromosoma Y , o tanto AluSTXa como AluSTYa, para reducir la posibilidad de error a una cantidad insignificante. El cromosoma insertado produce un fragmento grande cuando se amplifica la región homóloga . Los machos se distinguen por tener dos amplicones de ADN presentes, mientras que las hembras solo tienen un único amplicón. El kit adaptado para llevar a cabo el método incluye un par de cebadores para amplificar el locus y, opcionalmente, reactivos de reacción en cadena de la polimerasa. [17]

La LCR se puede utilizar para diagnosticar la tuberculosis . [18] La secuencia que contiene el antígeno proteico B es el objetivo de cuatro cebadores oligonucleótidos : dos para la cadena sentido y dos para la cadena antisentido . Los cebadores se unen adyacentes entre sí, formando un segmento de ADN bicatenario que, una vez separado, puede servir como objetivo para futuras rondas de replicación. En este caso, el producto se puede detectar a través del inmunoensayo enzimático de micropartículas (MEIA) .

Véase también

Referencias

  1. ^ ab Meyers, Robert A., ed. (1995). Biología molecular y biotecnología: una referencia de escritorio completa. Nueva York, NY: VCH Publishers. págs. 53, 585. ISBN 1-56081-925-1.
  2. ^ ab Walsh, PS; Metzger, DA; Higuchi, R (1991). "Chelex 100 como medio para la extracción simple de ADN para la tipificación basada en PCR a partir de material forense". BioTechniques . 10 (4): 506–13. PMID  1867860.
  3. ^ Departamento de Asuntos del Consumidor (17 de agosto de 2010). "Prueba de detección del VIH-1 Amplicor de Roche". FDA . Consultado el 16 de octubre de 2012 .
  4. ^ Gill, Peter; Ivanov, Pavel L.; Kimpton, Colin; Piercy, Romelle; Benson, Nicola; Tully, Gillian; Evett, Ian; Hagelberg, Erika; Sullivan, Kevin (1994). "Identificación de los restos de la familia Romanov mediante análisis de ADN". Nature Genetics . 6 (2): 130–5. doi :10.1038/ng0294-130. PMID  8162066. S2CID  33557869.
  5. ^ Rui, Lixin; Emre, Carolina del Norte Tolga; Kruhlak, Michael J.; Chung, Hye-Jung; Steidl, cristiano; Flojo, Graham; Wright, George W.; Lenz, Georg; et al. (2010). "Modulación epigenética cooperativa por genes amplicones del cáncer". Célula cancerosa . 18 (6): 590–605. doi :10.1016/j.ccr.2010.11.013. PMC 3049192 . PMID  21156283. 
  6. ^ Bignell, GR; Santarius, T.; Pole, JCM; Butler, AP; Perry, J.; Pleasance, E.; Greenman, C.; Menzies, A.; et al. (2007). "Arquitecturas de reordenamiento genómico somático en amplicones de cáncer humano con resolución a nivel de secuencia". Genome Research . 17 (9): 1296–303. doi :10.1101/gr.6522707. PMC 1950898 . PMID  17675364. 
  7. ^ Cohn, Waldo E.; Moldave, Kivie, eds. (1996). Progreso en la investigación de ácidos nucleicos y biología molecular . Academic Press. págs. 280–287. ISBN 978-0-12-540054-1.
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  9. ^ Grodin, K; Küding, C; Roy, G; Ouellette, M (1998). "Amplicones lineales como precursores de círculos amplificados en Leishmania tarentolae resistente a metotrexato". Nucleic Acids Res . 26 (14): 3372–3378. doi :10.1093/nar/26.14.3372 (inactivo el 1 de noviembre de 2024). PMC 147699 . PMID  9649621. {{cite journal}}: CS1 maint: DOI inactivo a partir de noviembre de 2024 ( enlace )
  10. ^ Pautas de diseño de cebadores para PCR. Premier Biosoft: Aceleración de la investigación en ciencias biológicas. Recuperado de: http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html
  11. ^ "Página web oficial de Ion Torrent". Archivado desde el original el 6 de noviembre de 2012. Consultado el 16 de octubre de 2018 .
  12. ^ Sitio web oficial del Consorcio Internacional del Genoma del Cáncer
  13. ^ Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano
  14. ^ Usyk, Mykhaylo; Zolnik, Christine P.; Patel, Hitesh; Levi, Michael H.; Burk, Robert D. (13 de diciembre de 2017). Mitchell, Aaron P. (ed.). "Nuevos cebadores fúngicos ITS1 para la caracterización del micobioma". mSphere . 2 (6): e00488–17, /msphere/2/6/mSphere0488–17.atom. doi :10.1128/mSphere.00488-17. ISSN  2379-5042. PMC 5729218 . PMID  29242834. 
  15. ^ ab Stanley, J. (2002). Fundamentos de inmunología y serología, por Jacqueline Stanley. Albany, NY: Delmar.
  16. ^ Mannucci, Armando; Sullivan, Kevin M.; Ivanov, Pavel L.; Gill, Peter (1994). "Aplicación forense de una prueba rápida y cuantitativa de ADN sexual mediante la amplificación del gen homólogo XY amelogenina". Revista Internacional de Medicina Legal . 106 (4): 190–3. doi :10.1007/BF01371335. PMID  8038111. S2CID  3969808.
  17. ^ Hedges, Dale J; Walker, Jerilyn A; Callinan, Pauline A; Shewale, Jaiprakash G; Sinha, Sudhir K; Batzer, Mark A (2003). "Ensayo basado en elementos móviles para la determinación del género humano". Analytical Biochemistry . 312 (1): 77–9. doi :10.1016/S0003-2697(02)00430-X. PMID  12479838. S2CID  42177642.
  18. ^ O'Connor, TM (1 de noviembre de 2000). "La reacción en cadena de la ligasa como herramienta de detección primaria de tuberculosis con cultivo positivo". Thorax . 55 (11): 955–957. doi :10.1136/thorax.55.11.955. PMC 1745641 . PMID  11050266. 

Lectura adicional

  • Leckie, Gregor W.; Lee, Helen H. (1995). "Pruebas de enfermedades infecciosas mediante la reacción en cadena de la ligasa". En Meyers, Robert A. (ed.). Biología molecular y biotecnología: una referencia de escritorio completa . Nueva York: Wiley. págs. 463–6. ISBN 978-0-471-18634-2.

"¿Qué es un amplicón? Vea ejemplos de las diferentes aplicaciones". Vídeo de YouTube . 13 de noviembre de 2013.

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