Amplificación rápida de extremos de ADNc

La amplificación rápida de extremos de ADNc ( RACE ) es una técnica utilizada en biología molecular para obtener la secuencia completa de un transcrito de ARN que se encuentra dentro de una célula. La RACE da como resultado la producción de una copia de ADNc de la secuencia de ARN de interés, producida a través de transcripción inversa , seguida de la amplificación por PCR de las copias de ADNc (ver RT-PCR ). Las copias de ADNc amplificadas se secuencian y, si son lo suficientemente largas, deberían corresponder a una región genómica única. La RACE suele ir seguida de la clonación antes de la secuenciación de lo que originalmente eran moléculas de ARN individuales. Una alternativa de mayor rendimiento que es útil para la identificación de nuevas estructuras de transcripción es secuenciar los productos RACE mediante tecnologías de secuenciación de próxima generación.

La RACE puede proporcionar la secuencia de un transcrito de ARN desde una pequeña secuencia conocida dentro del transcrito hasta el extremo 5' (5' RACE-PCR) o el extremo 3' (3' RACE-PCR) del ARN. Esta técnica a veces se denomina PCR unilateral o PCR anclada .

El primer paso en RACE es utilizar la transcripción inversa para producir una copia de ADNc de una región del transcrito de ARN. En este proceso, se copia una porción final desconocida de un transcrito utilizando una secuencia conocida del centro del transcrito. La región copiada está limitada por la secuencia conocida, ya sea en el extremo 5' o 3'.

Los protocolos para las RACES 5' o 3' difieren ligeramente. La PCR-RACE 5' comienza utilizando el ARNm como plantilla para una primera ronda de reacción de síntesis de ADNc (o transcripción inversa ) utilizando un cebador oligonucleótido antisentido (inverso) que reconoce una secuencia conocida en el medio del gen de interés; el cebador se llama cebador específico del gen (GSP). El cebador se une al ARNm y la enzima transcriptasa inversa agrega pares de bases al extremo 3' del cebador para generar un producto de ADNc monocatenario específico; este es el complemento inverso del ARNm. Después de la síntesis de ADNc, se utiliza la enzima desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) para agregar una cadena de nucleótidos idénticos , conocida como cola homopolimérica, al extremo 3' del ADNc. (Existen otras formas de agregar la secuencia 3'-terminal para la primera cadena de la síntesis de ADNc de novo que son mucho más eficientes que la cola homopolimérica, pero el sentido del método sigue siendo el mismo). Luego se lleva a cabo la PCR , que utiliza un segundo cebador específico del gen antisentido (GSP2) que se une a la secuencia conocida, y un cebador universal sentido (directo) (UP) que se une a la cola homopolimérica agregada a los extremos 3' de los ADNc para amplificar un producto de ADNc del extremo 5'.

La PCR 3' RACE utiliza la cola poliA natural que existe en el extremo 3' de todos los ARNm eucariotas para la preparación durante la transcripción inversa, por lo que este método no requiere la adición de nucleótidos por TdT. Los ADNc se generan utilizando un cebador adaptador Oligo-dT (un cebador con una secuencia corta de nucleótidos de desoxi-timina) que complementa el tramo poliA y agrega una secuencia adaptadora especial al extremo 5' de cada ADNc. Luego se utiliza la PCR para amplificar el ADNc 3' de una región conocida utilizando un GSP sentido y un cebador antisentido complementario a la secuencia adaptadora.

Las moléculas de ADNc generadas por RACE se pueden secuenciar utilizando tecnologías de secuenciación de alto rendimiento (también llamadas RACE-seq). La caracterización de fragmentos RACE mediante secuenciación de alto rendimiento es sumamente eficiente en términos de tiempo, más sensible, menos costosa y técnicamente factible en comparación con la caracterización tradicional de fragmentos RACE con clonación molecular seguida de secuenciación Sanger de unos pocos clones.

La RACE se puede utilizar para amplificar partes desconocidas de 5' (5'-RACE) o 3' (3'-RACE) de moléculas de ARN, en las que se conoce parte de la secuencia de ARN y se selecciona mediante un cebador específico del gen. En combinación con la secuenciación de alto rendimiento para la caracterización de estos productos RACE amplificados, es posible aplicar el enfoque para caracterizar cualquier tipo de moléculas de ARN codificantes o no codificantes.

La idea de combinar RACE con secuenciación de alto rendimiento se introdujo por primera vez en 2009 como Deep-RACE para realizar el mapeo de los sitios de inicio de la transcripción (TSS) de 17 genes en una sola línea celular. ^[1] Por ejemplo, en un estudio de 2014 para mapear con precisión los sitios de escisión del ARN objetivo dirigido por ARNi sintéticos , el enfoque se denominó primero RACE-seq. ^[2] Además, la metodología se utilizó para caracterizar partes desconocidas de longitud completa de nuevas transcripciones y transcripciones de fusión en el cáncer colorrectal . ^[3] En otro estudio que apuntaba a caracterizar estructuras de transcripción desconocidas de lncRNA , se utilizó RACE en combinación con secuenciación semilarga 454. ^[4]

• "Amplificación rápida de los extremos 5' del ADNc", en Molecular Cloning: A Laboratory Manual (eds. Sambrook, J. y Russell, DW), capítulo 8, protocolo 9, 8.54-8.60 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, EE. UU., 2001)
• Principios de manipulación genética y genómica , SB Primrose y RM Twyman, Blackwell Publishing, 2006 (7.ª ed.), páginas 111–12.

• Artículo de blog sobre RACE-seq