Prueba de cromoterapia

Ensayo biológico para evaluar el potencial genotóxico de compuestos químicos

Para la farmacología y la genética , el Umu Chromotest , desarrollado y publicado por primera vez por Oda et al., ^[1] es un ensayo biológico ( bioensayo ) para evaluar el potencial genotóxico de los compuestos químicos . Se basa en la capacidad de los agentes que dañan el ADN para inducir la expresión del operón umu . En conexión con los genes inducibles por daño (din) recA, lexA y umuD, el gen umuC está esencialmente involucrado en la mutagénesis bacteriana a través de la respuesta SOS .

Esta prueba utiliza una fusión de operones que coloca el operón lac (responsable de producir β-galactosidasa, una proteína que degrada la lactosa) bajo el control de las proteínas relacionadas con umu. Es posible realizar una prueba colorimétrica sencilla añadiendo un análogo de la lactosa que se degrada por la β-galactosidasa, lo que produce un compuesto coloreado que se puede medir cuantitativamente mediante espectrofotometría . El grado de desarrollo del color es una medida indirecta de la β-galactosidasa producida, que a su vez está directamente relacionada con la cantidad de daño al ADN.

El Umu Chromotest tiene la ventaja adicional de tener su procedimiento codificado bajo la norma ISO 13829 "Calidad del agua - Determinación de la genotoxicidad del agua y las aguas residuales utilizando el umu-test". Aunque la genotoxicidad no se puede vincular directamente con el desarrollo del cáncer en humanos, se ha demostrado que existe una fuerte correlación entre los efectos genotóxicos en las bacterias y sus propiedades mutagénicas e iniciadoras de tumores en los mamíferos. ^[2]^[3]

Teoría

Las bacterias Salmonella typhimurium TA 1535 [pSK 1002] se exponen a compuestos de prueba potencialmente genotóxicos en una microplaca de 96 pocillos. Si se producen lesiones genotóxicas en el genoma bacteriano, se induce el gen umuC como parte de la respuesta SOS general . El plásmido pSK1002 contiene el gen umuC fusionado al gen reportero lacZ, de forma muy similar a la fusión en el SOS Chromotest. La inducción del gen umuC es, por tanto, una medida del potencial genotóxico de la muestra. Dado que el gen umuC está fusionado con el gen lacZ para la β-galactosidasa, la inducción del gen umuC se puede evaluar fácilmente mediante la determinación de la actividad de la β-galactosidasa, medida por la conversión de un sustrato ONPG incoloro (o-nitrofenil-β-D-galactopiranósido) al producto amarillo o-nitrofenilo por la β-galactosidasa codificada por lacZ.^[4]

Como la respuesta SOS es una respuesta general a las lesiones genotóxicas, una cepa de S. typhimurium con la construcción del gen reportero adecuado es suficiente para identificar todas las clases de genotoxinas bacterianas. Al igual que con otros ensayos de genotoxicidad y mutagenicidad bacteriana, los compuestos que requieren activación metabólica para su actividad se pueden investigar con la adición de extracto de hígado de rata microsomal S9.

Procedimiento

Las bacterias S. typhimurium en la fase exponencial de crecimiento se exponen durante 2 horas a concentraciones decrecientes de la muestra de prueba por triplicado, incluidos los controles positivos y negativos, así como los blancos. Después de 2 horas, los cultivos expuestos se diluyen en medios de crecimiento nuevos y se dejan crecer durante otras 2 horas. La inducción del gen umuC y del gen reportero lacZ fusionado y la posterior expresión de β-galactosidasa se evalúan después de la lisis de las bacterias. El ONPG incoloro se convierte en el producto amarillo o-nitrofenilo en presencia de la β-galactosidasa inducida. La intensidad del color se correlaciona con la cantidad de proteína inducida y, por lo tanto, con la potencia genotóxica de la muestra de prueba.

Se utilizan métricas cuantitativas, donde se lee la absorbancia de la placa a OD600 antes y después de la fase de crecimiento, así como la OD420 después de la incubación con ONPG. Esto permite calcular el índice de inducción (IR), así como el factor de crecimiento para determinar si también hay citotoxicidad e invalidar los valores de IR. ^[5]

Ventajas

La alta correlación entre el Umu Chromotest y la prueba Ames tradicional para mutagenicidad lo respalda como una alternativa razonable para las pruebas iniciales de los miles de nuevos productos químicos farmacéuticos, agrícolas e industriales sintetizados cada año. La mayoría de los grandes fabricantes de productos químicos tienen la capacidad de analizar 100 o más productos químicos sintéticos por año con la prueba Ames tradicional, que requiere el uso de varias cepas de Salmonella. La prueba umu, que utiliza solo una cepa de Salmonella, podría potencialmente analizar una gama más amplia de nuevos productos químicos con los mismos recursos. La reducción en el gasto de material y mano de obra, así como su robustez, también lo posicionan como una prueba adecuada para muestras ambientales complejas. ^[6]

Referencias

^ Yasunaga, Kiyonari, Oikawa, Abe, Yoshikawa (1985). "Evaluación del nuevo sistema (umu-test) para la detección de mutágenos y carcinógenos ambientales". Mutation Research . 147 (5): 219–229. doi :10.1016/0165-1161(85)90062-7. PMID 3900709.{{cite journal}}: CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )
^ Mohn (1981). "Sistemas bacterianos para pruebas de carcinogenicidad". Investigación sobre mutaciones . 87 (2): 191–210. doi :10.1016/0165-1110(81)90032-4. PMID 6799816.
^ Purchase (1982). "Una evaluación de las pruebas predictivas de carcinogenicidad". Mutation Research . 99 (1): 53–71. doi :10.1016/0165-1110(82)90031-8. PMID 6811893.
^ Reifferscheid, Heil, Oda, Zahn (1991). "Una versión en microplaca del test SOS/umu para la detección rápida de genotoxinas y potenciales genotóxicos en muestras ambientales". Mutation Research . 253 (3): 215–222. doi :10.1016/0165-1161(91)90134-T. PMID 1720196.{{cite journal}}: CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )
^ ISO 13829 "Calidad del agua: Determinación de la genotoxicidad del agua y de las aguas residuales mediante el ensayo umu".
^ Yasunaga, Kiyonari, Oikawa, Abe, Yoshikawa (2004). "Evaluación de la prueba Salmonella umu con 83 productos químicos NTP". Environ Mol Mutagen . 44 (4): 329–45. doi :10.1002/em.20053. PMID 15476194. S2CID 7419454.{{cite journal}}: CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )

[1] Yasunaga, Kiyonari, Oikawa, Abe, Yoshikawa (1985). "Evaluación del nuevo sistema (umu-test) para la detección de mutágenos y carcinógenos ambientales". Mutation Research . 147 (5): 219–229. doi :10.1016/0165-1161(85)90062-7. PMID 3900709.{{cite journal}}: CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )

[2] Mohn (1981). "Sistemas bacterianos para pruebas de carcinogenicidad". Investigación sobre mutaciones . 87 (2): 191–210. doi :10.1016/0165-1110(81)90032-4. PMID 6799816.

[3] Purchase (1982). "Una evaluación de las pruebas predictivas de carcinogenicidad". Mutation Research . 99 (1): 53–71. doi :10.1016/0165-1110(82)90031-8. PMID 6811893.

[4] Reifferscheid, Heil, Oda, Zahn (1991). "Una versión en microplaca del test SOS/umu para la detección rápida de genotoxinas y potenciales genotóxicos en muestras ambientales". Mutation Research . 253 (3): 215–222. doi :10.1016/0165-1161(91)90134-T. PMID 1720196.{{cite journal}}: CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )

[5] ISO 13829 "Calidad del agua: Determinación de la genotoxicidad del agua y de las aguas residuales mediante el ensayo umu".

[6] Yasunaga, Kiyonari, Oikawa, Abe, Yoshikawa (2004). "Evaluación de la prueba Salmonella umu con 83 productos químicos NTP". Environ Mol Mutagen . 44 (4): 329–45. doi :10.1002/em.20053. PMID 15476194. S2CID 7419454.{{cite journal}}: CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )